从人初始T细胞和记忆T细胞诱导生成调节性T细胞

本实验的总体目标是从原代T细胞生成人调节性T细胞。首先，从人血液样本中分离外周血单个核细胞。然后从PBMC混合物中纯化CD4阳性T细胞并进行培养。

六天后，使用流式细胞仪将细胞分选为初始记忆效应细胞和诱导性调节性T细胞亚群，并进行抑制功能检测。利用这些细胞可证明，该方法能够生成具有抑制活性的人源调节性T细胞。与使用口腔细胞的方法相比，本技术的主要优势在于，我们的人源方法具有更高的生理学和临床相关性，并可在单个供体中实现调节性T细胞与其他细胞群体的直接比较。

消除个体内部差异。该方法可回答调节性细胞领域的关键科学问题，例如：调控传统T细胞与调节性细胞之间转化的调控事件是什么？调节性细胞所特有的信号转导和转录事件又是什么？由于调节性T细胞在免疫稳态中发挥至关重要的作用，该技术的应用前景广泛，涵盖自身免疫性疾病、炎症性疾病以及癌症的治疗。

通常情况下，由于所使用的技术种类繁多，以及某些步骤中细胞培养条件的最佳窗口较窄，初学者在掌握该技术时会面临困难。尽管该方法可用于研究调节性T细胞的发育过程，也可用于监测T细胞谱系分化的可塑性，或分析T细胞微环境在诱导或抑制该发育过程中的能力。展示该实验操作的人员包括Andrea McCool以及研究生Marie Catherine Ranier Gavin Ellis和Catalina Vale Ortega。

从40至60升B型血沉棕黄层开始本操作，以分离人外周血单个核细胞。为稀释血沉棕黄层，将其转移至一个已灭菌的500毫升玻璃瓶中，瓶内预先加入150毫升无菌PBS。然后继续添加无菌PBS，使最终体积达到250毫升。接下来，将10个50毫升锥形管分别装入20毫升淋巴细胞分离液。

然后将25毫升稀释后的血沉棕黄层轻轻覆盖在淋巴细胞分离液上，注意不要扰动淋巴细胞分离液。将离心管在室温下以500 × g离心30分钟。务必关闭离心机的刹车功能，以免扰动淋巴细胞层。

离心后，外周血单个核细胞（PBMC）将位于淋巴细胞分离液与血浆层之间的界面处，以便收集。用移液管吸除血浆层，直至剩余约1毫升液体覆盖含有PBMC的白膜层。使用10毫升移液管将PBMC转移至新的50毫升离心管中。

用 PBS 洗涤细胞两次后，将细胞重悬于 50 毫升冷 RPMI 培养基中，并使用血细胞计数板进行计数。在确定浓度后，典型的回收量为 8 × 10⁸ 至 1 × 10⁹ 个外周血单个核细胞（PBMCS）。将 PBMCS 重悬于含有 2% FBS 和 1 毫摩尔 EDTA 的 PBS 中，调整终浓度为 5 × 10⁷ 个细胞/毫升，并将细胞转移至一个新的 14 毫升聚丙烯圆底管中。

接下来，将使用EAs试剂盒对目标细胞进行阴性筛选。试剂盒中提供的T细胞富集混合液含有四聚体抗体复合物，该复合物一侧为抗右旋糖酐抗体，另一侧为针对非目标细胞表面抗原的抗体。当将该混合液加入细胞中后，四聚体抗体复合物会连接非目标细胞。

随后加入表面包被葡聚糖的磁性颗粒，这些颗粒会结合到四聚体抗体复合物上，从而将不需要的细胞与磁性颗粒连接。接着施加磁场，以分离不需要的细胞和目标细胞，收集目标细胞以分离CD4阳性T细胞。用移液器将1×10⁸至4.25×10⁸个外周血单个核细胞（pbmc）转移至15毫升圆锥形离心管中。然后每毫升pbmc加入50 µL人CD4阳性T细胞富集抗体混合液。

混合后在室温下孵育10分钟。混合磁性颗粒，使其在溶液中均匀分布。每毫升PBMC加入100微升磁性颗粒。

轻轻吹打混匀两到三次，然后在室温下孵育10分钟。加入含有FBS和EDTA的PBS，通过轻轻吹打混匀两到三次，将体积补至每管10毫升。接下来，将未加盖的试管放入磁力架中，保持试管仍在磁力架内，静置5分钟。

将液体倒入新的50毫升离心管中，以分离目标细胞，提高回收率。通过向管中加入额外的P-B-S-F-B-S-E-D-T-A，混匀后再次将样本置于磁力架中，重复此过程。细胞分离完成后，进行计数，然后在室温下以500 × g离心5分钟。

用极化培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至每毫升2×10⁶个细胞。随后按照视频下一节所述方法进行培养，以诱导调节性T细胞。将预先包被抗CD3抗体的6孔组织培养板在37°C预热。

待培养板升温后，吸除各孔中的 PBS。然后向每孔加入四毫升 CD4 阳性富集的细胞悬液。用 PBS 填充任何空孔，以减少培养过程中培养基的蒸发，37°C 培养三天。

以500 × g离心培养板5分钟。然后在不扰动培养板底部细胞的前提下，吸去一半培养基，并替换为新鲜培养基，继续孵育2至3天。此时，细胞可根据下一节所述方法进行荧光激活细胞分选，或作为后续所述抑制实验中的靶细胞使用。在孵育2至3天后，制备细胞及相应的补偿对照，用于荧光激活细胞分析。为分离诱导型调节性初始T细胞和记忆T细胞，按照随附文件所述方法，使用抗CD25 PE、抗CD45RA PE-Cy5和抗CD127 APC对拟分选细胞进行染色。

同时务必为流式分析添加相应抗体至适当的补偿对照中。染色后，将细胞重悬于洗涤缓冲液中，浓度为每毫升含一千万个细胞，然后每毫升细胞悬液中加入1.5微升DNase II，并通过40微米尼龙细胞滤网过滤细胞。将细胞转移至5毫升圆底聚丙烯管中，每管体积不超过3.5毫升。

将补偿对照细胞重悬于300微升洗涤缓冲液中。在流式细胞仪上设置补偿，以最小化PE、APC和PE-Cy7滤光片之间的交叉检测。设定分选门，将调节性T细胞（Tregs）、初始T细胞和记忆T细胞分选至含有1毫升新生小牛血清的5毫升圆底聚苯乙烯管中，以评估分选过程中产生的调节性T细胞是否能够抑制T细胞的增殖。

此处进行抑制实验。未分选的 CD4 阳性富集细胞将作为靶细胞，不应含有 CD25 阳性的诱导性调节性 T 细胞。

首先，使用细胞示踪试剂盒，按照制造商的说明，用CFSE标记靶细胞，每毫升细胞使用一微升五摩尔的储存液，而不是两微升。接下来，在微量离心管中通过快速离心，将调节性T细胞（Treg）抑制检测磁珠以与细胞总数相等的数量沉淀下来。用RPMI洗涤磁珠一次，离心后重新沉淀。

吸去RPMI培养基，将细胞重悬于适量浓度的抑制试验培养基中，每孔8 µL，加入至96孔圆底组织培养板中。每孔加入8 µL CFSE染色的靶细胞。将磁珠和极化分选后的细胞加入，最终体积为新鲜抑制试验培养基。

加入200微升培养基。所有条件均设三个复孔。制备对照组时，在92微升抑制性检测体系中加入100微升CFSE标记的细胞、8微升检测微球，以及1×10⁵个新鲜未标记细胞。

向头两个对照孔中每孔加入培养基。然后在92微升抑制试验培养基中，向孔中加入100微升CFSE标记的细胞和1×10⁵个新鲜未标记的细胞。向接下来的两个对照孔中每孔加入培养基。

用铝箔覆盖培养板，置于培养箱中避光孵育五天。用移液器收集每个孔中的细胞，放入5毫升圆底聚苯乙烯管中。在4摄氏度条件下，以500 × g离心5分钟。

吸弃培养基，加入300微升预冷的FACS洗涤缓冲液重悬细胞。为监测诱导型调节性T细胞分化过程，将纯化的人源初级CD4阳性CD25阴性T细胞在iTreg培养基中培养，并于第0、1、3和5天取样，通过流式细胞术检测CD45RA、FoxP3、CTLA-4和CD25标记物的表达情况。如这些伪彩色点图所示，在为期五天的培养过程中，细胞在TGF-β和IL-2存在下，经CD3交联刺激后体外增殖并发生分化，最终形成CD45RA阴性、FOXP3高表达、CTLA-4高表达及CD25高表达的表型。该结果表明，由常规T细胞前体成功诱导生成了调节性T细胞（Treg）。为评估所生成Treg细胞对T细胞增殖的抑制能力，

CFSE标记的细胞与Treg抑制检测磁珠共同培养，同时加入分选后的初始记忆性T细胞和诱导型Treg细胞，如本直方图所示。这些细胞表型为CD25高表达、CD45RA阴性、CD127阴性。在培养五天后，仅诱导型调节性T细胞这一亚群获得了抑制功能。

这表明在此系统中产生的细胞在表型和功能上均为抑制性调节性T细胞，而非活化的常规T细胞（后者可能短暂表达FOXP3和CD25，但不具有免疫抑制功能）。诱导产生的调节性T细胞可完全消除CD4阳性T细胞的增殖。数值表示经历分裂的CFSE标记细胞的百分比，用于确认该现象在纯化的T细胞亚群中同样成立。

将人原代初始T细胞和记忆T细胞用CFSE染色后进行培养。在Treg培养基中培养五天后，对细胞进行表型分析，并检测细胞增殖速率。此处显示的是，经过五天培养后，从初始T细胞群和记忆T细胞群中分别诱导生成了调节性T细胞（Treg）。

在标准的IT调节培养基中，采用CFSE染色初始细胞显示，无论初始T细胞还是记忆T细胞，均需经过多轮细胞分裂后才能分化为调节性T细胞。通过比较CFSE染色图谱，可鉴定出在五天培养期间增殖最活跃的细胞即为诱导产生的调节性T细胞。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从单个供体获得的初始T细胞、记忆T细胞或全部T细胞群体中诱导生成诱导性Treg细胞的方法。

在整个操作过程中必须保持无菌技术，并避免CFSE暴露于光线下。在此步骤之后，可进行其他方法，如功能检测，以回答其他问题，例如调节性T细胞与常规T细胞在细胞分裂速率、特异性细胞因子合成以及离子通道使用方面存在哪些差异。该技术为免疫学领域的研究人员探索人类患者中的自身免疫性疾病及其他与Treg相关的病理状况奠定了基础。

请务必注意，处理人类血液具有极高危险性，在进行该操作时，必须采取充分的血液检测和妥善的废弃物处理等预防措施。