Name: 从初级人类的幼稚和记忆T细胞的诱导调节性T细胞的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学习从人外周血单个核细胞中分离CD4阳性T细胞并诱导生成调节性T细胞的方法。该技术可在单一供体内比较Treg与其他T细胞亚群，具有更高的生理和临床相关性。

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作者感谢Jennifer Strange和Greg Bauman在流式细胞术分析与分选方面的协助。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为2P20 RR020171（来自NCRR），以及肯塔基大学为F.M.提供的启动资金；G.I.E.感谢总统研究生奖学金和肯塔基机遇奖学金的支持。

1. 从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）
<ol>
 <li>从医院或附近的血库获取一份血沉棕黄层。我们的血库通常为每位正常献血者提供约 40–60 mL 的血沉棕黄层。</li>
 <li>将血液倒入含有无菌 PBS 的已灭菌 500 mL 玻璃瓶中，以稀释血沉棕黄层。PBS 与血沉棕黄层的最终总体积应为 250 mL。</li>
 <li>向十个 50 mL 圆锥形离心管中各加入 20 mL Lymphoprep 溶液。</li>
 <li>小心地将 25 mL 稀释后的血沉棕黄层缓慢铺加在 Lymphoprep 溶液上方，注意不要扰动 Lymphoprep 溶液层。</li>
 <li>在室温下以 500 × g 离心 30 分钟。务必关闭离心机的刹车功能，以免扰动淋巴细胞层。</li>
 <li>用移液器收集位于 Lymphoprep 与血浆-培养基层之间的界面处的外周血单个核细胞（PBMCs）。吸除上层血浆-培养基，直至剩余约 1 mL 覆盖含有 PBMCs 的血沉棕黄层。使用 10 mL 移液器将 PBMCs 转移至新的 50 mL 离心管中。</li>
 <li>用 PBS 洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于 50 mL 冷 RPMI 培养基中，用于血细胞计数板计数。通常可获得 8 × 108 – 1 × 109 个 PBMCs。</li>
</ol>
该操作可根据较小体积的血液进行相应缩小。全血样本以PBS按1:1比例稀释。
2. 使用 EasySep 富集试剂盒（Stem Cell Technologies）从外周血单个核细胞中磁性阴选总 CD4+ T 细胞、CD4+ CD45RA+ 初始 T 细胞或 CD4+ CD45RO+ 记忆 T 细胞
适用于 1 × 108 至 4.25 × 108 个PBMC的实验步骤。
<ol>
 <li>用含 2% FBS 和 1 mM EDTA 的 PBS 重悬 PBMC，终浓度为 5 × 107 个/mL。将细胞转移至新的 14 mL 聚丙烯圆底管中。
 <ol class="lalpha">
 <li>通过阴性选择法分离总人源 CD4+ T 细胞：每毫升 PBMC 中加入 50 μL 人 CD4+ T 细胞富集抗体混合物，混匀后室温孵育 10 分钟。</li>
 <li>通过阴性选择法分离人源初始 T 细胞：每毫升 PBMC 悬液中加入 50 μL 抗-CD45RO 抗体，混匀后室温孵育 15 分钟。随后加入试剂盒提供的富集混合液（每毫升 PBMC 50 μL），混匀后室温孵育 10 分钟。</li>
 <li>通过阴性选择法分离人源记忆 T 细胞：每毫升 PBMC 中加入 50 μL 人记忆 CD4+ T 细胞富集抗体混合物，混匀后室温孵育 10 分钟。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>充分混匀磁性颗粒，使其在溶液中均匀分布。切勿对初始 T 细胞试剂盒中的纳米颗粒进行涡旋震荡。</li>
 <li>加入磁性颗粒（总 CD4+ T 细胞和初始 T 细胞分离时为每毫升 PBMC 加 100 μL，记忆 T 细胞分离时为每毫升 PBMC 加 50 μL）。轻轻吹打混匀 2–3 次，室温孵育：初始 T 细胞分离孵育 10 分钟，记忆 T 细胞或总 CD4+ T 细胞分离孵育 5 分钟。</li>
 <li>加入含 2% FBS 和 1 mM EDTA 的 PBS，将每管体积补至 10 mL。轻轻吹打混匀 2–3 次，然后将未加盖的管子放入银色 EasySep 磁铁中，分别放置 5 分钟（总 CD4+ T 细胞）、10 分钟（初始 T 细胞）或 2.5 分钟（记忆 T 细胞）。</li>
 <li>保持试管仍在 EasySep 磁铁中，将上清液倒入新的 50 mL 管中，以分离目标细胞。</li>
 <li>重复步骤 2.5 和 2.6 以提高回收率。</li>
</ol>
3. 诱导调节性T细胞的细胞培养条件
<ol>
 <li>在步骤1和步骤2的前一天，通过将抗CD3抗体（OKT3克隆）用无菌PBS稀释至1 μg/mL的浓度来包被组织培养板。对于6孔板，每孔加入2 mL PBS + 抗CD3；对于12孔板，每孔加入1 mL；对于24孔板，每孔加入500 μL。将包被好的板置于4 °C保存，直至使用。</li>
 <li>通过向已预先添加2.06 mM Glutamax-I和25 mM HEPES缓冲液的RPMI-1640培养基中加入10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和50 μM β-巯基乙醇，配制极化培养基。接着，加入2 ng/mL TGF-β和5 ng/mL IL-2。此处可根据需要向培养基中添加感兴趣的配体或抑制剂。将步骤2所得细胞重悬于极化培养基中，浓度为2 × 106 个细胞/mL。</li>
 <li>将包被好的培养板在37 °C预热，然后吸去抗CD3包被孔中的PBS，再加入细胞悬液。对于6孔板，每孔加入4 mL细胞悬液；对于12孔板，每孔加入2 mL；对于24孔板，每孔加入1 mL。空孔中补加PBS以减少培养基蒸发。于37 °C、5% CO2条件下培养3天。</li>
 <li>接种后第3天，将培养板在500 × g离心5分钟。小心吸去上清液一半体积，避免扰动底部的T细胞，并补充等量新鲜培养基。或者，若孔内细胞密度过高（浓度超过3 × 106/mL），可将细胞悬液等分转移至另一块抗CD3包被的培养板中，并补加新鲜培养基至原始体积。继续在37 °C、5% CO2条件下培养2至3天。</li>
</ol>
4. 三种T细胞群体的荧光激活细胞分选（FACS）
<ol>
 <li>通过向无菌 PBS 中加入 0.5%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA 制备 FACS 洗涤缓冲液。将缓冲液置于 4 °C 变冷。</li>
 <li>从细胞培养孔中收集细胞，每孔用 2 mL PBS 清洗，以确保细胞完全回收。将所有细胞转移至 50 mL 聚丙烯管中，在 500 x g 条件下离心 10 分钟，温度为 4 °C.</li>
 <li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞密度。</li>
 <li>加入3-5 × 105 每管细胞数置于四个独立的5 mL圆底聚苯乙烯管中，用于补偿对照。将剩余细胞置于50 mL聚丙烯管中，每管不超过35 × 10⁶个细胞6 每管细胞数</li>
 <li>离心细胞5分钟，转速为 4 °C 并吸除培养基。将待分选的细胞重悬于 90 μL 每次使用 1 x 10 的冷洗涤缓冲液6 细胞。重悬于 100 μL 冷洗涤缓冲液的补偿对照管。</li>
 <li>将待分选的细胞混合 2 μL 抗CD25-PE 3 μL 抗-CD45RA-PE-Cy5和 1 μL 每1 × 10个细胞使用抗CD127-APC6 细胞。第一个补偿对照管中不加抗体， 2 μL 向第二个试管中加入抗CD25-PE 3 μL 抗CD45RA-PE-Cy5 加入第三个管中，并1 μL 向第四个管中加入抗CD127-APC。将所有管置于冰上避光孵育45分钟。</li>
 <li>向待分选细胞中加入 10 mL 冷洗涤缓冲液，向补偿对照管中加入 1 mL。将所有细胞在 500 x g 离心 5 分钟，温度为 4 °C.</li>
 <li>吸去缓冲液，将细胞重悬于浓度为 1 x 107 每毫升洗涤缓冲液中的细胞数。加入 1.5 μL 每毫升细胞在过滤前加入 DNase II 40 μM 尼龙细胞滤网。将细胞转移至多个5 mL圆底聚丙烯管中，每管体积不超过3.5 mL。重悬补偿对照细胞于 300 μL 洗涤缓冲液。</li>
 <li>在MoFlo流式细胞仪上设置补偿，以最小化PE、APC和PE-Cy5滤光片的交叉检测。设定门控以分选iTregs（CD25你好CD127-/低CD45RA- 细胞）、初始型（CD25-CD45RA+）和记忆（CD25-CD45RA-) T细胞加入含有1 mL新生小牛血清的5 mL圆底聚苯乙烯管中。</li>
</ol>
5. 抑制实验
<ol>
 <li>在 AIM-V 培养基中加入 100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、5 ng/mL IL-2 和 2 ng/mL TGF-β，配制抑制实验培养基。</li>
 <li>实验当天，按照步骤 1 和 2 所述方法从血沉棕黄层中纯化异源性 CD4+ T 细胞。这些细胞将作为抑制实验中的靶细胞，不含 CD25+ Treg 细胞，如图 2中第 0 天所示。</li>
 <li>按照试剂盒说明书对细胞进行 CellTrace 标记，但每毫升细胞仅使用 1 μL 的 5 mM 储存液，而非 2 μL。避光操作，向一支 CFSE 冻干粉中加入 CellTrace 试剂盒提供的 18 μL DMSO，配制成 5 mM 储存液。将所需数量的靶细胞（最多 1 × 107）重悬于预热的 PBS + 0.1% (w/v) BSA 中，终浓度为 1 × 106 个细胞/mL。每毫升细胞加入 1 μL 5 mM CFSE，于 37 °C 水浴中孵育 5 分钟。加入 5 倍体积的含 10% FBS 的冰冻完全 RPMI 培养基以终止染色，并在冰上孵育 5 分钟。用冰冷的完全 RPMI 培养基洗涤细胞两次，最后将 1 × 105 个细胞重悬于 100 μL 抑制实验培养基中。</li>
 <li>Treg 抑制检测微珠的储存浓度为 2 × 107 个微珠/mL。根据每次实验所需的总细胞数，通过快速离心收集相应数量的微珠至离心管中。用 RPMI 洗涤微珠一次后再次离心。吸除 RPMI 后，将微珠重悬，使每孔所需的微珠量溶于 8 μL 抑制实验培养基中。</li>
 <li>向 96 孔圆底组织培养板中加入 CFSE 标记的细胞（1 × 105 个细胞/mL）、检测微珠以及极化并分选的细胞（1 × 105 个细胞/mL），使用新鲜的抑制实验培养基，调节至所需的靶细胞（CFSE 标记）:效应细胞（分选细胞）比例，终体积为 200 μL。所有实验条件均设三个重复孔。</li>
 <li>制备第一种对照条件：每孔加入 100 μL CFSE 标记的细胞、8 μL 检测微珠以及 1 × 105 个新鲜未标记的细胞，并用 92 μL 抑制实验培养基补足体积。第二种对照条件的细胞组分与上述相同，但不加入 Treg 检测微珠。</li>
 <li>用铝箔包裹培养板，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育五天。</li>
 <li>避光操作，用移液器收集各孔细胞，转移至 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，吸除上清，用步骤 4 中的 300 μL 冷 FACS 洗涤缓冲液重悬细胞。使用 Cell Quest 软件分析活淋巴细胞门内代表靶细胞的前 3 × 104 个 CFSE+ 事件的直方图。</li>
</ol>
6. 代表性结果
在图2中可见基于CD25与FoxP3、CTLA-4及CD45RA相对共表达水平、监测iTreg分化过程的五天流式细胞术伪彩色点图示例。在图3的直方图中显示了一项成功的抑制实验，其中经分选的iTregs（CD25HiCD45RA-CD127-/LOW细胞）是五天培养后唯一获得调节/抑制功能的细胞亚群。图4展示了在标准iTreg培养基中培养五天后，由初始T细胞群（上排图）和记忆T细胞群（下排图）诱导生成Tregs的结果。初始细胞的CFSE染色表明，无论是初始T细胞（右上图）还是记忆T细胞（右下图），均只有在经历多轮细胞分裂后才分化为iTregs（FoxP3表达水平最高的细胞）。
<img alt="外周血T细胞增殖、分化示意图；流式细胞术、抑制实验的应用。" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 实验流程示意图。通过密度梯度离心法从人外周血中分离PBMCs，随后通过磁珠阴性分选获得CD4+CD25- T细胞。细胞培养5至6天后进行流式细胞术分析，并与异源CFSE标记的靶细胞共孵育，以检测其抑制活性。
<img alt="流式细胞术分析示意图；FoxP3、CTLA-4、CD45RA 表达；按天数显示的诱导性调节性T细胞（iTreg）分化情况。" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 纯化的人原代 CD4+CD25- T 细胞在 iTreg 培养基中培养。在细胞分离后（第 0 天）以及培养第 1、3 和 5 天时分别取样，以监测 CD45RA、FoxP3、CTLA-4 和 CD25 标志物的表达变化。iTreg 表型对应于 CD45RA-、FoxP3Hi、CTLA-4Hi 和 CD25Hi（图中窗口内高亮显示）。
<img alt="调节性T细胞的流式细胞术图：初始型、记忆型、诱导型调节性T细胞；CFSE染色，数据分析。" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 纯化的CD4+ CFSE标记细胞（1 × 105/孔）与分选后的初始型、记忆型或诱导型调节性T细胞（3 × 104/孔）共同培养，并加入Treg suppression inspector beads。培养五天后，收集细胞，通过流式细胞术分析染色细胞的CFSE信号分布。诱导型调节性T细胞的存在完全抑制了CD4+ T细胞的增殖。图中数值表示发生分裂的CFSE标记细胞所占的百分比。
<img alt="流式细胞术图谱，CD45RA 初始/记忆细胞、iTreg、CD25 与 FoxP3、CFSE 标记分析。" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图 4. 纯化的人原代初始性（CD4+CD25-CD45RA+）和记忆性（CD4+CD25-CD45RO+）T 细胞用 CFSE 标记后，在 iTreg 培养基中培养。培养五天后，对细胞进行表型分析并估算细胞分裂速率。如图 2所示，由上述两种细胞群分化而来的 iTreg 亚群表现为 CD45RA-CD25Hi FoxP3Hi 和 CTLA-4Hi（后两者未显示）。通过比较 CFSE 染色图谱可发现，iTreg（此处定义为 FoxP3 表达水平最高的 T 细胞）在五天培养期间具有最强的增殖能力。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管调节性T细胞（Treg）移植在治疗自身免疫、移植物排斥及其他免疫或炎症介导的疾病方面具有巨大的治疗潜力，但目前尚未建立高效生成和稳定维持Treg的有效方法。由于循环中的人T细胞仅有1-5%为Treg，因此对其扩增和分化的可控性研究克服了这一数量上的不足，解决了Treg临床应用中的主要障碍。另一方面，正如我们从TGN1412试验13中所学到的，在实施任何治疗方案之前，深入理解调控人类T细胞命运决定的分子事件在科学和伦理上都是必要的。通过本iTreg分化方法，可从单一人外周血供体获得初始T细胞、记忆T细胞、效应T细胞及iTreg群体，从而便于在源自同一供体的不同细胞群体之间进行基因表达或功能比较。在我们的实验中，分选后的细胞已被用于微阵列和qRT-PCR分析以检测基因变化，用于Western印迹分析关键信号事件，或用于膜片钳技术功能性地评估离子通道的使用情况14。
我们的系统提供了一个额外优势，即可围绕一个核心框架和读出体系，对分化过程中的关键环节进行调控。因此，可以预先分选外周血单个核细胞（PBMCs）以改变输入的细胞群体，或在培养基...

<table><tbody><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114547</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>冷藏台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>亮线血细胞计数板</td><td>豪泽科学</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人 CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T细胞富集试剂盒</td><td>干细胞技术</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人记忆性CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T细胞富集试剂盒 </td><td>干细胞技术</td><td>19157</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人 Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T细胞富集试剂盒</td><td>干细胞技术</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep 磁力架</td><td>干细胞技术</td><td>18001</td><td>银</td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯管</td><td>BD 生物科学</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯离心管</td><td>VWR 国际</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 聚丙烯圆底管</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 mL聚丙烯离心管</td><td>VWR 国际公司</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>人抗CD3抗体</td><td>Bio X Cell</td><td>BE0001-2</td><td>克隆：OKT3</td></tr><tr><td>24孔细胞培养聚苯乙烯板</td><td>BD 生物科学</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>96孔圆底组织培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>含Glutamax-I和HEPES缓冲液的RPMI 1640培养基</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>72400</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>重组人 TGF-&amp;#946;1</td><td>eBioscience</td><td>14-8348-62</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-2</td><td>eBioscience</td><td>14-8029-63</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>MP Biomedicals</td><td>810531</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Amresco</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td>克隆：4E3</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD45RA-PE-Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0458-42</td><td>克隆：HI100</td></tr><tr><td>小鼠抗人CD127-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-890</td><td>克隆：MB15-18C9</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>MP Biomedicals</td><td>190370</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo 流式细胞仪</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>Tree Star, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Quest Pro 软件</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>新生牛血清 </td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>16010</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>0870112</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Treg 抑制检测微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-909</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;M 尼龙细胞筛</td><td>BD 生物科学</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

从人初始t细胞和记忆t细胞诱导生成调节性t细胞

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

免疫抑制性 CD4 细胞的发育与维持+ 调节性T细胞（Tregs）有助于维持外周耐受，以在人体内及体表大量自身抗原和共生抗原存在的情况下保持免疫稳态。Tregs与促炎性常规T细胞之间的平衡失调可能导致免疫病理反应或癌症。尽管在结肠炎小鼠模型中已证明Tregs的治疗性注射具有疗效1 1型糖尿病2 ，类风湿性关节炎和移植物抗宿主病，4 人类与小鼠调节性T细胞生物学的若干根本差异5 迄今为止，这一直限制了其临床应用。治疗性调节性T细胞（Tregs）在数量、纯度、稳定性和归巢特异性方面的不足， necessitated 一个用于优化其发育条件的人源Treg动态研究平台 离体 扩增6.
在此，我们描述了一种从单一人外周血供体诱导调节性T细胞（iTregs）分化的方法，该方法可分为四个阶段：外周血单个核细胞的分离、CD4阳性细胞的磁珠分选、T细胞的激活与扩增，以及iTregs的诱导与鉴定。+ T细胞， 体外 细胞培养与T细胞亚群的荧光激活细胞分选（FACS）。由于调节性T细胞（Treg）特征性转录因子叉头框P3（FoxP3）在人类中是一种由活化诱导的转录因子7 并且不存在其他独特标记物时，必须使用组合标记物 panel 来鉴定具有抑制活性的 T 细胞。经过六天培养后，根据细胞 CD25 和 CD45RA 的相对表达水平，可将本体系中的细胞区分为初始 T 细胞、记忆 T 细胞或诱导性调节性 T 细胞（iTregs）。由于记忆 T 细胞与初始 T 细胞在极化需求和可塑性方面已有不同的研究报道8 ，将初始T细胞群体按CD45RA预先分选+ 和 CD45RO+ 亚群可用于研究这些差异。与他人研究一致，我们的 CD25你好CD45RA- iTregs 高表达 FoxP39 ，GITR 和 CTLA-411 CD127 低表达水平12 经FACS分选各细胞群后，所获得的细胞可用于抑制功能检测，以评估其抑制羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的自体T细胞增殖的相对能力。

我们介绍一种从单一人血供体中分离获得调节性T细胞、记忆性T细胞和初始T细胞的方法。在遗传同质性的条件下，可将极化后的调节性T细胞与其他T细胞亚群在多种遗传学和功能学实验中进行比较，其中包括本文详细描述的抑制功能实验。

从人初始T细胞和记忆T细胞诱导生成调节性T细胞

调节性T细胞（Tregs）的发育与维持有助于实现外周耐受，从而维持……

本实验的总体目标是从原代T细胞生成人调节性T细胞。首先，从人血液样本中分离外周血单个核细胞。然后从PBMC混合物中纯化CD4阳性T细胞并进行培养。六天后，使用流式细胞仪将细胞分选为初始记忆效应细胞和诱导性调节性T细胞亚群，并进行抑制功能检测。利用这些细胞可证明，该方法能够生成具有抑制活性的人源调节性T细胞。与使用口腔细胞的方法相比，本技术的主要优势在于，我们的人源方法具有更高的生理学和临床相关性，并可在单个供体中实现调节性T细胞与其他细胞群体的直接比较。消除个体内部差异。该方法可回答调节性细胞领域的关键科学问题，例如：调控传统T细胞与调节性细胞之间转化的调控事件是什么？调节性细胞所特有的信号转导和转录事件又是什么？由于调节性T细胞在免疫稳态中发挥至关重要的作用，该技术的应用前景广泛，涵盖自身免疫性疾病、炎症性疾病以及癌症的治疗。通常情况下，由于所使用的技术种类繁多，以及某些步骤中细胞培养条件的最佳窗口较窄，初学者在掌握该技术时会面临困难。尽管该方法可用于研究调节性T细胞的发育过程，也可用于监测T细胞谱系分化的可塑性，或分析T细胞微环境在诱导或抑制该发育过程中的能力。展示该实验操作的人员包括Andrea McCool以及研究生Marie Catherine Ranier Gavin Ellis和Catalina Vale Ortega。从40至60升B型血沉棕黄层开始本操作，以分离人外周血单个核细胞。为稀释血沉棕黄层，将其转移至一个已灭菌的500毫升玻璃瓶中，瓶内预先加入150毫升无菌PBS。然后继续添加无菌PBS，使最终体积达到250毫升。接下来，将10个50毫升锥形管分别装入20毫升淋巴细胞分离液。然后将25毫升稀释后的血沉棕黄层轻轻覆盖在淋巴细胞分离液上，注意不要扰动淋巴细胞分离液。将离心管在室温下以500 × g离心30分钟。务必关闭离心机的刹车功能，以免扰动淋巴细胞层。离心后，外周血单个核细胞（PBMC）将位于淋巴细胞分离液与血浆层之间的界面处，以便收集。用移液管吸除血浆层，直至剩余约1毫升液体覆盖含有PBMC的白膜层。使用10毫升移液管将PBMC转移至新的50毫升离心管中。用 PBS 洗涤细胞两次后，将细胞重悬于 50 毫升冷 RPMI 培养基中，并使用血细胞计数板进行计数。在确定浓度后，典型的回收量为 8 × 10⁸ 至 1 × 10⁹ 个外周血单个核细胞（PBMCS）。将 PBMCS 重悬于含有 2% FBS 和 1 毫摩尔 EDTA 的 PBS 中，调整终浓度为 5 × 10⁷ 个细胞/毫升，并将细胞转移至一个新的 14 毫升聚丙烯圆底管中。接下来，将使用EAs试剂盒对目标细胞进行阴性筛选。试剂盒中提供的T细胞富集混合液含有四聚体抗体复合物，该复合物一侧为抗右旋糖酐抗体，另一侧为针对非目标细胞表面抗原的抗体。当将该混合液加入细胞中后，四聚体抗体复合物会连接非目标细胞。随后加入表面包被葡聚糖的磁性颗粒，这些颗粒会结合到四聚体抗体复合物上，从而将不需要的细胞与磁性颗粒连接。接着施加磁场，以分离不需要的细胞和目标细胞，收集目标细胞以分离CD4阳性T细胞。用移液器将1×10⁸至4.25×10⁸个外周血单个核细胞（pbmc）转移至15毫升圆锥形离心管中。然后每毫升pbmc加入50 µL人CD4阳性T细胞富集抗体混合液。混合后在室温下孵育10分钟。混合磁性颗粒，使其在溶液中均匀分布。每毫升PBMC加入100微升磁性颗粒。轻轻吹打混匀两到三次，然后在室温下孵育10分钟。加入含有FBS和EDTA的PBS，通过轻轻吹打混匀两到三次，将体积补至每管10毫升。接下来，将未加盖的试管放入磁力架中，保持试管仍在磁力架内，静置5分钟。将液体倒入新的50毫升离心管中，以分离目标细胞，提高回收率。通过向管中加入额外的P-B-S-F-B-S-E-D-T-A，混匀后再次将样本置于磁力架中，重复此过程。细胞分离完成后，进行计数，然后在室温下以500 × g离心5分钟。用极化培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至每毫升2×10⁶个细胞。随后按照视频下一节所述方法进行培养，以诱导调节性T细胞。将预先包被抗CD3抗体的6孔组织培养板在37°C预热。待培养板升温后，吸除各孔中的 PBS。然后向每孔加入四毫升 CD4 阳性富集的细胞悬液。用 PBS 填充任何空孔，以减少培养过程中培养基的蒸发，37°C 培养三天。以500 × g离心培养板5分钟。然后在不扰动培养板底部细胞的前提下，吸去一半培养基，并替换为新鲜培养基，继续孵育2至3天。此时，细胞可根据下一节所述方法进行荧光激活细胞分选，或作为后续所述抑制实验中的靶细胞使用。在孵育2至3天后，制备细胞及相应的补偿对照，用于荧光激活细胞分析。为分离诱导型调节性初始T细胞和记忆T细胞，按照随附文件所述方法，使用抗CD25 PE、抗CD45RA PE-Cy5和抗CD127 APC对拟分选细胞进行染色。同时务必为流式分析添加相应抗体至适当的补偿对照中。染色后，将细胞重悬于洗涤缓冲液中，浓度为每毫升含一千万个细胞，然后每毫升细胞悬液中加入1.5微升DNase II，并通过40微米尼龙细胞滤网过滤细胞。将细胞转移至5毫升圆底聚丙烯管中，每管体积不超过3.5毫升。将补偿对照细胞重悬于300微升洗涤缓冲液中。在流式细胞仪上设置补偿，以最小化PE、APC和PE-Cy7滤光片之间的交叉检测。设定分选门，将调节性T细胞（Tregs）、初始T细胞和记忆T细胞分选至含有1毫升新生小牛血清的5毫升圆底聚苯乙烯管中，以评估分选过程中产生的调节性T细胞是否能够抑制T细胞的增殖。此处进行抑制实验。未分选的 CD4 阳性富集细胞将作为靶细胞，不应含有 CD25 阳性的诱导性调节性 T 细胞。首先，使用细胞示踪试剂盒，按照制造商的说明，用CFSE标记靶细胞，每毫升细胞使用一微升五摩尔的储存液，而不是两微升。接下来，在微量离心管中通过快速离心，将调节性T细胞（Treg）抑制检测磁珠以与细胞总数相等的数量沉淀下来。用RPMI洗涤磁珠一次，离心后重新沉淀。吸去RPMI培养基，将细胞重悬于适量浓度的抑制试验培养基中，每孔8 µL，加入至96孔圆底组织培养板中。每孔加入8 µL CFSE染色的靶细胞。将磁珠和极化分选后的细胞加入，最终体积为新鲜抑制试验培养基。加入200微升培养基。所有条件均设三个复孔。制备对照组时，在92微升抑制性检测体系中加入100微升CFSE标记的细胞、8微升检测微球，以及1×10⁵个新鲜未标记细胞。向头两个对照孔中每孔加入培养基。然后在92微升抑制试验培养基中，向孔中加入100微升CFSE标记的细胞和1×10⁵个新鲜未标记的细胞。向接下来的两个对照孔中每孔加入培养基。用铝箔覆盖培养板，置于培养箱中避光孵育五天。用移液器收集每个孔中的细胞，放入5毫升圆底聚苯乙烯管中。在4摄氏度条件下，以500 × g离心5分钟。吸弃培养基，加入300微升预冷的FACS洗涤缓冲液重悬细胞。为监测诱导型调节性T细胞分化过程，将纯化的人源初级CD4阳性CD25阴性T细胞在iTreg培养基中培养，并于第0、1、3和5天取样，通过流式细胞术检测CD45RA、FoxP3、CTLA-4和CD25标记物的表达情况。如这些伪彩色点图所示，在为期五天的培养过程中，细胞在TGF-β和IL-2存在下，经CD3交联刺激后体外增殖并发生分化，最终形成CD45RA阴性、FOXP3高表达、CTLA-4高表达及CD25高表达的表型。该结果表明，由常规T细胞前体成功诱导生成了调节性T细胞（Treg）。为评估所生成Treg细胞对T细胞增殖的抑制能力，CFSE标记的细胞与Treg抑制检测磁珠共同培养，同时加入分选后的初始记忆性T细胞和诱导型Treg细胞，如本直方图所示。这些细胞表型为CD25高表达、CD45RA阴性、CD127阴性。在培养五天后，仅诱导型调节性T细胞这一亚群获得了抑制功能。这表明在此系统中产生的细胞在表型和功能上均为抑制性调节性T细胞，而非活化的常规T细胞（后者可能短暂表达FOXP3和CD25，但不具有免疫抑制功能）。诱导产生的调节性T细胞可完全消除CD4阳性T细胞的增殖。数值表示经历分裂的CFSE标记细胞的百分比，用于确认该现象在纯化的T细胞亚群中同样成立。将人原代初始T细胞和记忆T细胞用CFSE染色后进行培养。在Treg培养基中培养五天后，对细胞进行表型分析，并检测细胞增殖速率。此处显示的是，经过五天培养后，从初始T细胞群和记忆T细胞群中分别诱导生成了调节性T细胞（Treg）。在标准的IT调节培养基中，采用CFSE染色初始细胞显示，无论初始T细胞还是记忆T细胞，均需经过多轮细胞分裂后才能分化为调节性T细胞。通过比较CFSE染色图谱，可鉴定出在五天培养期间增殖最活跃的细胞即为诱导产生的调节性T细胞。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从单个供体获得的初始T细胞、记忆T细胞或全部T细胞群体中诱导生成诱导性Treg细胞的方法。在整个操作过程中必须保持无菌技术，并避免CFSE暴露于光线下。在此步骤之后，可进行其他方法，如功能检测，以回答其他问题，例如调节性T细胞与常规T细胞在细胞分裂速率、特异性细胞因子合成以及离子通道使用方面存在哪些差异。该技术为免疫学领域的研究人员探索人类患者中的自身免疫性疾病及其他与Treg相关的病理状况奠定了基础。请务必注意，处理人类血液具有极高危险性，在进行该操作时，必须采取充分的血液检测和妥善的废弃物处理等预防措施。

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免疫学与感染

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一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的CD8αβ+单阳性T细胞的方法。...

利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。...

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

学习从人外周血单个核细胞中分离CD4阳性T细胞并诱导生成调节性T细胞的方法。该技术可在单一供体内比较Treg与其他T细胞亚群，具有更高的生理和临床相关性。

从人初始T细胞和记忆T细胞诱导生成调节性T细胞

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