利用特异性内切和外切糖苷酶鉴定与表征蛋白质糖基化

以下实验的总体目标是演示使用糖苷酶对模型糖蛋白上的 N-连接和 O-连接糖基化进行酶促去糖基化及分析。该目标通过使用 PGA's F 或蛋白质去糖基化混合酶处理糖蛋白来实现。此外，蛋白质去糖基化混合酶中还添加了一组额外的外切糖苷酶混合物，这些酶有时有助于去除其他方式难以清除的糖类。

我们以模型糖蛋白重组人绒毛膜促性腺激素β亚基（HCG beta）为例，通过SDS-PAGE电泳分离，随后使用考马斯亮蓝染色及糖特异性染色方法Pro Q Emerald 300进行染色，以分析其N-糖基化修饰情况。实验结果表明，HCG beta具有异质性糖基化修饰，包含多种糖型形式，这体现在经去糖基化处理前后蛋白质迁移率的差异，以及随着糖链逐步去除，ProQ染色信号相应减弱的现象。

与现有方法（如质谱分析）相比，该技术的主要优势在于操作简便、使用常规实验室设备，且适合糖生物学初学者。该方法可解答糖生物学领域的关键问题，例如：我的蛋白质是否发生了糖基化。首先，将蛋白质去糖基化试剂盒中提供的缓冲液进行解冻。

充分混匀各管，并在室温下保存。将含有酶的试剂瓶置于冰上，用600微升蒸馏水溶解HCG beta试剂瓶中的内容物，并保持在冰上。用蒸馏水将10倍储存液稀释，配制1毫升1×G7缓冲液后，取25微升缓冲液稀释0.5微升的PGA's f。

通过混合四种外切糖苷酶各两微升来制备外切糖苷酶混合液。接下来，按照书面实验方案所述，向7个编号的PCR管中分别加入HCG β亚基和10×糖蛋白变性缓冲液，盖上管盖，轻轻混匀后在PCR仪中进行孵育，于94摄氏度加热10分钟，随后在4摄氏度保持。从PCR仪中取出管子后，短暂离心以去除管壁上的冷凝液。向每根反应管中加入其余试剂，具体操作依据书面实验方案进行。使用新的管盖封闭PCR管。

然后，在离心沉淀内容物后，轻轻弹击管壁四次以混匀，将离心管放入PCR仪中，在37摄氏度孵育四小时。随后将样品冷却至4摄氏度。为进行SDS-PAGE，配制新鲜的3×还原性SDS上样缓冲液。

加入DTT后，向每个样品中加入12.5微升已配制的3×还原型SDS上样缓冲液，用新盖子盖紧管子，并轻轻弹击管壁以混匀。将管子置于PCR仪中，在94°C孵育5分钟，随后冷却至4°C。孵育结束后，将每个样品的30微升以及10微升蛋白Marker上样至10–20%三甘氨酸凝胶中，其余样品保存备用。

在130伏电压下电泳，直至溴酚蓝指示剂前沿迁移至凝胶底部附近。电泳结束后，将凝胶从制胶模具中取出，放入小型塑料容器中，加入足量考马斯亮蓝染液以完全覆盖凝胶。在温和振荡条件下染色一小时。染色完成后进行后续处理。

用50毫升固定液浸泡，每次30分钟，共洗涤三次。使用白光透射仪或扫描仪记录图像。或者，可将凝胶夹在玻璃纸之间干燥。

在电泳装置中，当凝胶电泳进行时，将每个样品的剩余部分与蛋白质标记物一同在10%至20%的三甘氨酸凝胶上进行电泳。用DMF溶解ProQ emerald染色试剂，并根据试剂盒附带的产品说明书配制染色所需的固定液、洗涤液和氧化液。电泳完成后，将凝胶从制胶模具中取出，放入塑料盒中。

加入 100 毫升已配制的固定液固定凝胶。于室温下轻轻振荡孵育过夜，次日继续在室温下用 100 毫升已配制的洗涤液洗涤 10 至 20 分钟，并更换新鲜洗涤液重复洗涤一次。

接下来，将凝胶在25毫升新鲜配制的氧化溶液中轻轻振荡孵育30分钟，以氧化碳水化合物；在凝胶洗涤过程中再进行两次额外的漂洗。通过将500微升ProQ Emerald 300试剂溶液加入25毫升试剂盒提供的染色缓冲液中，新鲜配制ProQ Emerald 300染色液。染色完成后，将凝胶置于避光条件下，在新配制的染色液中轻轻振荡孵育90至120分钟进行染色。

重复之前所述的两个洗涤步骤。然后使用300纳米的紫外透射仪记录图像。最后一步，将库马西染色凝胶的图像与ProQ Emerald染色凝胶的图像进行比较。

通过比较对照样品与PGA的F处理，可以观察到酶促去糖基化后蛋白质迁移率的变化。为去除N-聚糖，使用去糖基化混合物处理以去除N-和O-聚糖，但在额外消化糖苷后未观察到分子量进一步减小。除分子量发生变化外，随着聚糖的去除，条带也变得更加清晰。

位于17千道尔顿标记下方的一条带可能代表完全去糖基化的HCGβ多肽。第5至第7泳道显示了对应于糖基化形式的条带。其他条带可能源于去糖基化不完全，或来自HCGβ样品中存在的多种未明确的蛋白质。

翠绿色试剂可氧化并染色蛋白质分子中存在的所有聚糖。因此，随着HCG β亚基发生酶促去糖基化，信号强度会降低。第三和第四泳道中的残余信号表明存在对所用酶具有抗性的聚糖基序。

第四泳道使用了额外的糖苷。去除少量多余的糖残基。蛋白质的迁移位置相同，但染色强度略有下降。

并非所有蛋白质种类都含有抗性糖基部分。某些条带未被翠绿染料（emerald Green）检测到，表明这些蛋白质被高度去糖基化。更多数据支持以下结论：HCG β亚基具有异质性糖基化修饰。泳道2中的下方条带在翠绿染料成像中信号较弱。

尽管第二泳道的上部条带较亮，表明仍存在大量聚糖基团，但这些数据支持以下结论：在小鼠细胞中表达的重组人绒毛膜促性腺激素β亚基由于糖基化的固有异质性而具有多种糖型。在完成此步骤后，可进一步采用其他方法（如质谱分析）来回答更多问题，例如：糖基化位点的占据率是多少？糖基化的程度如何？或聚糖的精细结构是什么？

观看本视频后，您应能充分理解如何使用糖苷酶对糖蛋白上的 N-连接聚糖进行酶促去糖基化及分析。检测方法的选择可能较为困难，因为只有当去糖基化导致蛋白质的分子质量发生显著变化时，蛋白质染色区域才有实用价值。

我们观察到去糖基化后出现异常的迁移现象，并发现任何迁移变化均表明该蛋白质已被去糖基化。