使用具体远藤和exoglycosidases糖基化蛋白质的鉴定和表征
December 26th, 2011
使用特定的糖苷酶，以消除通过SDS - PAGE的糖蛋白的糖是一种有价值的的方法来检测蛋白质样品聚糖修改初始糖生物学研究的是一个不错的选择。以下deglycosylation变化可以检测凝胶的流动性的变化或与多糖敏感的试剂染色。
以下实验的总体目标是说明使用糖苷进行酶促糖基化以及分析模型糖蛋白上的 n 和 O 连接的糖基化。这是通过用 PGA 的 F 或蛋白质去糖基化混合物处理糖蛋白来实现的。此外，蛋白质去糖基化混合物还补充了额外的外切糖屁股混合物，这有时有助于去除其他抗性糖。
我们使用模型糖蛋白重组人绒毛膜促性腺激素 β 或 HCG β 下一个 SDS 页面，然后是 Kumasi 蓝染色和糖特异性染色方法来说明这种方法。Pro Q Emerald 300 用于分析 D 糖基化。获得 HCG β 样品结果，结果表明 HCG β 是异相糖基化的，并且包含多种糖形式，这是基于有和没有糖酸盐处理的蛋白质迁移差异以及随着聚糖被连续去除而 ProQ 染色信号减弱。
与现有方法（如质谱分析）相比，该技术的主要优点是它简单，使用常见的实验室设备，并且适合糖生物学新手。这种方法可以回答糖领域中的关键问题，例如我的蛋白质是否糖基化。要开始酶促去糖基化，请解冻从蛋白质去糖基化试剂盒中提供的缓冲液。
彻底混合试管并保持室温。将含有酶的小瓶放在冰上，将 HCG β 小瓶的内容物溶解在 600 微升蒸馏水中并保持在冰上。通过在蒸馏水中稀释 10 x 原液制备 1 毫升 1 mL 的 XG 7 缓冲液后，使用 25 μL 稀释 0.5 μL 的 PGA f。
通过混合 2 微升（四种 exo glyco 病害中的每一种）来制备糖外分泌糖酸盐混合物。接下来，按照书面方案中的指示，将 HCG β 和 10 x 糖蛋白变性缓冲液添加到 7 个编号的 PCR 管中，盖上管子并混合，通过在 94 摄氏度下孵育 10 分钟，然后在热循环仪中保持 4 摄氏度，使蛋白质变性。从热循环仪离心机中取出试管以去除每个反应管上的任何可见冷凝水后， 根据书面方案添加剩余试剂。使用新盖子关闭 PCR 管。
然后在旋转内容物后轻轻敲击四次混合试管，将试管放入热循环仪中，在 37 摄氏度下孵育 4 小时。然后将样品冷却至 4 摄氏度。要设置 SDS 页面，请准备新鲜的 3 倍还原 SDS 上样缓冲液。
使用 DTT，向每个样品中加入 12.5 微升制备的 3 倍还原 SDS 上样缓冲液，用新盖盖住试管，然后轻轻敲击试管以混合。将试管在热循环仪中于 94 摄氏度孵育 5 分钟，然后冷却至 4 摄氏度。孵育负载后，将每个样品 30 微升和 10 微升蛋白质标记物放在 10% 至 20% 甘氨酸三酯凝胶上。保存每个样品的剩余部分。
在 130 伏特下对凝胶进行电击，直到 D 前靠近凝胶底部。凝胶电泳完成后，从石膏中取出凝胶，并将其放入一个小塑料盒中，并有足够的 kumasi 蓝染色剂覆盖凝胶染色剂。凝胶染色后轻轻搅拌凝胶 1 小时。
洗涤 3 次，每次 30 分钟。在 50 毫升的拘留溶液中，使用白光透射器或扫描仪记录图像。或者，可以在玻璃纸之间干燥凝胶。
在一个框架中，当凝胶电泳时，将每个样品和蛋白质标记物的剩余部分在 10% 至 20% Tri 甘氨酸凝胶上运行。用 DMF 溶解 ProQ 祖母绿试剂，并按照试剂盒随附的产品手册制备用于染色剂的原液固定、洗涤和氧化溶液。电泳完成后，从石膏中取出凝胶并将其放入塑料盒中。
通过加入 100 毫升准备好的固定溶液来固定凝胶。将凝胶在室温下放置过夜，第二天轻轻搅拌。在室温下用 100 毫升制备好的洗涤液洗涤凝胶 10 至 20 分钟，轻轻搅拌，然后用新鲜的洗涤液重复第二次洗涤。
接下来，将凝胶在 25 毫升制备的氧化溶液中轻轻搅拌孵育 30 分钟，氧化碳水化合物，然后在凝胶洗涤时再孵育两次。将 500 μL ProQ Emerald 300 试剂溶液添加到试剂盒中提供的 25 mL 染色缓冲液中，制备新鲜的 ProQ Emerald 300 染色剂。凝胶染色后，在黑暗条件下在准备好的染色剂中孵育，轻轻搅拌 90 至 120 分钟，对凝胶进行染色。
如前所述重复两个洗涤步骤。然后使用 300 纳米的 UV 透射照明器记录图像。最后一步，将 kumasi 染色凝胶的图像与 ProQ 祖母绿染色凝胶的图像进行比较。
将对照样品与 PGA 的 F 处理进行比较时，可以看到酶促去糖基化后蛋白质迁移的变化。为了去除 n 糖，并在去糖基化混合物处理中去除 n 和 O 糖，用额外的糖酸盐消化后不会看到进一步减小的尺寸。除了质量变化外，随着游离寡糖的去除，条带会变得更加清晰。
在 17 kdalton 标记下运行的条带可能代表完全去糖基化的 HCG β 多肽。泳道 5 到 7 显示与 Glyco 相对应的条带。其他条带可能来自不完全的去糖基化或 HCG β 样品中存在的多种未鉴定的蛋白质。
翡翠绿试剂可氧化和染色蛋白质分子中存在的所有游离寡糖。因此，当 HCG β 被酶促 d 糖基化时，信号强度降低。泳道 3 和 4 中的残余信号表明存在聚糖基序，这些基序对所用酶具有抗性。
额外的糖酸盐用于泳道 4。去除一些额外的糖残留物。蛋白质迁移相同，但可以看到染色强度略有降低。
并非所有蛋白质种类都存在抗性糖部分。一些条带未被翠绿检测到，表明它们被广泛地去糖基化 其他数据支持 HCG β 异相糖基化的结论。泳道 2 的下部带在翠绿色图像上很模糊。
虽然泳道 2 上的上带很亮，表明仍然存在许多游离寡糖基团，但这些数据支持以下结论：由于糖基化固有的异质性，在小鼠细胞中表达的重组 HCG β 包含多种糖形式。按照此程序，可以执行其他方法（例如质谱法）来回答其他问题，例如，占用率是多少？糖基化的程度如何，或者聚糖的精细结构是什么？
观看本视频后，您应该对如何使用糖基化进行酶促去糖基化和分析 NNO Linked Glycans 有了很好的了解。关于糖蛋白。检测的选择可能很困难，因为只有当去糖基化导致其他蛋白质的分子量发生显著变化时，蛋白质染色区域才有用。
我们已经看到了去糖基化后的异常迁移，并发现迁移的任何变化都证明蛋白质已经被去糖基化。
概述
本研究展示了使用糖苷酶对糖蛋白进行酶解去糖基化的方法，重点关注重组人绒毛膜促性腺激素β亚基（HCG β亚基）。该方法允许通过SDS-PAGE和特定染色技术分析N-和O-糖基化。
关键研究组成部分
科学领域
- 糖生物学
- 蛋白质分析
- 生物化学
背景
- 糖基化是影响蛋白质功能的关键翻译后修饰。
- 去糖基化技术对于研究糖链修饰至关重要。
- SDS-PAGE是分析蛋白质迁移的常用方法。
- 特定染色方法可以突出显示糖链的存在。
研究目的
- 说明使用糖苷酶进行酶解去糖基化的过程。
- 分析模型糖蛋白上的糖链修饰。
- 为糖生物学新手研究人员提供一种简单的方法。
使用的方法
- 使用特定糖苷酶对HCG β亚基进行酶解处理。
- 根据分子量进行蛋白质分离的SDS-PAGE。
- 用Kumasi blue染色法进行蛋白质的通用可视化。
- 用ProQ Emerald 300染色法进行特定糖链的检测。
主要结果
- HCG β亚基表现出异质性的糖基化模式。
- 在去糖基化后观察到蛋白质迁移的变化。
- 随着糖链的去除，信号强度降低。
- 染色凝胶的比较显示糖链存在的差异。
结论
- 该方法对分析蛋白质上的糖链修饰是有效的。
- 它为比质谱等更复杂的技术提供了一种简单的替代方案。
- 结果可以帮助回答糖生物学中的基本问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Enzymatic deglycosylation using glycosidases provides a rapid, accessible method for assessing glycoprotein heterogeneity, supporting early-stage target validation by clarifying post-translational modification status. This approach enables biopharma R&D teams to evaluate glycan-mediated effects on protein stability, trafficking, and function without requiring specialized instrumentation. The method supports mechanistic de-risking in discovery workflows by linking glycan patterns to functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycosylation heterogeneity to assess its impact on protein function and target engagement.
- Operational Value: Uses standard laboratory equipment and reagents, allowing rapid screening of glycoprotein variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates glycan-truncated protein forms for use in standardized assays requiring defined glycoforms.
- Operational Value: Produces consistent, reproducible protein preparations suitable for high-throughput screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports analysis of disease-relevant glycoprotein isoforms by resolving glycan-mediated microheterogeneity.
- Operational Value: Facilitates comparison of recombinant glycoprotein batches for consistency in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, where glycoprotein characterization informs structure-function relationships and developability assessments.
- Discovery Biology: Clarifies the role of N- and O-linked glycans in protein folding, stability, and cellular activity.
- Screening: Enables preparation of deglycosylated controls for glycan-dependent binding or enzymatic assays.
- Analytics: Provides qualitative and semi-quantitative readouts via gel-based shifts and glycan-specific staining intensity.
- Translational Research: Helps align recombinant glycoprotein profiles with native isoforms observed in clinical samples.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, modular capability applicable across multiple glycoprotein targets in a portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating glycan contributions to protein behavior.
- Operational Value: Requires only standard incubators, centrifuges, and gel electrophoresis systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing glycan-related risks to manufacturability and pharmacokinetics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of glycoprotein candidates based on glycosylation tractability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in glycoprotein handling and enzymatic reaction optimization.
- Depends on access to specific glycosidase enzymes (e.g., PNGase F, O-Glycosidase, exoglycosidase mixes).
- Necessitates standardization of denaturation, incubation, and staining protocols across teams.
- Adaptation may be needed for non-standard glycan structures or atypical glycoprotein expression systems.
- Limited to qualitative or semi-quantitative analysis; complementary methods (e.g., mass spectrometry) are needed for detailed glycan sequencing.
