Name: 配对末端标签测序（嘉PET）测绘染色质相互作用和了解转录调控染色质相互作用分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: 学习ChIA-PET技术用于全基因组染色质相互作用分析，通过染色质免疫沉淀和邻近连接方法构建测序文库。该技术可揭示转录调控机制，为基因表达研究提供重要工具。

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作者由新加坡科技研究局（A*STAR）提供支持。此外，M.J.F. 获得新加坡科技研究局国家科学奖学金、欧莱雅女性科学奖国家奖学金以及李光耀博士后奖学金的支持。Y.R. 获得美国国立卫生研究院（NIH）ENCODE 项目资助（资助号：R01 HG004456-01 和 R01 HG003521-01）。作者还感谢新加坡 8 Pixels Productions 摄制团队，特别是 Kelvin Issey 先生、Chang Kai Xiang 先生和 Sherwin Gan 先生负责拍摄工作，Siti Rahim 女士负责视频剪辑，以及 Michelle Teo 女士负责配音工作。

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<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li>
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无利益冲突声明。

ChIA-PET 是一种用于鉴定转录调控中远距离相互作用的方法。决定 ChIA-PET 文库质量的关键因素之一是 ChIP 样品的质量。
视频中展示的方案采用了EGS和甲醛对细胞进行交联。使用甲醛并结合另一种具有较长间隔臂的交联试剂，可能有助于捕获仅用甲醛无法交联的蛋白质相互作用。 3,11,15我们已利用该方法构建了文库，这些文库展现出稳定的结合位点和远距离相互作用 9然而，对于每种目标因子，均需优化交联和染色质免疫沉淀（ChIP）条件，且应避免过度交联，因为过度交联会导致超声破碎困难，并可能产生虚假的染色质相互作用。通过ChIA-PET鉴定出的染色质相互作用应采用其他方法进行验证，例如荧光原位杂交 原位 杂交 4. 
我们建议染色质材料的起始量至少为 100 ng。尽管我们已成功使用 50 ng 染色质材料构建出高质量的文库，但我们发现，使用较大量的起始材料可使 ChIA-PET 文库构建所需的 PCR 循环数少于 16 个，从而最大限度地减少扩增子和文库冗余。这种较低的冗余度与较高的唯一比对标签数以及较高比例的可用数据相关，因此能够在更少的测序通道下获得更全面的染色质相互作用图谱。每管中磁珠的最终压实体积应分别为：磁性磁珠 50 μl，Sepharose 磁珠 100 μl。如果压实体积低于上述数值，应加入经同样预清除处理的空白磁性磁珠或 Sepharose 磁珠补足至最低压实体积，以减少后续步骤中携带 DNA 的磁珠损失。移液操作 Sepharose 磁珠时，应使用剪切过的吸头或大孔径吸头。
在先前发表的 ChIA-PET 方案5基础上，我们进行了以下改进。首先，采用磁性 G 珠以减少洗涤过程中的样品损失。此外，我们发现大小约为 100 bp 和 138 bp 的非特异性条带来源于自连接的半接头和/或接头的扩增产物。因此，我们降低了生物素化半接头和 454 GS20 接头的浓度，以减少 PCR 扩增过程中非特异性条带的产生。邻近连接反应体系从 50 ml 减少至 10 ml，以降低后续纯化步骤中的样品损失并节约试剂成本。我们还延长了 ChIA-PET DNA 与磁珠结合的孵育时间，以确保链霉亲和素磁珠对 ChIA-PET DNA 的最大捕获效率。
在邻近连接步骤中，不可避免地会以非特异性和随机的方式产生不代表真实体内染色质相互作用的嵌合连接产物。因此，为了评估任何ChIA-PET实验数据的质量，可通过使用两种带有特定核苷酸条形码TAAG和ATGT的半连接子来估算嵌合率5。高通量测序后，首先分析ChIA-PET序列中的连接子条形码组成，从而区分来自特异性连接产物和非特异性连接产物的序列8。我们实验室构建的MCF-7 RNA聚合酶II ChIA-PET文库中已知嵌合体（即异源二聚体AB连接子）所占比例低于15%。
ChIA-PET 序列随后被分为两类，即自连接 PET 和互连接 PET。自连接 PET 来源于染色质片段的自环化连接，而互连接 PET 则来源于两个不同 DNA 片段之间的连接。后者进一步根据同一染色体上两个标签之间的基因组距离（染色体内互连接 PET）或两个标签分别比对到两个不同染色体的情况（染色体间互连接 PET）分为三种不同类别。我们开发了一个 ChIA-PET 工具软件包，用于对这些不同类别的序列进行分类8。分类将基于文库中的 DNA 片段进行。通常情况下，较小的 ChIP 片段可提供更高的分辨率，对于这些 RNA 聚合酶 II ChIA-PET 文库，片段大小的截断值约为 4 kb。
此外，通过计算相互连接簇中成对末端标签（PET）的数量，可以将真实的染色质相互作用与随机噪声区分开来；换句话说，PET数量较高的簇更有可能代表真实的染色质相互作用8。
为了过滤因高度富集的锚点随机形成分子内连接PET而产生的假阳性，还建立了一套统计分析框架，用于评估任意两个锚点之间随机形成分子内连接PET的可能性8。
综上所述，ChIA-PET 技术能够在全球范围内绘制染色质相互作用网络。ChIA-PET 中的 ChIP 步骤可降低文库复杂性和背景噪声。此外，ChIP 能够增强染色质相互作用的特异性，从而实现对特定转录因子相关的染色质相互作用进行分析5。

配对末端标签测序染色质相互作用分析（chia-pet）用于绘制染色质相互作用图谱及解析转录调控机制

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

基因组以三维结构组织，在微米级的细胞核空间内形成高级构象7, 2, 12。这些结构并非随机形成，而是涉及基因启动子与调控元件之间的相互作用13。转录因子与特定调控序列的结合，形成了转录调控与协调的网络1, 14。
成对末端标签测序法染色质相互作用分析（ChIA-PET）被开发用于鉴定这些高等级染色质结构5,6。首先对细胞进行固定，并通过共价的DNA-蛋白质交联来捕获相互作用的基因组位点。为了最大限度地减少非特异性背景噪音、降低复杂性，并提高染色质相互作用分析的特异性，在邻近连接之前，使用针对特定蛋白因子的染色质免疫沉淀（ChIP）来富集感兴趣的染色质片段。随后，通过含有半连接子的连接反应，在单个染色质复合物内被锚定在一起的DNA片段对之间形成共价连接。半连接子中侧翼的MmeI限制性内切酶位点使得在MmeI消化后能够释放出成对的末端标签-连接子-标签构建体（PETs）。由于半连接子带有生物素标记，这些PET构建体可通过链霉亲和素磁珠进行纯化。纯化后的PETs与下一代测序接头连接，并通过Illumina Genome Analyzer等下一代测序仪生成相互作用片段的目录。随后进行序列比对和生物信息学分析，以鉴定经ChIP富集的结合位点以及经ChIP富集的染色质相互作用8。
我们制作了一段视频，以展示ChIA-PET实验方案中的关键步骤，特别是ChIP的制备过程，因为ChIP的质量对ChIA-PET文库的最终结果具有重要影响。由于整个实验流程非常冗长，视频中仅展示了其中的关键步骤。

配对末端标签测序法染色质相互作用分析（ChIA-PET）是一种用于 从头合成 染色质相互作用的检测，以更深入理解转录调控机制。

配对末端标签测序染色质相互作用分析（ChIA-PET）用于绘制染色质相互作用图谱及解析转录调控机制

基因组以三维结构组织，在微米级的细胞核空间内形成高级构象7, 2, 12。此类……

利用粉末和标签测序进行COMIN相互作用分析是一种用于全基因组范围内长距离COMIN相互作用分析的方法。简而言之，我们称其为magic share pad。该方法涉及多个分子生物学步骤，可能较为复杂。因此，在接下来的视频中，我们将向您展示染色质免疫共沉淀（ChIP）及ChIA-PET分析文库构建过程中涉及的一些关键步骤。染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，简称ChIP）是构建ChIA-PET文库的第一步，也是关键步骤。在此步骤中，来自细胞培养物的染色质样品经过交联、超声破碎和免疫沉淀处理。随后将芯片DNA的等分试样与带有条形码的半接头连接，并进行邻近连接。通过限制性酶切释放PETs，利用包被的磁珠进行纯化，然后连接接头以进行下一代测序。通过AB接头组成及标签侧翼序列鉴定嵌合质粒PETs。中心连接序列被读取并比对到基因组。在本视频中，我们将展示我们实验室在MCF七号乳腺癌细胞系上常规使用的标准染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案。根据我们的数据，使用特异性抗体进行更高程度的ChIP富集可获得更优质的ChIP-seq数据。因此，我们强烈建议优化ChIP实验方案，并通过定量PCR（qPCR）验证富集效果。在进行染色质构象捕获文库构建之前，将CF7细胞在500平方厘米的组织培养皿中培养至约75%汇合度，此时细胞数量约为2000万个，然后进行交联。弃去培养基，用预热的PBS洗涤细胞两次。加入新配制的1.5毫摩尔EGS，在室温下于旋转仪上固定细胞45分钟，随后加入37%甲醛至终浓度为1%，继续孵育20分钟。交联效率至关重要，且随细胞系和目标蛋白的不同而变化。应优化交联的浓度、孵育时间和温度。使用终浓度为 200 毫摩尔的甘氨酸孵育 10 分钟，以淬灭交联剂。弃去淬灭的交联剂，并用预冷的 PBS 洗涤两次，通过使用预冷台式离心机刮取细胞沉淀来收集细胞。此时细胞沉淀已准备好进行细胞裂解。或者，可将细胞沉淀在 -80 °C 冻存。若细胞沉淀已冻存，则在进行细胞裂解前需先在冰上解冻，并用含 0.1% SDS 的裂解缓冲液重悬细胞沉淀。将离心管置于4°C的预冷离心机中旋转，弃去上清液，并重复细胞裂解步骤。待细胞核裂解以释放交联的染色质后，再进行染色质片段化。核膜的缺失使得交联的染色质可在更温和的条件下进行超声处理。将重复使用的凝胶条核染料板放入1% SDS裂解缓冲液中。将悬浮液转移至高速离心管中。在4°C下旋转离心管。通过离心去除核碎片。染色质层应呈现如下外观。使用 P 1000 移液器吸头将染色质层打碎，并用 0.1% SDS 裂解缓冲液洗涤两次。将离心管置于4°C下，使用冷冻离心机进行离心。细胞核沉淀现可进行超声处理。或者，将沉淀在-80°C下冷冻保存。将腭组织转移至透明离心管中，加入0.1% SDS裂解缓冲液，并去除所有气泡。超声处理过程中需保持样品低温，以防止过热。缓冲液体积、探头深度、超声强度、循环次数以及交联程度等不同条件均可能影响超声处理的效率。使用蛋白酶K解交联并分装染色质，然后进行琼脂糖凝胶电泳。为验证片段化效率，建议优化实验条件以获得200至600碱基对的目标DNA片段大小范围。通过离心去除细胞碎片。染色质现已准备好用磁珠进行预清除。或者，可将染色质在负80摄氏度保存，直至收集到足够的样品。开始ChIP实验时，用磁珠洗涤缓冲液洗涤磁珠三次。此后所有涉及磁性蛋白珠的洗涤步骤均包括以下操作。将超声处理的染色质加入预先洗涤的磁珠中，在另一管中于4°C下孵育过夜。用抗体包被预先洗涤的磁珠，并在4°C下孵育过夜。用磁珠洗涤缓冲液将抗体包被的磁珠洗涤两次。底物的高复杂性导致邻近连接不可避免地产生大量非特异性噪声，从而增加测序成本。除了降低复杂性和背景噪声外，我们还使用了小鼠RNA聚合酶II单克隆抗体来鉴定参与转录调控的染色质相互作用。这使得能够研究活性启动子及其相应的调控区域，从而理解高效且可能协同的转录过程。弃去抗体包被磁珠的洗涤缓冲液，将预清除的染色质与抗体包被的磁珠混合，并在4°C下孵育过夜。经过过夜孵育后，磁珠经历一系列洗涤步骤以去除未结合的染色质，随后将磁珠重悬于TE缓冲液中并分装。取少量样品用于定量及富集程度检测。利用PAD和标签测序进行染色质相互作用分析，是一种为大规模从头分析高级染色质结构相互作用而开发的技术。通过染色质免疫沉淀富集的DNA片段经邻近连接法捕获。采用接头与标签策略构建CHI PET文库，并利用高通量下一代测序技术进行测序。在本视频中，我们将展示CHI PET文库构建中的关键实验步骤。文库构建的第一步包括对蛋白A或蛋白G磁珠进行操作，DNA片段即结合于这些磁珠上，以去除酶和缓冲盐。每次酶促反应后，将磁珠置于磁力架上，通过轻柔离心和轻弹管壁的方式完成每一步洗涤。当磁珠处于磁力架上时，用移液器反复吹打上清液数次，以最大程度回收磁珠。在所有含有反应混合物中珠子的孵育步骤中使用浓缩器。预先配制主混合液，并在珠子充分重悬且均匀后，最后加入酶。确保在整个孵育过程中珠子保持充分混匀。半接头寡核苷酸设计包含一个由四个核苷酸组成的内部条形码，以及II型限制性内切酶MME I的识别位点。在将半接头连接至染色质复合物中锚定的DNA片段后，相互作用的DNA片段将通过完整的接头序列连接在一起。这些半接头可能因非特异性连接产物形成含有异源二聚体ab接头的序列，或因特异性连接产物形成含有同源二聚体AA或BB接头的序列。因此，使用带有不同核苷酸条形码的两个半接头，不仅可以区分不同的实验或重复样本，还可监测不同染色质免疫沉淀复合物之间非特异性嵌合连接的发生率。务必在冰上进行反应体系的配制，并将半接头在冰上轻轻解冻。先将半接头与水充分混合，再与含有PEG的连接酶缓冲液混合。在重新悬浮前，确保主混合液充分混匀。将芯片DNA与T4 DNA连接酶混合后，仅在半接头与芯片DNA片段充分混匀后加入，以防止半接头发生串联。用石蜡膜密封管体，在16摄氏度下旋转孵育过夜。随后通过向缓冲液EB中加入SDS，将完整的染色质复合物从磁珠上洗脱下来，以洗脱DNA，并通过添加Triton X-100降低SDS浓度，从而中和所有SDS。染色质复合物的环化过程依赖于两个半接头的连接，从而在相互作用连接处形成完整的接头序列。在极稀释条件下连接洗脱的染色质复合物，以最大限度减少不同DNA-蛋白质复合物之间的连接反应，仅在洗脱的染色质复合物于反应体系中充分稀释后，再加入T4 DNA连接酶。逆转交联后，去除与DNA结合的蛋白质，使用苯酚-氯仿抽提法纯化环化的DNA片段，并采用KaiGen相锁凝胶系统实现简便分离。苯酚抽提后，使用糖蓝A DNA载体以增加腭部产物的质量和可见度。半接头寡核苷酸含有侧翼MM E one识别位点。MM E one A型II类S限制性内切酶在其靶结合位点下游18和20个碱基对处切割，产生染色质片段的短标签，形成PET标签-接头-标签结构，简称pets。此外，每个半接头均用生物素进行修饰，以通过链霉亲和素包被的磁珠实现对pet载体的纯化。进行MME I酶切以释放标签-接头载体。通过选择性结合至链霉亲和素包被的磁珠来纯化pet载体，并将pet载体与适配子连接，用于高通量测序。使用融合DNA聚合酶扩增CHI PET文库融合片段。利用DNA聚合酶可高效、高保真地生成模板。PCR反应需在低温条件下配制，并最后加入融合DNA聚合酶。由于该酶具有从3'到5'的外切核酸酶活性，在缺乏dNTPs的情况下可能降解引物。如果文库构建成功，则应出现一条清晰且界限分明、大小约为223个碱基对的条带。从凝胶中切取223 bp条带时，应避免非特异性条带，并使用凝胶压碎法（Gel Crush Protocol）纯化所切下的条带。在高通量测序之前，使用 Agilent 2,100 生物分析仪配合 DNA 1000 试剂盒进行质量检测。我们刚刚展示了 CHI PET 实验流程，用于无偏倚地检测全基因组范围内的染色质相互作用。CHI PET 数据的质量取决于所用 ChIP 抗体的有效性以及测序深度。此处我们使用1800万到2000万条读长进行相互作用图谱绘制。该特定方案已成功用于表征人基因组中由雌激素受体和RNA聚合酶介导的染色质相互作用网络。我们预计，在全基因组背景下研究转录生物学的三维结构时，该检测方法将成为未来研究中的有力工具。我们希望本视频对您有所帮助。感谢您的观看。I.

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