Name: 斑马鱼的胚胎细胞内细菌病原体感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 学习利用显微注射技术将荧光细菌注入斑马鱼胚胎，通过荧光与共聚焦显微镜实时成像观察宿主免疫细胞与病原体的相互作用，为免疫学研究提供可靠的活体成像方法。

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作者谨此感谢 Chao Cui、Floor de Kort、Esther Stoop 和 Ralph Carvalho 为图4提供图片，感谢 Ulrike Nehrdich 和 Davy de Witt 提供鱼类饲养支持，并感谢实验室其他成员的有益讨论。本工作由荷兰经济事务部与教育、文化和科学部的 Smart Mix 计划、欧洲委员会第七框架项目 ZF-HEALTH（HEALTH-F4-2010-242048）、欧洲玛丽·居里初始培训网络 FishForPharma（PITN-GA-2011-289209）以及澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC，项目号637394）资助。澳大利亚再生医学研究所得到了维多利亚州政府和澳大利亚政府资助项目的资助。

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<li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li>
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<li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的感染方法常用于研究宿主先天免疫基因或细菌毒力基因的功能1。静脉显微注射法（方案5和6.1）是此类研究中最常用的方法。对于1日龄胚胎，最便于进行静脉注射的部位是尾部静脉后部的血岛区域。随着胚胎发育，尾静脉在后期更难穿刺，因此我们更倾向于选择2-3天龄胚胎的库维氏管（Duct of Cuvier）作为静脉注射位点。在所有情况下，关键是要向胚胎注射数量一致的细菌，应通过将注射接种物涂布于平板并进行菌落形成单位（cfu）计数来验证细菌数量。为实现可重复的注射操作，需考虑以下几点：首先，必须使用高质量的玻璃毛细注射针。若针尖过粗，注射会造成较大的穿刺孔，导致出血，且注入的细菌会从血液循环中漏出。其次，细菌必须直接注入血液循环中。若针尖未进入静脉，或注射液扩散至卵黄囊延伸区，则该胚胎必须从实验中剔除。第三，使用PVP40作为注射M. marinum的载体有助于防止细菌在玻璃针内沉降。PVP40可提高悬浮液的均一性，从而在整个注射过程中获得更可重复的接种量。PVP40也可用于S. typhimurium的注射，但在此情况下重要性较低，因为该细菌体积较大且具有明亮的荧光，可在实验过程中通过肉眼观察来监控注射接种量。为练习注射技术，我们推荐使用酚红染料（1% v/v）或不同颜色的1 μm荧光微球（Invitrogen）。一旦掌握该技术，完成50-100个胚胎的注射约需30分钟，包括在琼脂糖平板上排列胚胎以及调整细菌注射体积所需的时间。
尽管向血岛（方案5）或柯氏管（方案6.1）进行静脉注射是最常用的方法，但本视频文章中描述的替代感染途径已被证明在研究巨噬细胞和中性粒细胞趋化性（方案6.2、6.3和6.4）、研究减毒细菌株的生长（方案6.5）以及将斑马鱼感染模型应用于高通量实验（方案6.6）方面具有实用价值4-8。文中所述的显微注射方法也可用于病毒18, 19、真菌孢子14, 20或原生动物寄生虫的注射（Maria Forlenza，个人交流）。本视频文章所述注射方法的一个有益补充是近期报道的一种将细菌皮下注射至斑马鱼胚胎的技术21。该技术已被用于研究中性粒细胞对细菌的吞噬作用，研究发现中性粒细胞能够高效吞噬组织表面的细菌，但与巨噬细胞不同的是，当中性粒细胞被注射至血液或充满液体的体腔时，几乎无法吞噬细菌。进行皮下注射时，胚胎的摆放方式与本视频文章中所述尾肌注射相似，但注射针头需插入皮肤下方，将细菌注入体节区域。
需要认识到，显微注射本质上是一种人工感染途径。然而，早期胚胎对外部细菌病原体的暴露具有高度抗性。事实上，将胚胎浸泡于细菌悬液中的浸染实验在我们操作中无法获得可重复的结果22。尽管部分胚胎在浸染后可能被感染，但我们观察到此类实验中个体胚胎间的死亡率以及炎症标志基因表达存在较大差异。本文所描述的显微注射方法能够实现可重复的感染，特别适用于研究细菌与宿主先天免疫细胞之间的相互作用。一种有效量化单个胚胎内细菌感染水平的方法是使用定制的专用像素定量软件分析感染胚胎的荧光图像17, 23。该方法已被证明与感染胚胎涂板后菌落形成单位（cfu）计数结果具有良好的相关性。类似地，在转基因白细胞荧光报告品系中，可通过数字图像分析量化每个胚胎中白细胞数量的相对变化；该方法可用于评估宿主对感染所引发的白细胞生成反应24。
宿主先天免疫基因的功能可以被高效地研究 体内 通过将所述感染模型与吗啉代敲降技术相结合。吗啉代是一类合成的反义寡核苷酸，可靶向特定RNA，在注入单细胞期斑马鱼胚胎后可降低基因产物的表达，如本期刊其他视频文章所示。 10, 25 在吗啉代寡核苷酸敲低研究中，所有待比较的胚胎组在进行细菌注射前必须准确判定发育阶段。这一点尤为重要，因为胚胎的免疫系统处于发育过程中，其免疫能力会随着时间推移而逐渐增强。
目前已有多种转基因报告基因品系可用于区分斑马鱼胚胎中的主要天然免疫细胞亚群——巨噬细胞和中性粒细胞。mpx 和 lyz 启动子已被用于构建中性粒细胞报告基因品系16, 26, 27，而 csf1r（fms）和 mpeg1 启动子则被用于构建巨噬细胞特异性报告基因品系14, 28。尽管 csf1r（fms）在黄色素细胞中也有表达，mpeg1 的表达则专一局限于巨噬细胞。如本视频文章所示，近年来开发的 mpeg1 报告基因品系在成像巨噬细胞对细菌的吞噬作用方面具有很高的应用价值。

<table><tbody><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228210</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H10 琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook OADC 增菌剂</td><td>BD Biosciences</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 肉汤</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook ADC 增菌剂</td><td>BD Biosciences</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>吐温 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮 (PVP40)</td><td>Calbiochem</td><td>529504</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-苯硫脲 (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque 琼脂糖（低熔点琼脂糖）</td><td>Lonza Inc.</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres（1.0 &amp;mu;m，红色荧光 (580/605)）</td><td>Invitrogen</td><td>F8821</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres（1.0 &amp;mu;m，黄绿色荧光 (505/515)）</td><td>Invitrogen</td><td>F8823</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼胚胎感染细胞内细菌病原体

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

斑马鱼（斑马鱼胚胎作为研究脊椎动物先天免疫系统在宿主-病原体相互作用中功能的模型正日益受到重视 1先天免疫系统的主要细胞类型——巨噬细胞和中性粒细胞——在胚胎发育的最初几天内形成，早于适应性免疫应答所需的淋巴细胞的成熟。斑马鱼模型具有多种优势：易于获取大量胚胎，胚胎体外发育便于操作，胚胎和幼体阶段具有良好的光学透明性，拥有丰富的遗传工具、大量的突变体资源以及多种转基因报告品系，这些特点共同提升了该模型的广泛应用价值。 鼠伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌 （S. typhimurium） 和 Mycobacterium marinum 可存在于巨噬细胞内，并常用于研究斑马鱼胚胎中的宿主-病原体相互作用。这两种细菌病原体的感染过程值得比较，因为 S. typhimurium 感染在一天内即表现为急性且致死性，而 M. marinum 感染为慢性，可成像至幼虫阶段 2, 3胚胎内细菌显微注射位点图1）决定了感染是会迅速发展为全身性感染，还是最初仍局限于局部。可通过显微注射将细菌直接注入血液循环，以建立快速的全身性感染，注射部位可选择尾静脉后部的尾部血岛或卵黄囊上连接心脏与躯干血管系统的库维氏管（Duct of Cuvier）。在受精后1天（1 dpf）时，胚胎已具有吞噬活性的巨噬细胞，但中性粒细胞尚未成熟，此时优先选择注入血岛。而在受精后2–3天（2–3 dpf）时，胚胎已发育出具有功能（可产生髓过氧化物酶）的中性粒细胞，此时更推荐将细菌注入库维氏管作为注射位点。为了研究髓系细胞向局部感染部位的定向迁移，可将细菌注射至尾肌、耳囊或后脑室 4-6此外，脊索这一结构通常似乎难以被髓系细胞接触，但极易受到局部感染 7对于高通量应用，一种有效的替代方法是在受精后的最初几小时内将细菌注射到胚胎的卵黄中 8结合荧光标记的细菌与表达荧光蛋白的转基因斑马鱼品系（如标记巨噬细胞或中性粒细胞），可为宿主-病原体相互作用的多色成像提供理想条件。本视频文章将详细描述通过静脉注射和局部接种方式对斑马鱼胚胎进行感染的实验方案。 S. typhimurium 或 M. marinum 细菌以及随后对先天免疫系统细胞相互作用的荧光成像。

透明的斑马鱼胚胎已被证明是研究先天免疫细胞与胞内细菌病原体（如Salmonella typhimurium和Mycobacterium marinum）相互作用的有用模型宿主，可用于可视化观察并进行功能研究。细菌的显微注射以及多色荧光成像是在斑马鱼胚胎感染模型应用中所涉及的关键技术。

斑马鱼（Danio rerio）胚胎 increasingly 被用作研究脊椎动物先天免疫系统在宿主-病原体相互作用中功能的模型……

本实验的总体目标是将荧光标记的细菌显微注射至斑马鱼胚胎中，以实现活体成像观察其与宿主免疫细胞的相互作用。首先需制备细菌悬液并将其加载至注射针中，随后对胚胎进行发育阶段鉴定，并在注射板上排列整齐。然后通过特定途径注射细菌接种物，以建立局部或全身性细菌感染。最后，将胚胎进行固定并成像。最终，可通过荧光显微镜和共聚焦显微镜观察到细菌病原体在透明斑马鱼胚胎宿主的荧光吞噬细胞内的胞内定位结果。该方法有助于解答免疫学领域的关键问题，因为斑马鱼胚胎模型在宿主与病原体相互作用的活体成像方面具有很强的优势。通常，初次接触该技术的研究人员会遇到困难，因为该方法需要大量练习，才能稳定地将细菌显微注射到斑马鱼胚胎的血液循环中以建立全身感染，或注射到特定部位以实现局部感染。在拉制玻璃毛细移液针并将其尖端斜面打磨成45度角后，通过观察血流是否稳定，将斑马鱼胚胎置于受精后28小时的发育阶段，其特征包括眼部开始出现色素沉着、尾部呈直线状，以及心脏位于眼部腹侧位置。胚胎麻醉后，使用微量进样器吸头吸取预先制备好的细菌接种物。将装有接种物的针头安装到连接支架的显微操作器上，并置于体视显微镜下。设定注射时间为 0.2 秒，补偿压力为 15 哈帕（Hector Pascals）。调整注射压力至700至900 Hector Pascals之间，以获得所用针头的正确注射体积。在注射前，将装有针头的显微操作仪置于正确位置。将麻醉后的胚胎放置在平坦的1%琼脂糖注射板上，并去除多余的卵水。接下来，使用毛细管环工具将每次注射的胚胎排列整齐。注射过程中用手移动培养板，使胚胎的尾部朝向针尖方向。将针尖置于靠近泄殖腔开口的尾静脉正上方。用针尖刺破周皮，并注入所需剂量的荧光标记细菌。我们通常使用约 250 个菌落形成单位（CFU）的鼠伤寒沙门氏菌（salmonella typhimurium）和约 120 个 CFU 的玛氏分枝杆菌（mycobacterium marum）。若注射操作正确，注射后的细菌悬液将随血流经尾静脉流向心脏；可通过观察脉搏后血管系统是否出现扩张来确认注射是否成功。实验过程中应频繁检查注射体积是否保持一致。为控制整个实验中注射的一致性，可将一滴细菌直接注射到细菌培养基上的一滴无菌PBS液滴中。大约每注射30个胚胎后，将此液滴涂布于平板上，经培养后计数细菌菌落。为了确定注射体积中的菌落形成单位（CFU），可在注射后立即使用荧光体视显微镜观察在血液中循环的单个荧光标记的卵黄囊细胞，并剔除注射不成功的胚胎。感染后两天应可见荧光标记的 M. marum 细菌聚集体，且随时间推移逐渐增大。若需向总主静脉（duct of Cuvier）注射，应选取受精后两天至三天的胚胎并进行麻醉处理。对于在胚胎背侧以45度角进行卵黄静脉注射，应将针头插入古维氏管的起始位置。注射位置位于后脑室，即古维氏管在卵黄囊上方开始扩张处的稍背侧。将受精后32小时的胚胎以背侧朝向针尖方向进行麻醉处理。从前方将针头插入后脑室，避免触碰神经管，以向尾部肌肉注射。将受精后1至2天的麻醉胚胎置于尾部朝向针尖的位置，针头与胚胎呈约65度角，向尿殖孔上方的肌肉注射，用于耳囊注射。将受精后2至3天的麻醉胚胎调整为尾部朝向针头方向。以65度角注射，并在低压力下操作，使用受精后一至两天的胚胎，使尾部朝向远离针头的方向。将针头穿过尾部肌肉组织插入脊髓索中。对于16至1000细胞期胚胎的卵黄注射，将针头穿过卵膜插入卵黄中心以观察感染情况。将感染的胚胎麻醉于涂有1%明胶的培养皿中，培养皿内含有含三卡因（trica）的卵水。使用毛发环工具将胚胎调整至正确位置，以便在荧光体视显微镜下进行成像。注射后可直接在血流中观察到单个荧光标记的胸腺细胞。如果需要不同于侧位的观察角度，可将胚胎固定在1.5%甲基纤维素中，并使用毛发环工具调整胚胎至所需位置，然后利用倒置共聚焦显微镜观察感染情况。在玻璃底培养皿上滴加一滴低熔点琼脂糖。将麻醉后的胚胎连同少量胚胎水放入琼脂糖液滴中，使用毛发环工具将胚胎调整至合适位置。待琼脂糖凝固后，将琼脂糖液滴浸入含有三卡因（trica）的胚胎水中。样本现已准备好用于共聚焦成像。在受精后一天，将鼠伤寒沙门氏菌（salmonella typhimurium）或marum分枝杆菌（mycobacterium marum）注入胚胎的血岛中，可在感染后两小时直接通过体视荧光和共聚焦成像观察到体积相对较大且具有明亮荧光的DS.Red标记的styrian细菌被巨噬细胞快速吞噬并扩散的情况。感染后结果显示，大量细菌被荧光标记的巨噬细胞吞噬。注射250 CFU的野生型styria会引发强烈的促炎反应，并在一天内导致死亡。相比之下，静脉注射erum则会引起持续性感染，感染的巨噬细胞会形成紧密的聚集体，这些聚集体被认为是肉芽肿的早期阶段，而肉芽肿是结核病的典型特征。在感染后第五天，对转基因EG1 EGFP品系中类似肉芽肿的聚集体进行共聚焦成像，显示了mCherry标记的M. num细菌在细胞内的生长情况。在绿色荧光标记的巨噬细胞内，可将细菌注射至后脑脑室。该区域在受精后32小时无巨噬细胞存在；向此区域注射20至100个M cherry标记的M marum细菌，会导致巨噬细胞迅速浸润并吞噬细菌，如图所示。利用转基因M-P-X-E-G-F-P模型，将约20个CFU的Styria注射至耳泡，可在感染后3小时诱导中性粒细胞的趋化。而PBS对照组注射则未观察到此反应。脊索似乎对白细胞浸润具有抵抗性，但却是erm突变株的允许性生长环境；这些突变株若注射至其他组织则表现出显著减毒。在注射2240 CFU剂量的细菌后，细菌在数天内扩散至胚胎组织，并形成类似肉芽肿的聚集体，这与传统的静脉注射方法所观察到的结果相似。在进行此操作时，必须注意斑马鱼胚胎的正确分期至关重要，因为胚胎的免疫系统在发育过程中会逐渐具备功能。通过该实验步骤，还可进一步开展转录组分析和免疫组织化学等方法，以回答其他问题，例如胚胎先天免疫系统如何响应病原体感染。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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斑马鱼胚胎感染细胞内细菌病原体

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