正常人脑中可溶性与不可溶性PrP寡聚体的分离

本实验的目的是分离正常人脑中可溶性和不溶性pion蛋白或PRP所有韧带。首先通过匀浆人脑组织并分离组分来实现该目的，随后进行蔗糖阶梯梯度的速度沉降离心。

然后进行凝胶过滤层析。最后，利用基因五号蛋白（gene five protein）或G5P捕获PRP。最终可获得结果，显示通过蔗糖阶梯密度梯度超速离心、凝胶过滤层析以及G5P捕获PRP等方法，从正常人脑中分离出可溶性和不可溶性PRP或韧带。该方法有助于解答朊病毒病研究中的关键问题，包括克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease）、牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy）及临床消耗性疾病。此外，该方法还可为可溶性和不可溶性蛋白质聚集物的分离提供见解，不仅适用于朊病毒病，也适用于阿尔茨海默病和帕金森病等其他疾病。

通常，初次接触这些方法的研究人员会遇到困难，因为所有实验步骤都很关键，需要格外谨慎。该操作的视频演示至关重要，因为 SEC Fi 的深度要求很高，而使用 G five P 进行 PRP 捕获的步骤难以准确描述，若无更精确的操作则可能失败。制备脑组织匀浆时，首先将 100 µL 裂解缓冲液加入 100 mg 冻存的脑组织中，使用电动研磨棒在冰上进行匀浆，随后将样品在干冰上冷冻 5 分钟，再进行一次匀浆。

分别加入 300 或 800 微升裂解缓冲液，制备 20% 或 10% 的全脑匀浆。使用台式离心机，在 4°C 条件下以 1000 G 离心 10 分钟。收集上清液，使用 S SW 55 转子，在 4°C 条件下以 35,000 RPM 离心 1 小时，分离 S1 组分。

将上清液转移至一个干净的Resus管中。用裂解缓冲液重悬去垢剂不溶性沉淀，以制备用于蛋白质印迹的样品。将S2和P2组分在37摄氏度下与50微克/毫升的蛋白酶K孵育1小时。

加入五毫摩尔的PMSF和SDS样品缓冲液以终止消化。将样品煮沸10分钟，然后在室温下静置5分钟。进行速度沉降时，首先将450微升20%S1组分与等体积的2% Triton X-100水溶液在冰上孵育30分钟，置于5毫升离心管中。分别加入0.5毫升的60%、30%、25%、20%、15%和10%蔗糖溶液，然后将0.4毫升孵育后的S1组分加至10%至60%蔗糖溶液的顶部。

从管顶开始，在 SW 55 转子中以 48,000 RPM、4 摄氏度离心一小时，进行阶梯梯度离心。收集 12 个等体积组分，每份 283 微升。从每份组分中取 20 微升，并加入等体积的 SDS 样品缓冲液。

为制备SDS-PAGE凝胶样品，将样品煮沸10分钟，然后冰浴4分钟。以1000 ×g离心样品1分钟。

然后在将样品加载到预制凝胶过滤柱之前进行涡旋混匀。采用凝胶过滤层析法测定PRP分子的寡聚状态。首先，将七种不同分子质量标记物各200 µL样品体积加载到一根规格为1 × 30的SUEx 200 HR凝胶柱上。

使用蓝色葡聚糖的洗脱体积作为空体积。根据色谱图和分级保留数据计算VE的洗脱峰体积。使用公式KAV = (V - V₀) / (VT - V₀) 计算分配系数KAV。

为生成标准曲线，将蛋白质标准品的KAV值对其标准品的对数分子量作图。接下来，在0.25毫升/分钟的流速下，将200微升S1上样至层析柱中。

用裂解缓冲液 1% cile 洗脱层析柱，并使用组分收集器收集 0.25 毫升的洗脱组分。取每管 125 微升与 500 微升预冷的甲醇在 -20 摄氏度下孵育 2 小时。在 4 摄氏度下以 13,000 G 离心样品 30 分钟。

Reese，将沉淀物在 20 µL SDS 样品缓冲液中重悬，煮沸 10 分钟。冷却至室温后，在 15% 聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。利用标准曲线推算出各种回收的 PRP 组分的分子量，以将 G five P 分子偶联到磁珠上。

将100微克G五P与350微升toci活化的磁珠在1毫升PBS中于37摄氏度孵育20小时。使用外置磁铁将G五P磁珠吸附至离心管管壁，移除上清液。用1毫升含0.1% BSA的PBS洗涤磁珠三次，以阻断非特异性结合。

将G五P偶联的珠子在含有0.1% BSA的1毫升0.2摩尔Tris-HCl（pH 7.4）中于37摄氏度孵育5小时。随后将珠子洗涤三次。弃去最后一次洗涤液，加入1毫升PBS以分离PRP，在1毫升结合缓冲液中，将100微升S一或P二与60微升G五B偶联的珠子在室温下持续旋转孵育3小时。

将试管置于磁架上，吸除溶液，用洗涤缓冲液清洗磁珠三次。最后一次洗涤后吸除上清液，加入SDS样品缓冲液。

将珠子在 95 摄氏度下加热五分钟。将样品加入 15% 预制胶中，在 150 伏特下电泳约 80 分钟。用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 封闭膜后，在 70 伏特下将蛋白质转移至 PVDF 膜上，持续两小时。

在室温下用 PRP 抗体孵育两小时。三种 F 四一 E 四抗 N 或抗 C，在与 HRP 标记的二抗孵育后，按照制造商说明书将膜与化学发光溶液孵育，并曝光胶片。与散发性克雅病（CRUT 瓣膜 jaakko 病，CJD）样本相比，在正常脑组织的 P 二组分中检测到少量不溶性细胞 PRP。

然而，大部分PRP在S2组分中被回收。不溶性PRP约占总PRP的5%至25%，包括全长及C末端截短的亚型。利用蔗糖阶梯梯度沉降分析发现，尽管来自非克雅病（CJD）脑组织的大部分PRPC存在于上层组分中，但在通常含有大分子聚集体的底层组分（第9至11组分）中也检测到少量PRP。多种致病性PRP或PRPSc亚型，其大小从单体开始不等。

通过CRUT阀 yakup 病的脑组织凝胶过滤分离出较小的韧带和较大的聚集体。令人惊讶的是，在正常脑组织的不溶性组分中也检测到少量分子量超过2000千道尔顿的较大聚集体。此外，PRPC的二聚体和四聚体不仅在不溶性组分中被检测到，也在不溶性组分中被发现。

经 PK 和蛋白酶 NGAs 处理后，使用针对 PRP 97 1 0 5 3 的一抗 E 四抗体检测被 G 五 P 捕获的 PRP。检测到耐 PK 的核心片段，分别称为 PRP*20、PRP*19 和 PRP*7，其迁移位置分别为 20 千道尔顿、19 千道尔顿和 7 千道尔顿。

然而，当 one E four 抗体与一段序列与 one E four 表位完全相同的合成肽段预先孵育时，未检测到 PRP，表明 one E four 检测到的条带为 PRP 片段。抗 C 抗体检测到两种不同的 PRP 片段，迁移位置分别约为 18 千道尔顿和 12 至 13 千道尔顿。此外，还包括 PRP ETE 20 Once 方法。

如果操作得当，该技术可在四天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何在人脑下部发育后分离可溶性与不可溶性 PRP 多配偶体。该技术为研究脑内 PIP 构象信息之前体的命运奠定了基础。