Name: 在正常人脑分离的可溶性和不溶性朊蛋白低聚物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学习从正常人脑组织中分离可溶性和不溶性朊蛋白寡聚体的方法。本技术结合超速离心、蔗糖梯度沉降、尺寸排阻色谱和G5P蛋白捕获，为研究阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病中的蛋白质错误折叠机制提供重要实验基础。

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该 作者感谢位于加利福尼亚州洛杉矶的人脑与脊髓液资源中心提供正常脑组织样本。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R01NS062787项目、克雅氏病基金会、Alliance BioSecure，以及凯斯西储大学老龄与健康中心（在McGregor基金会和校长自由支配基金支持下）资助。

1. 脑组织匀浆及去垢剂可溶性（S2）与去垢剂不溶性（P2）组分的制备
<ol>
	<li>取100 mg冷冻的人脑组织，加入100 μl裂解缓冲液（10 mM Tris，150 mM NaCl，0.5% Nonidet P-40 (NP-40)，0.5% EDTA，pH 7.4）。</li>
	<li>使用由无线电机驱动的研杵在冰上进行匀浆，随后将样品置于干冰中冷冻5分钟，再先用手动研杵、后用电机驱动研杵重复匀浆，然后加入300 μl或800 μl裂解缓冲液（分别对应20%或10%总脑匀浆液）。</li>
	<li>将20%或10%总脑匀浆液在4 °C条件下，以1,000 x g离心10分钟，使用台式离心机收集上清液（S1）。</li>
	<li>将10% S1在4 °C条件下，于SW55转子（Beckman Coulter，Fullerton，CA）中以35,000 rpm（100,000 x g）超速离心1小时。将含有去污剂可溶性组分的上清液（S2）转移至洁净离心管中。将含有去污剂不溶性组分的沉淀（P2）用100 μl或200 μl裂解缓冲液重悬，制成10倍或5倍浓缩的样品。</li>
	<li>进行蛋白酶K（PK）消化时，将S2和P2组分样品分别在37 °C下与相同量的PK（终浓度50 μg/ml）孵育1小时。加入苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为5 mM，并加入等体积的SDS上样缓冲液（3% SDS，2 mM EDTA，4% β-巯基乙醇，10%甘油，50 mM Tris，pH 6.8），以终止PK消化反应。将样品煮沸10分钟，室温冷却5分钟，即可用于Western blot检测。</li>
</ol>
2. 蔗糖阶梯梯度中的速度沉降
<ol>
	<li>将450 μl 20% S1与等体积的2% Sarkosyl溶于H2O中，冰上孵育30分钟。</li>
	<li>分别取0.5 ml的60%、30%、25%、20%、15%和10%蔗糖溶液加入至最大容量为5 ml的Beckman离心管中。</li>
	<li>将0.4 ml S1加至10-60%蔗糖阶梯梯度的液面顶部。</li>
	<li>在4 °C下，以48,000 rpm（200,000 × g，SW55转子）离心1小时。</li>
	<li>从离心管顶部开始，每管收集283 μl组分，共收集12个组分。</li>
	<li>取每个组分20 μl转移至新的Eppendorf管中，加入20 μl上样缓冲液，煮沸10分钟。</li>
	<li>在通风橱中冷却4分钟，以1,000 × g离心1分钟，涡旋混匀，然后将样品加至预制胶中。</li>
</ol>
3. 尺寸排阻色谱
<ol>
	<li>使用 Superdex 200 HR 色谱柱填料（Pharmacia，Uppsala，Sweden），在 1 × 30 cm 柱中测定 PrP 分子的寡聚状态。</li>
	<li>分别加载七种分子量标记物（Sigma，St. Louis，MI），包括蓝色葡聚糖（2,000 kDa）、甲状腺球蛋白（669 kDa）、脱铁铁蛋白（443 kDa）、β-淀粉酶（200 kDa）、乙醇脱氢酶（150 kDa）、白蛋白（66 kDa）和碳酸酐酶（29 kDa），每种均按 Sigma 推荐浓度溶于 200 μl 样品体积中上样。</li>
	<li>以蓝色葡聚糖的洗脱体积确定空体积（V0 = 8.45 ml），总柱体积（Vt = 24 ml）由产品说明书提供。峰洗脱体积（Ve）由色谱图和分级保留值计算得出。分配系数 Kav（用于定义样品行为）按公式计算：Kav = (Ve - V0)/(Vt - V0)。通过将标准蛋白的 Kav 值对其分子量对数（log MW）作图，绘制标准曲线8。</li>
	<li>根据多种标准品凝胶过滤所得的标准曲线，评估不同 FPLC 组分中回收的各类 PrP 物种的分子量（MW）。</li>
	<li>每次运行时，将 200 μl 含 1% Sarkosyl 的裂解缓冲液中的 S1 样品注入色谱柱。</li>
	<li>在 FPLC 系统（GE Healthcare）中以 0.25 ml/min 的流速进行层析，使用组分收集器（Amersham Biosciences，RediFrac）收集每管 0.25 ml 的组分。</li>
	<li>将每管 0.125 ml 组分与 0.5 ml 预冷甲醇在 -20 °C 下孵育 2 小时。</li>
	<li>在台式微量离心机中，4 °C 下以 13,000 × g 离心 30 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 20 μl 上述 SDS 样品缓冲液中，煮沸 10 分钟，冷却至室温后上样至预制胶中。</li>
</ol>
4. g5p 对 PrP 的捕获
<ol>
	<li>将 g5p 分子（100 μg）（由英国朴茨茅斯大学的 Geoff Kneale 博士和 John McGeehan 博士惠赠）与 7 x 108 个甲苯磺酰活化磁珠偶联：在 1 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中，将 100 μg g5p 与 350 μl g5p 磁珠于 37 °C 孵育 20 小时。通过外加磁力将 g5p-磁珠吸附至离心管管壁，随后弃去全部溶液。用含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1 ml PBS 洗涤磁珠三次。</li>
	<li>将偶联 g5p 的磁珠在含 0.1% BSA 的 1 ml 0.2 M Tris-HCl（pH 7.4）中于 37 °C 孵育 5 小时，以阻断非特异性结合，然后如上所述用含 0.1% BSA 的 1 ml PBS 洗涤三次。弃去溶液后向磁珠中加入 1 ml PBS。制备好的 g5p 磁珠在 4 °C 下至少可稳定保存 3 个月。</li>
	<li>通过将 100 μl S1 组分或 P2 与 60 μl 偶联 g5p 的磁珠（10 μg 蛋白/6 x 107 个磁珠）在 1 ml 结合缓冲液（含 3% Tween-20 和 3% NP-40 的 PBS，pH 7.5）中孵育，实现 g5p 对 PrP 的捕获。</li>
	<li>室温下持续旋转孵育 3 小时后，通过外加磁力将含有 PrP 的 g5p 磁珠吸附至离心管管壁，从而易于去除溶液中未结合的分子。</li>
	<li>用洗涤缓冲液（含 2% Tween-20 和 2% NP-40 的 PBS，pH 7.5）洗涤三次后，收集 g5p 磁珠，并在 SDS 样品缓冲液（3% SDS、2 mM EDTA、10% 甘油、50 mM Tris-HCl，pH 6.8）中 95 °C 加热 5 分钟。</li>
	<li>样品在室温下冷却 5 分钟后，在室温下以 1,000 x g 离心 5 分钟。上清液即可用于 Western 印迹分析。</li>
</ol>
5. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>将加入 SDS 样品缓冲液后煮沸的样品上样至 15% Tris-HCl Criterion 预制胶（Bio-Rad），在 150 V 条件下电泳约 80 分钟。</li>
	<li>将凝胶中的蛋白质在 70 V 条件下转移至 PVDF 膜，持续 2 小时。</li>
	<li>用含 0.01% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBS-T）配制的 5% 脱脂奶粉封闭膜后，室温下与一抗孵育 2 小时，所用一抗包括单克隆或多克隆抗体 3F4（1:40,000）、1E4（1:1,000）、anti-N8（1:6,000）或 anti-C8（1:6,000），用于检测 PrP 分子。</li>
	<li>一抗孵育后，使用 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG（1:3,000）或驴抗兔 IgG（1:3,000）进行二抗孵育，随后按照生产商说明书，利用 ECL Plus 在 Kodak 胶片上显影 PrP 条带。</li>
</ol>
6. 典型结果
与散发性克雅病（CJD）样本相比，在正常脑组织的P2组分中仅检测到少量异常构象的PrPC，而大部分PrPC存在于S2组分中（图1）。如先前研究所指出8，异常构象的PrP约占总PrP（包括全长型及N端截短型亚型）的5–25%。
利用蔗糖阶梯梯度沉降分析发现，非克雅病（CJD）脑组织中的大部分PrPC分布在顶部组分1-3中，而在通常含有大分子聚集体的底部组分9-11中也检测到少量PrP8（图2）。
通过凝胶过滤法，从克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease）患者脑组织中分离出多种PrPSc形式，包括单体、小寡聚体以及较大的聚集体（图3A）。然而，在正常脑组织的不溶性组分中也检测到少量分子量大于2,000 kDa的较大聚集体（图3C）。此外，PrPC的二聚体和四聚体不仅在不溶性组分中被检测到，也在可溶性组分中被发现（图3B和3C）。
经PK和PNGase处理后，利用g5p捕获的PrP通过针对PrP97-105的1E4抗体进行检测8。检测到三个抗PK的核心片段，分别称为PrP*20、PrP*19和PrP*7，其迁移位置分别为约20 kDa、约19 kDa和约7 kDa（图4，左图）。然而，当1E4抗体与一段序列与1E4表位完全相同的合成肽段预先共孵育时，未检测到任何PrP信号（图4，中图），表明1E4抗体检测到的条带确为PrP片段。此外，抗C端抗体除PrP*20外，还检测到两个不同的PrP片段，迁移位置分别为约18 kDa（PrP*18）和约12–13 kDa（PrP-CTF12/13）（图4，右图）。
<img alt="Western blot 示意图，蛋白质分析，PNGase F 处理，对照组 vs 克雅病，S2 和 P2 泳道，抗体结合。" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. iPrPC 和 iPrPSc 的检测。将正常对照（CTL）和散发性克雅病（sCJD）脑组织样本通过超速离心分离得到的可溶性和不溶性组分（S2 和 P2）中的全长或 N 末端截短型 PrP 蛋白，在总体积 1/10 的条件下经 PNGase F 在 37 °C 处理 1 小时以去除蛋白上的糖链后，使用针对 PrP106-112 的 3F4 抗体（左图）、针对 PrP23-40 的 anti-N 抗体（中图）以及针对 PrP220-231 的 anti-C 抗体（右图）进行检测。在 CTL 样本中，P2 组分中仅检测到少量 PrP，而 S2 组分中含有大量 PrP；相比之下，在 sCJD 样本中，P2 组分中检测到的 PrP 多于 S2 组分。
<img alt="蛋白质纯化电泳结果；显示组分分布的凝胶；分子量。" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. PrP 在蔗糖阶梯梯度中的沉降。使用 3F4 抗体通过 Western 印迹检测非克雅氏病（CJD）脑样本 S1 第 1 至第 11 组分中的 PrP。尽管大部分 PrPC 出现在上层组分 1–3 中，但在底层组分 9–11 中也检测到少量 PrP。此外，来自上层和底层的 PrP 条带模式不同：上层组分中回收的 PrP 以较上方的条带为主，而底层组分中回收的 PrP 则以较下方的条带为主。在印迹右侧加载了经蛋白酶 K（PK）处理的 PrPSc 作为对照。
<img alt="FPLC 分级蛋白质纯化结果，凝胶电泳显示不同分子量的条带。" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
 图 3. 可溶性和不溶性 PrPC 寡聚体的检测。从正常人脑组织中提取的可溶性和不溶性 PrPC 通过超速离心分离后，分别进行凝胶过滤层析。各组分的分子大小通过一组分子质量标准品测定。（A) 来自散发型克雅病（sCJD）脑样本的 PrPSc 物种。检测到两种 PrP 物种群体：凝胶过滤组分 49–65 含有单体和小寡聚体，而组分 27–33 含有大分子聚集体。在正常对照样本的可溶性组分（S2）（B）和不溶性组分（P2）（C）中均检测到 PrPC 物种。PrP 使用 3F4 抗体进行检测。PrP 的二聚体（组分 55）和四聚体（组分 51）不仅在 P2 中被检测到，也在正常脑样本的 S2 中被检测到（B 和 C）。大分子聚集体仅在正常样本的 P2 中检测到（C）。
<img alt="Western blot 蛋白质分析；PrP 条带比较；PK 和 PNGase F 处理；实验结果。" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
 图 4. 在来自正常人脑组织的 g5p 富集样品中检测多种抗蛋白酶 K（PK）的异常型 PrP 片段。经 g5p 富集的样品在进行 Western blot 分析前，经 PK 和 PNGase F 处理，并分别使用 1E4 抗体（左图）、预先与合成肽段（该肽段序列与 1E4 表位相同）孵育后的 1E4 抗体（中图）以及抗-C 抗体（右图）进行检测。1E4 抗体检测到三种抗 PK 的 PrP 片段，分别命名为 PrP*20、PrP*19 和 PrP*7（左图）。当 1E4 抗体被肽段封闭后，未检测到任何 PrPres 条带（中图），表明 1E4 检测到的条带确为 PrP 片段。抗-C 抗体除检测到 PrP*20 外，还额外检测到两种抗 PK 的 PrP 片段，分别命名为 PrP*18 和 PrP-CTF12/13。

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions.+Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li>
<li>Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li>
<li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li>
<li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li>
<li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+%28SAF%29+has+the+same+size%2C+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+%28PrP%29%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li>
<li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li>
<li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+prions+lying+in+wait%3A+a+two-hit+model+of+prion%2Famyloid+formation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li>
<li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li>
<li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variably+protease-sensitive+prionopathy%3A+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li>
<li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li>
<li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZou%2C+WQ+%22Methods+in+Molecular+Biology-Neurogenetics%3A+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols</a>. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).</li>
<li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文报道的方法组合能够从正常人脑中稳定地分离出不溶性PrPC聚集体和可溶性PrPC寡聚体。100,000 × g超速离心1小时是一种经典方法，已被广泛用于分离不溶性PrPSc与可溶性PrPC 14。尽管该方法效率较高，但需注意避免在离心后吸取上清液（S2）时发生污染。由于iPrPC的凝胶电泳图谱与PrPC明显不同，因此P2组分中检测到的PrP不太可能来源于S2的污染。蔗糖梯度沉降分析已被用于根据PrPSc不同亚型的密度、大小和形状进行分离15。我们注意到，第12组分常含有某些颗粒，可能导致该组分结果不可靠。第10组分通常是所收集各组分中PrP聚集体含量最高的组分8。为进一步表征不同PrPC构象体的分子量（MW），我们采用凝胶过滤层析（也称尺寸排阻色谱）进行分析。我们首先使用七种分子质量标记物绘制了标准曲线（数据未显示），随后检测了正常对照组和散发性克雅氏病（sCJD）患者脑组织中PrP的分子量。我们注意到，在制备S1组分...

<table><tbody><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>72 mM 的 2-丙醇溶液</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>2 mg/ml 的 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 溶液</td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>MWGF200</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机 LE-80K，SW55 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>部件编号 365668, 356860</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 凝胶</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1088-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTA FPLC 系统</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>分子量标准蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>多种规格</td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>143-01</td><td></td></tr><tr><td>3F4 抗体</td><td>Covance</td><td>SIG-39600</td><td></td></tr><tr><td>1E4 抗体</td><td>Cell Sciences</td><td>M1840</td><td></td></tr><tr><td>预制胶 15% Tris-HCl Ready Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0020</td><td></td></tr></tbody></table>

正常人脑中可溶性与不可溶性prp寡聚体的分离

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

朊病毒疾病发病机制的核心事件是宿主编码的细胞型朊蛋白PrP的构象转变C 进入其致病性异构体 PrPSc 1PrPC 可溶于去垢剂且对蛋白酶K（PK）消化敏感，而PrPSc 形成不溶于去垢剂的聚集体，并对蛋白酶K（PK）具有部分抗性2-6PrP的转化C 至 PrPSc 已知涉及蛋白质从α-螺旋结构向β-折叠结构的构象转变。然而， 体内 通路仍 poorly understood。一种初步的内源性 PrPSc，中间产物PrP*或“沉默朊病毒”在未感染的脑组织中尚未被鉴定7.
结合生物物理与生化方法，我们鉴定了不溶性 PrPC 聚集体（指定为 iPrP）C来自未感染的哺乳动物脑组织和培养的神经元细胞8, 9. 本文详细描述了这些方法的具体操作步骤，包括去污剂缓冲液中的超速离心、蔗糖阶梯梯度沉降、凝胶过滤层析，以及利用基因5蛋白（g5p）富集iPrP（该蛋白可特异性结合结构发生改变的PrP形式）10，以及PK处理。这些方法的结合不仅可分离不溶性PrPSc 和 PrPC 聚集态和可溶性PrPC 来自正常人脑的寡聚体。由于此处描述的方案已被用于分离PrPSc 来自感染脑组织和iPrPC 来自未感染脑组织的样本使我们有机会比较两种异构体在理化特性、神经毒性及感染性方面的差异。此类研究将极大增进我们对传染性蛋白质病原体的理解。iPrP 的生理学与病理生理学C 目前尚不明确。值得注意的是，在一种新近发现的人类朊病毒病——称为可变性蛋白酶敏感性朊病毒病（variably protease-sensitive prionopathy）中，我们发现了一种新的 PrPSc 与iPrP具有相同的免疫反应性行为和片段化特征C 11, 12此外，我们最近证明了 iPrPC 是阿尔茨海默病中与淀粉样蛋白-β相互作用的主要物种13在同一项研究中，这些方法被用于分离阿尔茨海默病中的Aβ聚集体和寡聚体13，表明其可应用于其他神经退行性疾病中涉及的非朊病毒蛋白聚集体。

最近利用本文所述方法在未感染的人脑中鉴定出一种新的细胞型朊蛋白（PrPC）。这些方法可用于分离多种PrP蛋白亚型，其中部分方法还可用于从人脑中分离其他错误折叠的蛋白质聚集体。

正常人脑中可溶性与不可溶性PrP寡聚体的分离

朊病毒疾病发病机制的核心事件是宿主编码的细胞型朊蛋白 PrPC 转变为其致病性异构体 ...

本实验的目的是分离正常人脑中可溶性和不溶性pion蛋白或PRP所有韧带。首先通过匀浆人脑组织并分离组分来实现该目的，随后进行蔗糖阶梯梯度的速度沉降离心。然后进行凝胶过滤层析。最后，利用基因五号蛋白（gene five protein）或G5P捕获PRP。最终可获得结果，显示通过蔗糖阶梯密度梯度超速离心、凝胶过滤层析以及G5P捕获PRP等方法，从正常人脑中分离出可溶性和不可溶性PRP或韧带。该方法有助于解答朊病毒病研究中的关键问题，包括克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease）、牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy）及临床消耗性疾病。此外，该方法还可为可溶性和不可溶性蛋白质聚集物的分离提供见解，不仅适用于朊病毒病，也适用于阿尔茨海默病和帕金森病等其他疾病。通常，初次接触这些方法的研究人员会遇到困难，因为所有实验步骤都很关键，需要格外谨慎。该操作的视频演示至关重要，因为 SEC Fi 的深度要求很高，而使用 G five P 进行 PRP 捕获的步骤难以准确描述，若无更精确的操作则可能失败。制备脑组织匀浆时，首先将 100 µL 裂解缓冲液加入 100 mg 冻存的脑组织中，使用电动研磨棒在冰上进行匀浆，随后将样品在干冰上冷冻 5 分钟，再进行一次匀浆。分别加入 300 或 800 微升裂解缓冲液，制备 20% 或 10% 的全脑匀浆。使用台式离心机，在 4°C 条件下以 1000 G 离心 10 分钟。收集上清液，使用 S SW 55 转子，在 4°C 条件下以 35,000 RPM 离心 1 小时，分离 S1 组分。将上清液转移至一个干净的Resus管中。用裂解缓冲液重悬去垢剂不溶性沉淀，以制备用于蛋白质印迹的样品。将S2和P2组分在37摄氏度下与50微克/毫升的蛋白酶K孵育1小时。加入五毫摩尔的PMSF和SDS样品缓冲液以终止消化。将样品煮沸10分钟，然后在室温下静置5分钟。进行速度沉降时，首先将450微升20%S1组分与等体积的2% Triton X-100水溶液在冰上孵育30分钟，置于5毫升离心管中。分别加入0.5毫升的60%、30%、25%、20%、15%和10%蔗糖溶液，然后将0.4毫升孵育后的S1组分加至10%至60%蔗糖溶液的顶部。从管顶开始，在 SW 55 转子中以 48,000 RPM、4 摄氏度离心一小时，进行阶梯梯度离心。收集 12 个等体积组分，每份 283 微升。从每份组分中取 20 微升，并加入等体积的 SDS 样品缓冲液。为制备SDS-PAGE凝胶样品，将样品煮沸10分钟，然后冰浴4分钟。以1000 ×g离心样品1分钟。然后在将样品加载到预制凝胶过滤柱之前进行涡旋混匀。采用凝胶过滤层析法测定PRP分子的寡聚状态。首先，将七种不同分子质量标记物各200 µL样品体积加载到一根规格为1 × 30的SUEx 200 HR凝胶柱上。使用蓝色葡聚糖的洗脱体积作为空体积。根据色谱图和分级保留数据计算VE的洗脱峰体积。使用公式KAV = (V - V₀) / (VT - V₀) 计算分配系数KAV。为生成标准曲线，将蛋白质标准品的KAV值对其标准品的对数分子量作图。接下来，在0.25毫升/分钟的流速下，将200微升S1上样至层析柱中。用裂解缓冲液 1% cile 洗脱层析柱，并使用组分收集器收集 0.25 毫升的洗脱组分。取每管 125 微升与 500 微升预冷的甲醇在 -20 摄氏度下孵育 2 小时。在 4 摄氏度下以 13,000 G 离心样品 30 分钟。Reese，将沉淀物在 20 µL SDS 样品缓冲液中重悬，煮沸 10 分钟。冷却至室温后，在 15% 聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。利用标准曲线推算出各种回收的 PRP 组分的分子量，以将 G five P 分子偶联到磁珠上。将100微克G五P与350微升toci活化的磁珠在1毫升PBS中于37摄氏度孵育20小时。使用外置磁铁将G五P磁珠吸附至离心管管壁，移除上清液。用1毫升含0.1% BSA的PBS洗涤磁珠三次，以阻断非特异性结合。将G五P偶联的珠子在含有0.1% BSA的1毫升0.2摩尔Tris-HCl（pH 7.4）中于37摄氏度孵育5小时。随后将珠子洗涤三次。弃去最后一次洗涤液，加入1毫升PBS以分离PRP，在1毫升结合缓冲液中，将100微升S一或P二与60微升G五B偶联的珠子在室温下持续旋转孵育3小时。将试管置于磁架上，吸除溶液，用洗涤缓冲液清洗磁珠三次。最后一次洗涤后吸除上清液，加入SDS样品缓冲液。将珠子在 95 摄氏度下加热五分钟。将样品加入 15% 预制胶中，在 150 伏特下电泳约 80 分钟。用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 封闭膜后，在 70 伏特下将蛋白质转移至 PVDF 膜上，持续两小时。在室温下用 PRP 抗体孵育两小时。三种 F 四一 E 四抗 N 或抗 C，在与 HRP 标记的二抗孵育后，按照制造商说明书将膜与化学发光溶液孵育，并曝光胶片。与散发性克雅病（CRUT 瓣膜 jaakko 病，CJD）样本相比，在正常脑组织的 P 二组分中检测到少量不溶性细胞 PRP。然而，大部分PRP在S2组分中被回收。不溶性PRP约占总PRP的5%至25%，包括全长及C末端截短的亚型。利用蔗糖阶梯梯度沉降分析发现，尽管来自非克雅病（CJD）脑组织的大部分PRPC存在于上层组分中，但在通常含有大分子聚集体的底层组分（第9至11组分）中也检测到少量PRP。多种致病性PRP或PRPSc亚型，其大小从单体开始不等。通过CRUT阀 yakup 病的脑组织凝胶过滤分离出较小的韧带和较大的聚集体。令人惊讶的是，在正常脑组织的不溶性组分中也检测到少量分子量超过2000千道尔顿的较大聚集体。此外，PRPC的二聚体和四聚体不仅在不溶性组分中被检测到，也在不溶性组分中被发现。经 PK 和蛋白酶 NGAs 处理后，使用针对 PRP 97 1 0 5 3 的一抗 E 四抗体检测被 G 五 P 捕获的 PRP。检测到耐 PK 的核心片段，分别称为 PRP*20、PRP*19 和 PRP*7，其迁移位置分别为 20 千道尔顿、19 千道尔顿和 7 千道尔顿。然而，当 one E four 抗体与一段序列与 one E four 表位完全相同的合成肽段预先孵育时，未检测到 PRP，表明 one E four 检测到的条带为 PRP 片段。抗 C 抗体检测到两种不同的 PRP 片段，迁移位置分别约为 18 千道尔顿和 12 至 13 千道尔顿。此外，还包括 PRP ETE 20 Once 方法。如果操作得当，该技术可在四天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何在人脑下部发育后分离可溶性与不可溶性 PRP 多配偶体。该技术为研究脑内 PIP 构象信息之前体的命运奠定了基础。

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在正常人脑分离的可溶性和不溶性朊蛋白低聚物

本视频演示了使用密度梯度离心法和非淀粉样蛋白消化法从小鼠脑组织提取物中分离淀粉样纤维的实验方案。...

从脑组织提取物中分离淀粉样纤维

本视频介绍了从冷冻的死后人脑组织中分离和富集去垢剂不溶性蛋白聚集体的过程。视频展示了关键步骤，包括匀浆、去垢剂处理、超声处理和超速离心，以分离和纯化不溶性聚集体。最后一步是将聚集体溶解于尿素缓冲液中，以便进一步分析。...

从人死后脑组织中分离去污剂不溶性蛋白聚集体

一种使用尿素/硫脲/SDS缓冲液从人和小鼠脑组织中提取蛋白质的常用方法，可实现通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）对蛋白质进行鉴定，并随后通过微型二维电泳免疫印迹法（mini 2DE...

共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

本文介绍了一种从人死后脑组织中分离出溶解度逐渐降低/聚集态α-突触核蛋白（α-syn）的实验方案。通过使用去垢剂强度逐步增强的缓冲液，并结合高速超速离心技术，可检测病变与非病变组织中α-syn聚集特性的差异。...

从帕金森病患者脑组织中连续提取可溶性与不可溶性α-突触核蛋白

本文介绍一种脑膜分级分离方案，该方案是一种可靠的分离方法，可用于提取属于不同突触区室的蛋白质。...

脑膜组分分离：一种 离体 评估突触下蛋白定位的方法

本文描述了一种从人类尸检脑组织中富集去垢剂不溶性蛋白聚集体的简化分级分离方案。...

从人死后脑组织中富集去污剂不溶性蛋白聚集体

本文描述了一种从小鼠脑组织和细胞培养物中分离不溶性和可溶性突变亨廷顿蛋白亚型的方法。该方法可用于表征和定量亨廷顿蛋白的动态变化，有助于分析疾病发病机制中以及存在干扰因素时的蛋白质稳态。...

可溶性与不可溶性亨廷顿蛋白组分的分离纯化

来自人脑组织的分离脑毛细血管可作为临床前模型，用于研究生理和病理生理条件下血脑屏障的功能。本文中，我们介绍了一种从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的优化方案。...

从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管

本文介绍了一种分离大鼠脑微血管及制备膜样品的方法。该方案具有明显优势，可从单个动物获得蛋白质产量可观且微血管富集度高的样品。所得样品可用于对脑微血管内皮进行可靠的蛋白质分析。...

一种简单且可重复的制备新鲜分离大鼠脑微血管膜样本的方法

这种结合质谱法蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于对淀粉样纤维核心进行稳健表征，可能加速阿尔茨海默病防治靶点的发现。...

脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征

学习从正常人脑组织中分离可溶性和不溶性朊蛋白寡聚体的方法。本技术结合超速离心、蔗糖梯度沉降、尺寸排阻色谱和G5P蛋白捕获，为研究阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病中的蛋白质错误折叠机制提供重要实验基础。

正常人脑中可溶性与不可溶性PrP寡聚体的分离

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