在正常人脑分离的可溶性和不溶性朊蛋白低聚物

该程序的目的是分离正常人脑中的可溶性和不溶性 pion 蛋白或 PRP 所有韧带。这是通过首先匀浆人脑组织并分离组分来实现的。接下来在蔗糖中进行速度沉降，执行阶梯梯度。

然后进行尺寸排阻色谱。最后，PRP 被基因 5 蛋白或 G 5 P 捕获，最终可以获得结果，显示通过蔗糖超速离心、阶梯梯度、大小、排阻色谱和用 G 5 P 捕获 PRP 从正常人脑中分离可溶性和不溶性 PRP 或韧带。 包括产生进一步的豺病、BO 浮桥脑病和临床消耗性疾病。此外，它们还可以深入了解可溶性和不溶性蛋白质 OGA 的分离，不仅适用于离子疾病，还适用于阿尔茨海默病和帕金森病等其他疾病。

一般来说，刚接触这些方法的人会很挣扎，因为所有实验步骤都很重要，需要格外小心。该信息的视频演示至关重要，因为 SEC Fi 的深度很大，而 PRP 捕获具有 G 5 P，这些步骤很难命名，如果没有更精确的作，它可能是公平的。要制备脑匀浆，首先使用电动杵将 100 微升裂解缓冲液添加到 100 毫克冷冻脑组织中，在冰上匀浆组织，在干冰上冷冻 5 分钟，然后再次匀浆。

通过分别加入 300 或 800 微升裂解缓冲液，制备 20% 或 10% 的总脑匀浆。使用台式离心机，在 4 摄氏度下以 1000 G 离心匀浆 10 分钟。在 S SW 55 转子中收集 SNA，在 4 摄氏度下以 35， 000 RPM 的速度离心 S 一级分 1 小时。

将旋后物转移到干净的管 Resus 中。将去污剂不溶性沉淀悬浮在裂解缓冲液中，以制备用于 western 印迹的样品。将 S 2 和 P 2 级分与 50 μg/mL 蛋白酶 K 在 37 摄氏度下孵育 1 小时。

通过添加 5 毫摩尔 PMSF 和 SDS 样品缓冲液终止消化。将样品煮沸 10 分钟，然后在室温下加热 5 分钟要进行快速沉降，首先将 450 微升 20% S 馏分与等体积的 2% Sarco X 水在冰上孵育 30 分钟，然后放入 5 毫升离心管中。在 10% 至 60% 蔗糖的顶部加入 60%、30%、25%、20%、15 和 10% 蔗糖上量 0.4 毫升培养箱 S 1。

分级梯度在 SW 55 转头中以 48， 000 RPM 的转速在距管顶部 4 °C 下离心 1 小时。收集 12 个相等的馏分，每个 283 微升。从每个馏分中使用 20 微升和等体积的 SDS 样品缓冲液。

制备 SDS 页面凝胶样品。将样品煮沸 10 分钟，然后叫 4 分钟。将样品以 1000 G 离心 1 分钟。

然后，在将它们加载到预制凝胶尺寸排除上之前，将它们涡旋。色谱法用于确定 PRP 分子的寡聚状态。首先，将 7 个单独分子量标准品的 200 微升样品体积上样到 1 x 30 柱的 SUEx 200 HR 微珠上。

使用蓝色葡聚糖的 elucian 体积作为空隙体积。从色谱图和保留分数计算 VE 的峰 Elucian 体积。使用方程 KAV 等于 V 减去 V 零超过 VT 减去 V 零来计算 KAV 分配系数。

生成校准曲线。绘制蛋白质标准品的 KAV 与标准品的对数分子量的关系图。接下来，以每分钟 0.25 mL 的流速将 200 μL S one 添加到色谱柱中。

用 1% cile 裂解缓冲液洗涤色谱柱，并使用馏分收集器洗脱 0.25 ml 馏分。将每个馏分的 125 μL 与 500 μL 预冷甲醇在零下 20 摄氏度下孵育 2 小时。将样品在 4 摄氏度下以 13， 000 G 离心 30 分钟。

Reese，将沉淀在 20 μL SDS 样品缓冲液中弯曲，煮沸 10 分钟。调用至室温并在 15% 聚丙烯酰胺凝胶上分离。使用标准曲线推断各种回收的 PRP 物质的分子量，以将 G 5 P 分子偶联到磁珠上。

将 100 μg G 5 P 与 350 μL toci 活化磁珠在 1 mL PBS 中于 37 °C 下孵育 20 小时。使用外部磁铁将 G 5 P 微珠吸引到 eppendorf 管的侧壁上，并去除溶液。用 1 毫升 PBS 0.1% BSA 洗涤珠子 3 次，以阻断非特异性结合。

将 G 5 P 偶联珠子放入 1 毫升含 0.1% BSA 的 0.2 molo tris、HCL pH 7.4 中，在 37 摄氏度下孵育 5 小时。然后将珠子清洗 3 次。去除最后一次洗涤液，加入 1 毫升 PBS 以分离 PRP，将 100 微升 S 1 或 P 2 与 60 微升 G、5 B 偶联珠放入 1 毫升结合缓冲液中，在室温下孵育 3 小时。

将管子放在磁铁上。去除溶液并用洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。去除最终洗涤液并加入 SDS 样品缓冲液。

将珠子在 95 摄氏度下加热 5 分钟。将样品上样到 15% 预制胶上，并在 150 伏电压下运行约 80、80 分钟。在 TBST 中的 5% 牛奶中封闭膜后，将蛋白质转移到 70 伏特的 PVDF 中 2 小时。

在室温下与 PRP 抗体一起孵育 2 小时。三、F、四、一 E、四抗、抗 N 或抗 C，与 HRP 偶联的二抗孵育后，根据制造商的说明孵育膜和化学发光溶液，并暴露薄膜，如此处所示，与散发的 CRUT 瓣膜、jaakko 病或 CJD 样品相比。在正常大脑的 P 2 级分中检测到少量不溶性细胞 PRP。

然而，大多数在 S 2 馏分中回收。不溶性 PRP 约占总 PRP 的 5% 至 25%，包括使用蔗糖阶梯梯度沉淀的全长和末端末端截短物质分析表明，虽然来自非 CJD 大脑的大部分 PRPC 在顶部组分中回收，但在通常含有大聚集体的底部组分 9 11 中也检测到 1 个三个小量的 PRP。多种致病性 PRP 或 PRP SC 物种，范围从单体。

在 CRUT 瓣膜牦牛病的大脑中通过凝胶过滤分离出较小的韧带和较大的聚集体。令人惊讶的是，在正常大脑的不溶性部分中也检测到了少量分子尾流大于 2000 道尔顿的较大聚集体。此外，PRPC 的二聚体和四聚体不仅在不溶性级分中检测到，而且在不溶性级分中也检测到。

PK 和 P NGA 治疗后。用抗 PRP 97 1 0 5 3 的 one E four 抗体检测 G 5 P 捕获的 PRP。在 20 个杀手 Dawsons 19 千道尔顿和 7 千道尔顿处检测到称为 PRP 星号 20 、 PRP 星号 19 和 PRP 星号 7 的 PK 抗性核心片段。

然而，当 one E four 抗体与序列与 one E 4 表位相同的合成肽预孵育时，未检测到 PRP，这表明 1 E 4 检测到的条带是 PRP 片段。抗 C 抗体检测到两种不同的 PRP 片段，分别在大约 18 道尔顿和大约 12 到 13 道尔顿处迁移。除了 PRP ETE 20 一次方法。

如果执行得当，这项技术可以在四天内完成。看完这个视频，你应该对如何分离下脑中可溶性和不溶性 PRP 一夫多妻制发育后有一个很好的了解。这项技术为在探索大脑中的 PIP 确认信息之前的命运研究铺平了道路。