Name: 单细胞分析枯草芽孢杆菌生物膜，用荧光显微镜和流式细胞仪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 学习使用荧光显微镜和流式细胞仪对枯草芽孢杆菌生物膜进行单细胞分析的方法。该技术利用转录报告基因可视化并定量细胞亚群，为研究微生物群落结构提供了重要工具。

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本研究由维尔茨堡大学传染病研究中心（ZINF）的青年研究人员项目资助。Juan C Garcia-Betancur 是维尔茨堡大学生命科学研究生院（GSLS）的博士生。

1. 标记B. subtilis及生物膜形成实验
<ol>
 <li>通过PCR扩增目的基因的启动子区域。我们以PtapA的克隆为例，该启动子调控负责产生TasA基质蛋白的基因26。将PtapA克隆至pkm008载体中（由美国波士顿哈佛医学院Rudner实验室构建）（图2）。</li>
 <li>通过酶切消化线性化质粒（推荐使用XhoI酶）。</li>
 <li>按照Harwood和Cutting先前描述的一步法协议，诱导枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168菌株的自然感受态27。</li>
 <li>将线性化质粒加入感受态细胞培养物中，孵育2小时后筛选壮观霉素抗性菌株。</li>
 <li>获得的菌株通过双交换重组将构建体插入到枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的中性amyE 位点（图4）。为构建双标记菌株，使用图3所示的质粒pDR183，将第二个报告基因整合至中性位点lacA。采用上述用于pKM008克隆报告基因插入的相同技术进行该报告基因的插入。</li>
 <li>通过SPP1噬菌体转导协议28,29，将报告基因从168菌株转移至能够形成生物膜的NCIB3610菌株。在TY培养基（LB+10 mM MgSO4+10 μM MnSO4）中培养供体菌株。取200 μl培养物与100 μl噬菌体储存液稀释液混合。孵育30分钟后加入3 ml软琼脂，于37 °C培养使噬菌斑形成。</li>
 <li>收集软琼脂，离心后将上清液经0.22 μm滤膜过滤。用此上清液感染在TY培养基中培养的受体菌株培养物（取30 μl加入10 ml、1:10稀释的培养物中）。孵育30分钟，24小时后筛选抗生素抗性菌株。</li>
 <li>挑取单菌落，在LB培养基中37 °C过夜培养。</li>
 <li>取3 μL过夜培养物点种于含1.5%琼脂的固体生物膜诱导培养基MSgg上30。于30 °C培养72小时（图3）。培养三天后，MSgg琼脂表面形成的生物膜在琼脂表面展现出复杂的形态结构。</li>
</ol>
2. 生物膜分散与细胞固定
<ol>
 <li>使用牙签或镊子从MSgg琼脂表面去除生物膜。生物膜的质地应能使其以完整的一片从琼脂表面剥离。</li>
 <li>将生物膜置于3 ml PBS缓冲液中，通过反复吹打移液管或针头使其分散。或者，可采用温和超声处理进行生物膜分散。温和超声处理需设置为12次脉冲，输出功率为3，振幅持续0.7秒。</li>
 <li>在进行单细胞分析前固定样品。将300 μL细胞悬液重悬于1 ml 4%多聚甲醛溶液中，并在室温下孵育恰好七分钟。 
 4%多聚甲醛溶液的配制成分： 
 2 g 多聚甲醛 
 50 ml PBS缓冲液 
 4 μl 10 N NaOH 
 通过0.22 μm滤膜过滤溶液并分装</li>
 <li>固定后用PBS缓冲液洗涤细胞三次，然后将其重悬于300 μL PBS缓冲液中。</li>
</ol>
3. 荧光显微镜
<ol>
 <li>倒入 200 μL 在载玻片上铺一层0.8%琼脂糖，然后轻轻盖上另一张载玻片。2分钟后轻柔地移除上层载玻片，以获得附着在底部载玻片上的一层琼脂糖。</li>
 <li>斑点 2 μL 在琼脂糖层表面固定细胞，并用显微镜盖玻片覆盖。</li>
 <li>将样品置于荧光显微镜下观察。我们使用配备 Leica CRT6000 照明系统的 Leica DMI6000B 荧光显微镜。YFP 的滤光片参数为：激发光 Ex: BP500/20，发射光 Em: BP535/30；CFP 的滤光片参数为：激发光 Ex: BP426/20，发射光 Em: 480/40</li>
 <li>暴露您的样品 将激发荧光时间设定在50-200毫秒之间。根据阴性对照设置激发时段，阴性对照在实验所选条件下应无荧光信号。</li>
 <li>将荧光图像与明场下获得的同一图像进行对照。将两幅图像合并为一张图片。通过流式荧光显微镜使用携带报告基因P的单标记菌株获得的结果tapA-YFP 在图6中展示。</li>
</ol>
4. 使用流式细胞术对单细胞进行定量分析
<ol>
 <li>使用轻度超声处理分散固定后的细胞样品。对样品进行两轮、每轮12次脉冲的超声处理，输出功率设为5，振幅持续0.7秒，以将细胞团块分散为单个细胞，同时避免细胞裂解。通过光学显微镜观察确认细胞分散效果。</li>
 <li>在进行流式细胞术分析前，用PBS缓冲液将样品按1:100稀释。我们使用的流式细胞仪为BD FACS Canto II。对于YFP荧光检测，采用488 nm激光激发，搭配530/30滤光片；对于CFP荧光检测，采用405 nm激光激发，搭配408/40滤光片。</li>
 <li>使用两个阴性对照对流式细胞仪进行校准。不含悬浮细胞的PBS缓冲液样品应作为流式细胞仪检测颗粒大小的阴性对照；未标记荧光报告分子的样品应作为流式细胞仪荧光灵敏度的阴性对照。</li>
 <li>将标记有荧光报告分子的样品放入流式细胞仪中。对每个样品，至少分析50,000个事件，流速控制在每秒300至3000个事件之间。</li>
 <li>使用FACS Diva软件（BD Biosciences）采集数据，并用FlowJo 8.5.2软件进行分析。将荧光信号相对于无荧光表达的对照样品进行归一化参考。</li>
 <li>以双轴图形式展示单标记菌株的荧光信号数据。横轴（X轴）表示检测到的荧光信号强度，纵轴（Y轴）表示表达不同荧光水平的细胞数量。使用携带报告基因PtapA-YFP的单标记菌株进行流式细胞术分析所得结果如图8所示。</li>
 <li>以三轴图形式展示双标记菌株的荧光信号数据。将所监测的两个通道的荧光信号分别绘制在X轴和Y轴上（例如，GFP信号在X轴，CFP信号在Y轴），Z轴表示表达各报告分子的细胞数量，并以垂直于纸平面的等高线形式呈现（图9和图10）。</li>
</ol>
4. 典型结果
当 B. subtilis 在生物膜诱导培养基 MSgg 平板上于 30 °C 培养 3 天后，可观察到生物膜的形成30。该生物膜结构致密，能够以完整的一片从琼脂表面剥离。此外，生物膜呈现出复杂的形态结构，表明其中存在不同的细胞亚群（图 5）。例如，生物膜中胞外基质的产生会导致菌落表面形成皱褶，这一特征可与基质产生亚群细胞的分化相关联19。同样，生物膜表面形成气生结构提示存在孢子形成亚群细胞，因为孢子定位于这些结构的顶端区域30。
图6和图7分别展示了使用荧光显微镜观察单标记和双标记菌株中细胞分化的示例。单标记菌株携带荧光报告基因PtapA-CFP，该报告基因在产生基质的细胞亚群中表达。该亚群负责产生并分泌构成生物膜的胞外基质（图6）。双标记菌株携带报告基因PtapA-CFP26以及额外的报告基因PsrfAA-YFP31。第二个报告基因可用于监测负责分泌信号分子表面活性素（surfactin）的细胞亚群，该信号分子可触发信号级联反应，从而诱导基质产生细胞的分化（图7）。基质产生细胞亚群以伪蓝色显示，而表面活性素产生细胞亚群以伪黄色显示。
图8展示了使用携带报告基因PtapA-YFP的单标记菌株进行的流式细胞术分析。未携带任何荧光蛋白基因的未经处理对照菌株仅显示一个相对荧光强度较低的单一菌群。在非生物膜诱导条件下，携带PtapA-YFP的细胞未分化出基质产生亚群，整个菌群均表现为较低的相对荧光强度。而在生物膜诱导条件下，出现了一个相对荧光强度较高的细胞亚群，表现为低相对荧光峰右侧的一个肩峰23。
使用双标记菌株进行流式细胞术分析所得结果如图9和图10所示。图9利用双标记菌株PtapA-CFP, PsrfAA-YFP监测了基质产生亚群和表面活性素产生亚群。以不含任何荧光蛋白基因的菌株作为空白荧光对照。接着，我们使用单标记菌株作为对照，在每个荧光通道中分别检测基质产生亚群和表面活性素产生亚群。双标记菌株PtapA-CFP, PsrfAA-YFP显示出两个表达高水平荧光报告基因的细胞亚群。每个亚群均被框出，表明在两种特化细胞亚群之间，荧光报告基因的表达无重叠15。类似地，使用双标记菌株Pskf-YFP, PtapA-YFP的流式细胞术分析结果如图10所示。skf基因的报告基因用于监测“食同类者”亚群的分化32，该亚群已被报道与基质产生亚群协同分化24。在此情况下，双标记菌株显示出单一的荧光细胞亚群，同时表达YFP和CFP，表明这两种细胞分化通路在同一亚群中被协同激活。
<img alt="枯草芽孢杆菌生物膜研究；荧光标记；显微镜，流式细胞术；微生物分析示意图。" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 实验总体方案。 本实验方案分为三个主要步骤。第一步需用报告基因融合系统对枯草芽孢杆菌（B. subtilis）菌株进行标记，以监测目标亚群；第二步，在诱导生物膜形成的条件下培养标记后的菌株；第三步，将生物膜分散，并利用荧光显微镜和流式细胞术对菌群进行单细胞分析。
<img alt="质粒图谱示意图，pKM008，限制性酶切位点，基因位置，重组DNA过程。" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 整合载体pKM008的示意图。 该载体通过双交换重组将目标报告基因融合片段整合到中性位点amyE。将目标启动子（PtapA）利用限制性酶切位点EcoRI和HindIII克隆至载体中。随后，cfp基因的表达由启动子PtapA调控。质粒中基因的方向以箭头表示。
<img alt="显示 pDR183 结构的质粒图谱；限制性酶切位点和抗性基因（示意图）" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
 图 3. 整合载体 pDR183 的示意图。 该载体通过双交换重组将目标报告基因融合片段整合到中性位点 lacA。目标融合片段（PtapA-cfp）通过限制性酶切位点 EcoRI 和 BamHI 克隆至载体中。质粒中基因的方向以箭头表示。
<img alt="CRISPR 基因编辑过程，展示 DNA 整合与质粒图谱；分子示意图。" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 报告基因通过双交换重组整合至 B. subtilis 染色体的示意图。（A） B. subtilis 染色体含有两个中性位点 amyE 和 lacA，可用于整合报告基因融合片段，且不影响生物膜的发育。（B） pKM008 质粒的双交换重组过程。线性化质粒通过双交换重组整合至 B. subtilis 基因组中，报告基因融合片段以稳定方式整合至中性位点。
<img alt="Bacterial gene expression study, Bacillus subtilis with fluorescent markers, microscopy image." src="/files/ftp_upload/3796/3796fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 生物膜的形成 B. subtilis NCIB3610 菌株生物膜形成的进程 B. subtilis NCIB 3610 在 MSgg 生物膜诱导培养基中于 37°C 培养三天时 30 °C每隔12小时拍摄一次生物膜发育的连续图像。
<img alt="B. subtilis 显微镜图像；基因表达，荧光标记，细菌菌株鉴定。" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 在荧光显微镜下观察基质产生亚群。 采集 B. subtilis PtapA-cfp 生物膜的样品，固定后在荧光显微镜下观察。经 200 ms 荧光激发后，可见一部分细胞发出的荧光强于其他细胞。我们将该细胞亚群视为基质产生细胞亚群。比例尺为 3 μm。
<img alt="细菌基因表达示意图，用荧光蛋白标记的枯草芽孢杆菌用于启动子活性分析。" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 在荧光显微镜下观察基质产生亚群和表面活性素产生亚群。 对生物膜中双标记菌株 B. subtilis P tapA-cfp、PsrfAA-yfp 的样品进行固定，并在荧光显微镜下观察。250 ms 的曝光时间显示出两个荧光强度高于其他细胞的亚群。其中一个亚群表达 YFP，仅通过 YFP 通道检测到（伪彩色显示为黄色），此为表面活性素产生亚群；另一亚群表达 CFP，仅通过 CFP 通道检测到，此为基质产生亚群。比例尺为 3 μm。
<img alt="在不同生物膜条件下枯草芽孢杆菌荧光的流式细胞术图谱。" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 8"> 
图 8. 利用二维流式细胞术定量分析基质产生亚群。 通过流式细胞术检测枯草芽孢杆菌 B. subtilis PtapA-yfp 生物膜分散后的细胞。流式细胞仪记录了 50,000 个事件，每个事件的荧光信号均被监测。Y 轴表示计数的细胞数量，X 轴表示 YFP 信号强度。细胞在 LB 培养基中培养以获得非诱导生物膜形成的条件，在 MSgg 培养基中培养以获得诱导生物膜形成的条件。基质产生亚群仅在诱导生物膜形成的条件下发生分化。本图改编自 López et al., PNAS (2009) 106:280-285。
<img alt="分析不同启动子条件下CFP和YFP通道基因表达的流式细胞术图谱。" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图9"> 
图9. 利用三维流式细胞术定量分析基质产生亚群和表面活性素产生亚群。 所监测通道的荧光信号显示在X轴（YFP）和Y轴（CFP）。Z轴表示表达各报告基因的细胞数量，以垂直于纸面的等高线形式量化。本实验监测的事件数为50,000个。左上图显示不含荧光蛋白基因的背景荧光对照。右上图使用单标记菌株PsrfAA-YFP，在YFP荧光通道中检测表面活性素产生亚群（黄色框内）。左下图使用单标记菌株PtapA-CFP，在CFP荧光通道中检测基质产生亚群（蓝色框内）。右下图监测双标记菌株PtapA-CFP, PsrfAA-YFP，显示出两个亚群，分别用黄色和蓝色框标出。本图改编自López et al., Genes and Development (2009) 23:1631-1638。
<img alt="CFP 与 YFP 荧光散点图；基因表达分析；象限；P&lt;sub&gt;skf&lt;/sub&gt;yfp, P&lt;sub&gt;tapA&lt;/sub&gt;-cfp。" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图10"> 
图10. 利用三维流式细胞术定量分析基质产生亚群与食同类细胞亚群。 监测的荧光通道信号显示在X轴（YFP）和Y轴（CFP）上。本实验监测的事件数量为50,000。右上图显示在单标记菌株Pskf-YFP中，YFP荧光通道检测到的食同类细胞亚群（黄色框内）。左下图显示在单标记菌株PtapA-CFP中，CFP荧光通道检测到的基质产生细胞亚群（蓝色框内）。双标记菌株PtapA-CFP, Pskf-YFP仅在X轴与Y轴对角线上显示一个细胞亚群（绿色框内）。该亚群因同时表达两种报告基因，故在YFP和CFP通道中均可检测到。López et al., Genes and Development (2009) 23:1631-1638。

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我们没有需要披露的内容。

细菌群落中存在表达特定基因组合的细胞亚群，这一事实表明了微生物群落的复杂性33,34。本方案有助于确定任何目的基因的表达是否局限于微生物群落内特定的特化细胞亚群。由于传统基因表达监测方法或微阵列分析仅能评估整个微生物群落的基因表达水平，通常无法捕捉群落内部基因表达的波动，因此可视化这些亚群需要开发新技术。
荧光显微镜与流式细胞术在细胞类型分析中具有理想的互补性，可结合提供定性与定量信息，从而明确目标亚群的特征。两种技术各自的局限性使得它们在确保测量准确性方面需要相互参照。以荧光显微镜为例，荧光细胞信号的强度（有时还包括亚群的大小）会因激发样品所用曝光时间的不同而变化（通常在50至200毫秒之间）。而对于流式细胞术而言，细菌细胞体积较小限制了检测灵敏度，部分细菌无法被有效监测。由于细胞尺寸的限制，报告基因所发出的荧光信号必须足够强才能被检测到；正因如此，我们在检测低表达水平报告基因的细胞时曾遇到困难。然而，目前新型流式细胞仪具备更高的检测灵敏度，使我们能够更精确地监测细菌群体。此外，检测限的进一步提高还将使细胞分选分析成为可能，从而分离出我们感兴趣的目标细胞亚...

使用荧光显微镜和流式细胞术对 bacillus subtilis 生物膜进行单细胞分析

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

生物膜的形成几乎是所有细菌的普遍特性 1-6。当细菌形成生物膜时，细胞被包裹在主要由蛋白质和胞外多糖以及其他因子组成的胞外基质中7-10。包裹在生物膜内的微生物群落通常会分化出具有特定功能的不同亚群细胞11-17。这些亚群在生物膜内共存，并通常表现出空间和时间上的有序结构 18-21。
模式生物Bacillus subtilis中的生物膜形成需要分化出具有特定功能的细胞亚群。其中，基质产生亚群负责产生并分泌生物膜的胞外基质，对生物膜的形成至关重要11,19。因此，基质产生细胞的分化是B. subtilis生物膜形成的一个标志性特征。
我们利用荧光报告基因来观察并量化B. subtilis生物膜中基质产生细胞的亚群15,19,22-24。具体而言，我们发现基质产生亚群会响应自身产生的胞外信号分子表面活性素而发生分化25。有趣的是，表面活性素由一类特化的细胞亚群产生，该亚群不同于基质产生细胞亚群15。
本报告详细阐述了在生物膜中可视化和量化基质产生亚群及表面活性素产生亚群所需的技术方法 B. subtilis将用于基质生成和表面活性素生成的基因的荧光报告系统插入染色体中 B. subtilis报告基因仅在特定细胞的亚群中表达。随后，可利用荧光显微镜和流式细胞术对这些亚群进行监测（见图1）。
在细菌多细胞群体中，不同特化细胞亚群共存的现象，使我们对原核生物基因表达调控有了新的认识。本实验方案针对这一现象进行研究，可轻松适配于其他任何研究模型，以阐明微生物群落内表型异质性的分子机制。

微生物生物膜通常由不同类型的特化细胞亚群构成。对这些亚群进行单细胞分析需要使用荧光报告系统。本文中，我们描述了一种利用荧光显微镜和流式细胞术对B. subtilis生物膜中的多个亚群进行可视化和监测的实验方案。

使用荧光显微镜和流式细胞术对 Bacillus subtilis 生物膜进行单细胞分析

生物膜的形成几乎是所有细菌的普遍特性1-6。当细菌形成生物膜时，细胞被包裹在主要由胞外基质组成的环境中，该基质大多包含...

本实验的总体目标是观察并量化模式生物枯草芽孢杆菌（bacillus subtles）生物膜中分化出的不同特化细胞亚群。首先将转录报告基因插入枯草芽孢杆菌（B. subtles）的染色体中，从而实现这一目标。这些报告基因仅在待研究的细胞亚群中特异性表达。下一步是通过在生物膜诱导培养基Ms GG gg中培养枯草芽孢杆菌（B. subtiles），促进生物膜的发育。在生物膜形成后，将生物膜中的细胞分散并用多聚甲醛固定。该实验流程的最后一步是利用荧光显微镜和流式细胞术检测微生物群落中单个细胞发出的荧光信号。最终，实验结果揭示了产生和分泌生物膜所含胞外基质的细胞，与分泌作为信号分子的表面活性物质、从而促使基质产生细胞亚群分化的细胞，属于不同的亚群。该技术相较于现有方法（如利用活力测定或微阵列分析进行转录表达量化的技术）的主要优势在于，它能够使我们以单细胞水平监测基因表达，并可视化那些特异性表达特定基因的、数量极少的细胞亚群。在分析整个群体时，这些基因表达将无法被检测到。整合型质粒可用于标记枯草芽孢杆菌，此处展示了一个示例。PTAA 是负责合成塔辛（tass）的基因的启动子。利用限制性酶切位点 Eco R I 和 Hind III 将基质蛋白基因克隆至载体中。CFP 报告基因的表达现由 ptap A 启动子控制。为开始对 B. subtilis 进行标记，首先通过酶切使整合型质粒线性化。推荐使用的限制性内切酶为 Xho I。当整合型质粒准备就绪后，通过在 37 摄氏度下于感受态诱导培养基中培养细胞 5 小时，诱导 B. subtilis 168 菌株的自然感受态。将线性化的质粒加入感受态 B. subtilis 细胞培养物中，37 摄氏度孵育 2 小时。2 小时后，将细胞涂布于含壮观霉素的琼脂平板上，37 摄氏度过夜培养。B. subtilis 染色体含有两个中性位点 AmyE 和 LAC A，可用于整合报告基因融合片段，而不会影响生物膜的发育。线性化的 pKM008 质粒通过双交换重组整合到 B. subtilis 基因组中。下一步是使用 SPP1 噬菌体转导方案，将报告基因从标记菌株转移到能够形成生物膜的菌株中。本视频仅展示该方案中的关键步骤。在 37 摄氏度下，于 TY 培养基中培养携带报告基因融合的供体菌株 168，直至培养物进入早期静止期，然后将 200 微升菌液与 100 微升稀释的噬菌体原液加入玻璃试管中。在37°C下静置15分钟。接下来，将预热的TY软琼脂加入试管中，通过涡旋充分混匀。轻轻涂布于新鲜的TY平板上，于37°C培养8至16小时，使噬菌体晕圈形成。为收集噬菌斑晕圈，向平板中加入三毫升 TY 培养基，用玻璃移液管将顶层琼脂打碎。将琼脂悬液转移至 15 毫升离心管中。轻轻涡旋以彻底分散琼脂，随后在 1000 ×g 条件下离心 15 分钟。将上清液转移至新离心管中。使用0.22微米针筒滤器过滤上清液。用此上清液感染在TY培养基中培养的受体菌株。取30微升上清液加入已稀释1:10的10毫升培养液中，于37摄氏度孵育30分钟。随后在5,000 RPM条件下离心7分钟，将沉淀重悬于200微升TY培养基中，并涂布于含有SPECTinomycin及10毫摩尔柠檬酸钠的平板上。在 37 °C 下孵育 12 至 36 小时。挑选单菌落，在液体 LB 培养基中于 37 °C 过夜培养。最后，取 3 µL 过夜培养物点种于固体生物膜诱导培养基上。将细胞在30摄氏度下培养72小时。经过三天的生长后，生物膜将在Ms.GG琼脂表面形成复杂的形态结构。开始此操作时，使用牙签或镊子从MSGG琼脂表面移除生物膜。生物膜的质地应能够使其从琼脂表面完整剥离。将生物膜置于3 mL PBS缓冲液中，轻轻分散。在进行单细胞分析前，以输出功率3、振幅0.7秒进行12次脉冲处理，以固定样品。重悬沉淀，将细胞悬浮液用1毫升含4%多聚甲醛的溶液重悬，于室温下准确孵育7分钟。7分钟固定完成后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次。最后，在进行荧光显微镜观察前，将细胞重悬于300微升PBS缓冲液中。用移液器吸取200微升0.8%琼脂糖溶液滴加到载玻片上，然后小心地用另一张载玻片覆盖。两分钟后，轻轻移除上层载玻片，使底部载玻片表面形成一层附着的琼脂糖层。取2微升固定好的细胞滴加在琼脂糖层表面，并用显微镜盖玻片覆盖。将样品置于荧光显微镜的载物台上。根据阴性对照设置激发时间，阴性对照在所选实验条件下应无荧光信号。曝光时间应为 50 至 200 毫秒之间。对每个视野分别采集荧光图像和明场图像。为进行流式细胞术分析，通过轻度超声处理将固定后的细胞样品分散。以五的输出功率和0.7秒的振幅，进行两轮各12次脉冲处理，以将细胞团块分散为单个细胞，同时避免细胞裂解。通过光学显微镜确认细胞分散的效率。随后，用 PBS 缓冲液将样品稀释至 1:100。本实验将使用 BD FACS Canto 两型流式细胞仪检测 YFP 荧光。使用488纳米激光激发并结合530/30滤光片检测CFP荧光。使用405纳米激光激发并结合408/40滤光片，并用两个阴性对照校准流式细胞仪。不含细胞的PBS缓冲液样品可作为流式细胞仪检测颗粒大小的阴性对照。不含荧光报告分子的样品应作为流式细胞仪荧光灵敏度的阴性对照。校准后，将标记有荧光报告分子的各样品置于流式细胞仪中，以每秒303,000个事件的流速分析至少50,000个事件。当枯草芽孢杆菌（B. subtilis）在生物膜诱导培养基（MSGG）平板上生长时，在30摄氏度下培养三天后可观察到生物膜的形成。生物膜呈现出复杂的形态结构，表明其中存在不同的细胞亚群。例如，胞外基质和生物膜的产生会导致菌落表面形成皱褶。该图展示了利用荧光显微镜对单标记菌株中的细胞分化进行可视化的一个示例。该菌株携带荧光报告基因 Ptap，一种在产生基质的细胞亚群中表达的 CFP，这些细胞以蓝色显示。该亚群产生并分泌构成生物膜的胞外基质。下一张图像为双重标记菌株的荧光显微镜观察结果，该菌株携带报告基因 Ptap（CFP）以及额外的报告基因 P Surfactin YFP。这种第二种报告系统可用于监测负责分泌信号分子表面活性素的细胞亚群，该信号分子可触发基质产生细胞分化的信号级联反应。在此图像中，基质产生细胞以蓝色伪彩显示，而表面活性素产生细胞以黄色伪彩显示，结果来自使用携带报告基因 ptap 的单标记菌株进行的二维流式细胞术分析。此处展示的是一个YFB。未处理的对照菌株不含任何荧光蛋白基因，显示出单一的低相对荧光细胞群，这些细胞携带ptap。在非生物膜诱导条件下，YFP未能区分基质产生亚群，整个群体也表现出低相对荧光。相反，在生物膜诱导条件下，检测到一群具有高相对荧光的细胞亚群，表现为低相对荧光峰右侧的一个肩峰。此处展示了通过三维流式细胞术获得的峰值结果。监测的荧光通道信号在X轴显示YFP，Y轴显示CFP；左上方面板显示了不含荧光蛋白基因的菌株，用作背景荧光的对照。右上方面板中，使用单一标记菌株检测在黄色框出的YFP荧光通道中表面活性素生产亚群。在左下方面板中，使用了另一种单标记菌株来检测基质产生亚群。在用蓝色框出的CFP荧光通道中，利用双标记菌株监测基质产生亚群和表面活性剂产生亚群，并展示了结果，如右下方面板所示。检测到两个表达高水平荧光报告基因的细胞亚群。每个亚群均被框出，显示这两种特化细胞亚群之间的报告基因表达无重叠。该最终图示展示了通过三维流式细胞术对基质产生细胞和食同类细胞亚群进行的定量分析结果。在右上方图中，使用单一标记菌株来检测食同类亚群。在黄色框出的YFP荧光通道中，该食同类亚群已被描述为与基质产生亚群协同分化。在左下方图中，通过另一种单一标记菌株的CFP荧光通道检测基质产生亚群。在右下角的图板中，用蓝色框出的双标记菌株结果显示，存在一个单一的亚群，其荧光细胞同时表达被绿色框出的YFP和CFP。两种报告基因的同步表达表明，这两个细胞分化通路在同一亚群中被协调激活。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用细胞群体分析方法（如荧光显微镜或流式细胞术）对构成微生物生物膜的不同细胞亚群进行可视化和定量分析。

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Immunology and Infection

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