使用荧光显微镜和流式细胞术对 Bacillus subtilis 生物膜进行单细胞分析

本实验的总体目标是观察并量化模式生物枯草芽孢杆菌（bacillus subtles）生物膜中分化出的不同特化细胞亚群。首先将转录报告基因插入枯草芽孢杆菌（B. subtles）的染色体中，从而实现这一目标。这些报告基因仅在待研究的细胞亚群中特异性表达。

下一步是通过在生物膜诱导培养基Ms GG gg中培养枯草芽孢杆菌（B. subtiles），促进生物膜的发育。在生物膜形成后，将生物膜中的细胞分散并用多聚甲醛固定。该实验流程的最后一步是利用荧光显微镜和流式细胞术检测微生物群落中单个细胞发出的荧光信号。

最终，实验结果揭示了产生和分泌生物膜所含胞外基质的细胞，与分泌作为信号分子的表面活性物质、从而促使基质产生细胞亚群分化的细胞，属于不同的亚群。该技术相较于现有方法（如利用活力测定或微阵列分析进行转录表达量化的技术）的主要优势在于，它能够使我们以单细胞水平监测基因表达，并可视化那些特异性表达特定基因的、数量极少的细胞亚群。

在分析整个群体时，这些基因表达将无法被检测到。整合型质粒可用于标记枯草芽孢杆菌，此处展示了一个示例。PTAA 是负责合成塔辛（tass）的基因的启动子。

利用限制性酶切位点 Eco R I 和 Hind III 将基质蛋白基因克隆至载体中。CFP 报告基因的表达现由 ptap A 启动子控制。为开始对 B. subtilis 进行标记，首先通过酶切使整合型质粒线性化。推荐使用的限制性内切酶为 Xho I。当整合型质粒准备就绪后，通过在 37 摄氏度下于感受态诱导培养基中培养细胞 5 小时，诱导 B. subtilis 168 菌株的自然感受态。

将线性化的质粒加入感受态 B. subtilis 细胞培养物中，37 摄氏度孵育 2 小时。2 小时后，将细胞涂布于含壮观霉素的琼脂平板上，37 摄氏度过夜培养。B. subtilis 染色体含有两个中性位点 AmyE 和 LAC A，可用于整合报告基因融合片段，而不会影响生物膜的发育。线性化的 pKM008 质粒通过双交换重组整合到 B. subtilis 基因组中。

下一步是使用 SPP1 噬菌体转导方案，将报告基因从标记菌株转移到能够形成生物膜的菌株中。本视频仅展示该方案中的关键步骤。在 37 摄氏度下，于 TY 培养基中培养携带报告基因融合的供体菌株 168，直至培养物进入早期静止期，然后将 200 微升菌液与 100 微升稀释的噬菌体原液加入玻璃试管中。

在37°C下静置15分钟。接下来，将预热的TY软琼脂加入试管中，通过涡旋充分混匀。轻轻涂布于新鲜的TY平板上，于37°C培养8至16小时，使噬菌体晕圈形成。

为收集噬菌斑晕圈，向平板中加入三毫升 TY 培养基，用玻璃移液管将顶层琼脂打碎。将琼脂悬液转移至 15 毫升离心管中。轻轻涡旋以彻底分散琼脂，随后在 1000 ×g 条件下离心 15 分钟。

将上清液转移至新离心管中。使用0.22微米针筒滤器过滤上清液。用此上清液感染在TY培养基中培养的受体菌株。

取30微升上清液加入已稀释1:10的10毫升培养液中，于37摄氏度孵育30分钟。随后在5,000 RPM条件下离心7分钟，将沉淀重悬于200微升TY培养基中，并涂布于含有SPECTinomycin及10毫摩尔柠檬酸钠的平板上。

在 37 °C 下孵育 12 至 36 小时。挑选单菌落，在液体 LB 培养基中于 37 °C 过夜培养。最后，取 3 µL 过夜培养物点种于固体生物膜诱导培养基上。

将细胞在30摄氏度下培养72小时。经过三天的生长后，生物膜将在Ms.GG琼脂表面形成复杂的形态结构。开始此操作时，使用牙签或镊子从MSGG琼脂表面移除生物膜。

生物膜的质地应能够使其从琼脂表面完整剥离。将生物膜置于3 mL PBS缓冲液中，轻轻分散。在进行单细胞分析前，以输出功率3、振幅0.7秒进行12次脉冲处理，以固定样品。

重悬沉淀，将细胞悬浮液用1毫升含4%多聚甲醛的溶液重悬，于室温下准确孵育7分钟。7分钟固定完成后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次。最后，在进行荧光显微镜观察前，将细胞重悬于300微升PBS缓冲液中。

用移液器吸取200微升0.8%琼脂糖溶液滴加到载玻片上，然后小心地用另一张载玻片覆盖。两分钟后，轻轻移除上层载玻片，使底部载玻片表面形成一层附着的琼脂糖层。取2微升固定好的细胞滴加在琼脂糖层表面，并用显微镜盖玻片覆盖。

将样品置于荧光显微镜的载物台上。根据阴性对照设置激发时间，阴性对照在所选实验条件下应无荧光信号。曝光时间应为 50 至 200 毫秒之间。

对每个视野分别采集荧光图像和明场图像。为进行流式细胞术分析，通过轻度超声处理将固定后的细胞样品分散。以五的输出功率和0.7秒的振幅，进行两轮各12次脉冲处理，以将细胞团块分散为单个细胞，同时避免细胞裂解。

通过光学显微镜确认细胞分散的效率。随后，用 PBS 缓冲液将样品稀释至 1:100。本实验将使用 BD FACS Canto 两型流式细胞仪检测 YFP 荧光。

使用488纳米激光激发并结合530/30滤光片检测CFP荧光。使用405纳米激光激发并结合408/40滤光片，并用两个阴性对照校准流式细胞仪。不含细胞的PBS缓冲液样品可作为流式细胞仪检测颗粒大小的阴性对照。

不含荧光报告分子的样品应作为流式细胞仪荧光灵敏度的阴性对照。校准后，将标记有荧光报告分子的各样品置于流式细胞仪中，以每秒303,000个事件的流速分析至少50,000个事件。当枯草芽孢杆菌（B. subtilis）在生物膜诱导培养基（MSGG）平板上生长时，在30摄氏度下培养三天后可观察到生物膜的形成。

生物膜呈现出复杂的形态结构，表明其中存在不同的细胞亚群。例如，胞外基质和生物膜的产生会导致菌落表面形成皱褶。该图展示了利用荧光显微镜对单标记菌株中的细胞分化进行可视化的一个示例。

该菌株携带荧光报告基因 Ptap，一种在产生基质的细胞亚群中表达的 CFP，这些细胞以蓝色显示。该亚群产生并分泌构成生物膜的胞外基质。下一张图像为双重标记菌株的荧光显微镜观察结果，该菌株携带报告基因 Ptap（CFP）以及额外的报告基因 P Surfactin YFP。

这种第二种报告系统可用于监测负责分泌信号分子表面活性素的细胞亚群，该信号分子可触发基质产生细胞分化的信号级联反应。在此图像中，基质产生细胞以蓝色伪彩显示，而表面活性素产生细胞以黄色伪彩显示，结果来自使用携带报告基因 ptap 的单标记菌株进行的二维流式细胞术分析。此处展示的是一个YFB。

未处理的对照菌株不含任何荧光蛋白基因，显示出单一的低相对荧光细胞群，这些细胞携带ptap。在非生物膜诱导条件下，YFP未能区分基质产生亚群，整个群体也表现出低相对荧光。相反，在生物膜诱导条件下，检测到一群具有高相对荧光的细胞亚群，表现为低相对荧光峰右侧的一个肩峰。

此处展示了通过三维流式细胞术获得的峰值结果。监测的荧光通道信号在X轴显示YFP，Y轴显示CFP；左上方面板显示了不含荧光蛋白基因的菌株，用作背景荧光的对照。右上方面板中，使用单一标记菌株检测在黄色框出的YFP荧光通道中表面活性素生产亚群。

在左下方面板中，使用了另一种单标记菌株来检测基质产生亚群。在用蓝色框出的CFP荧光通道中，利用双标记菌株监测基质产生亚群和表面活性剂产生亚群，并展示了结果，如右下方面板所示。

检测到两个表达高水平荧光报告基因的细胞亚群。每个亚群均被框出，显示这两种特化细胞亚群之间的报告基因表达无重叠。该最终图示展示了通过三维流式细胞术对基质产生细胞和食同类细胞亚群进行的定量分析结果。

在右上方图中，使用单一标记菌株来检测食同类亚群。在黄色框出的YFP荧光通道中，该食同类亚群已被描述为与基质产生亚群协同分化。在左下方图中，通过另一种单一标记菌株的CFP荧光通道检测基质产生亚群。

在右下角的图板中，用蓝色框出的双标记菌株结果显示，存在一个单一的亚群，其荧光细胞同时表达被绿色框出的YFP和CFP。两种报告基因的同步表达表明，这两个细胞分化通路在同一亚群中被协调激活。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用细胞群体分析方法（如荧光显微镜或流式细胞术）对构成微生物生物膜的不同细胞亚群进行可视化和定量分析。