单细胞分析枯草芽孢杆菌生物膜，用荧光显微镜和流式细胞仪
February 15th, 2012
微生物生物膜一般由专门的细胞不同亚群构成。这些亚群的单细胞分析需要使用荧光记者。在这里，我们描述了一个协议，以可视化和监视几个subpopulationswithin B枯草生物膜，用荧光显微镜和流式细胞仪。
该程序的总体目标是可视化和量化在模式生物体 Bacillus subtles 的生物膜中分化的特化细胞的不同亚群。这是通过首先将转录报告基因插入 B 微妙的染色体来实现的。这些报告基因将仅在研究细胞的亚群中表达。
下一步是通过在生物膜诱导培养基 Ms GG gg 中生长 B 微妙物质来促进生物膜的发展。生物膜形成后，生物膜中的细胞被分散并用对位甲醛固定。该程序的最后一步是使用荧光、显微镜和流式细胞术检测微生物群落的单个细胞发出的荧光信号。
最终，结果显示了细胞如何专门产生和分泌。构成生物膜的细胞外基质与分泌表面活性剂的细胞不同，表面活性剂是负责基质生产者亚群分化的信号分子。与现有方法（例如使用微射线分析的 Vita Ities 分析对转录表达进行定量）相比，该技术的主要优点是它使我们能够在单个细胞水平上监测基因表达，并可视化专门用于表达特定基因的特别小的细胞群。
在分析总体群体时，不会检测到这些基因表达。整合质粒用于标记 B 微妙之处，此处显示了一个示例。PTAA，负责产生 tass 的基因的启动子。
使用限制性位点 ECO R 1 和 Hindi 3 将基质蛋白克隆到载体中。CFP 报告基因的表达现在在 ptap A 的控制下开始标记 B 的过程，通过酶消化微妙地线性化整合质粒。推荐的限制性内切酶是 XH oh 1，当整合质粒准备好时，通过在 37 摄氏度下在感受培养基中培养细胞 5 小时，在 B 最细微菌株 1 68 中诱导自然能力。
将线性化质粒加入感受态 B 最微妙细胞的培养物中，两小时后在 37 摄氏度下孵育 2 小时，用 spect mycin 将细胞接种在琼脂上，并在 37 摄氏度下孵育过夜。B 微妙染色体有两个中性位点，Amy、E、E 和 LAC A，可用于整合报告基因融合，而不会影响生物膜的发育。线性化的 PKM 0 0 8 质粒通过双重重组整合到 B 微妙的基因组中。
下一步是使用 SPP 单噬菌体转导方案将报告基因从标记菌株转移到能够形成生物膜的菌株。在本视频中，仅展示了实验方案中的重要步骤。培养供体菌株 1 68，在 37 摄氏度的 TY 培养基中含有报告基因融合，直到培养物在玻璃管中加入 200 微升细胞至 100 微升稀释的噬菌体原液时达到早期稳定期。
让我们在 37 摄氏度下静置 15 分钟。接下来，将热的 TY 软琼脂移液到试管中，并通过涡旋充分混合。轻轻铺在新鲜的 TY 板上，在 37 摄氏度下孵育 8 至 16 小时，以使噬菌体光晕出现。
要收集噬菌体光晕，向板中加入 3 毫升 TY 培养基，并使用玻璃移液器打碎顶部琼脂。将琼脂悬浮液转移到 15 mL的猎鹰管中。轻轻涡旋以打碎琼脂，然后以 1000 G 离心 15 分钟。
将上清液转移到新试管中。将上清液通过点 22 微米针式过滤器。使用该上清液感染在 TY 培养基中生长的受体菌株的培养物。
将 30 微升上清液加入 10 毫升稀释的培养物中，稀释 1 至 10，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。然后以 5， 000 RPM 离心 7 分钟，复苏将沉淀悬浮在 200 微升 TY 培养基中，并铺在含有 SPECT 霉素加 10 毫摩尔的平板上。柠檬酸钠。
在 37 摄氏度下孵育 12 至 36 小时。选择一个菌落并在 37 摄氏度的液体 LB 中培养过夜。最后，在固体生物膜诱导培养基上点出 3 微升过夜培养物。
让细胞在 30 摄氏度下生长 72 小时。生长三天后，Ms.GG 琼脂表面形成的生物膜将在琼脂表面形成复杂的形态结构。要开始此过程，请使用牙签或镊子从 MSGG 琼脂表面去除生物膜。
生物膜的稠度应使其能够从琼脂表面剥离。将生物膜合一放入 3 毫升 PBS 缓冲液中，温和分散生物膜。在单细胞分析之前，执行 12 个脉冲，输出为 3，振幅为 0.7 秒，以固定样品。
Resus 将 300 微升细胞悬液悬浮在 1 毫升 4% 多聚甲醛溶液中，并在室温下孵育整整 7 分钟。固定 7 分钟后，在 PBS 缓冲液中洗涤细胞 3 次。最后，在荧光显微镜检查之前，将细胞重悬于 300 μL PBS 缓冲液中。
通过在载玻片上吸取 200 微升 0.8% agris 来准备显微镜载玻片，然后小心地用另一张载玻片覆盖它。两分钟后，轻轻取下上部载玻片，在底部点获得一层附着在载玻片上的格罗。在 agros 层的表面放置两微升固定细胞，并用显微镜盖玻片覆盖。
将样品放在荧光显微镜的载物台上。根据阴性对照设置激发期，该阴性对照在为实验选择的条件下不显示荧光。曝光时间应在 50 到 200 毫秒之间。
获取荧光图像以及每个视场的明场图像。为了制备用于流式细胞术分析的细胞，通过温和的超声处理分散固定细胞的样品。执行两个系列的 12 个脉冲，输出为 5，振幅为 0.7 秒，将团块分散到单个细胞中，而不会引起细胞裂解。
通过光学显微镜确认细胞分散的效率。接下来，在 PBS 缓冲液中将样品稀释 1 至 100。BD 传真 canto two 流式细胞仪将用于 YFP 荧光的分析。
488 纳米激光激发与 5 30 30 滤光片耦合用于 CFP 荧光。使用 405 纳米激光激发与 4 0 8 40 滤光片耦合，用两个阴性对照校准流式细胞仪。无悬浮细胞的 PBS 缓冲液样品应作为流式细胞仪感应到的颗粒大小的阴性对照。
没有荧光报告基因的样品应作为流式细胞流荧光敏感性的阴性对照。细胞仪校准后，将用荧光报告基因标记的样品放入每个样品的流式细胞仪中，以每秒 303， 000 个事件的流速分析至少 50， 000 个事件。当 B Subtles 在生物膜诱导培养基的平板上生长时，在 30 摄氏度下孵育 3 天后观察到 MSGG 生物膜的形成。
生物膜显示出复杂的形态结构，表明不同的参与细胞亚群。例如，细胞外基质和生物膜的产生导致菌落表面形成皱纹。该图显示了使用荧光显微镜在单个标记菌株中可视化细胞分化的示例。
该菌株含有荧光报告基因 Ptap，这是一种在产生蓝色细胞的基质亚群中表达的 CFP。该亚群产生并分泌构成生物膜的细胞外基质。下一张图像是通过荧光显微镜观察双标记菌株的结果，该菌株含有报告基因 Ptap、A CFP 和额外的报告基因 P 表面活性素 YFP。
第二个报告基因能够监测负责分泌信号分子表面活性素的细胞亚群，从而触发基质生产者分化的信号级联反应。在这里，基质生产者为蓝色假色，而表面活性剂生产者为黄色假色，这是使用带有报告基因 ptap 的单个标记菌株的 2D 流式细胞术的结果。这里介绍了 YFB。
没有任何荧光蛋白基因的未处理对照菌株显示单个群体，具有携带 ptap 的低相对荧光细胞。在非生物膜诱导条件下的 YFP 不区分基质生产者的亚群，并且整个群体也显示出低相对荧光。相反，在生物膜诱导条件下，具有高相对荧光的细胞亚群被检测为低相对荧光右侧的肩部。
此处显示了从 3D 流式细胞术获得的峰值结果。监测通道的荧光信号显示在 YFP 的 X 轴和 Y 轴中对于 CFP，左上面板显示了没有荧光蛋白基因的菌株作为背景荧光的对照。在右上图中，使用单个标记菌株检测 YFP 荧光通道中表面活性素生产者亚群，以黄色框框
。在左下角的面板中，使用不同的单标记菌株来检测基质生产者的亚群。在蓝色框的 CFP 荧光通道中，使用双标记菌株监测基质生产者和表面活性剂生产者的亚群，并呈现结果。在这个右下角的面板中。
检测到两个表达高水平荧光报告基因的细胞亚群。每个群体的框架表明，两个特化细胞亚群之间的报告基因表达没有重叠。最终图显示了通过 3D 流式细胞术对基质生产者和同类动物亚群的定量。
在右上面板中，使用单个标记菌株来检测食人族亚群。在以黄色框框的 YFP 荧光通道中，该食人族亚群已被描述为与基质生产者亚群协调分化。在左下角的面板中，在 CFP 荧光通道中的另一个单个标记菌株中检测到基质生产者的亚群。
右下图中双标记菌株的结果以蓝色框显示荧光细胞的单个亚群，表达 YFP 和 CFP（以绿色框）。两个报告基因的同时表达表明两种细胞分化途径在同一亚群中被并位激活。观看本视频后，您应该对如何使用细胞群的细胞分析（如荧光显微镜或流式细胞术）来可视化和量化构成微生物生物膜的不同细胞亚群
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概述
本协议概述了一种可视化和量化枯草芽孢杆菌生物膜中不同专门化细胞亚群的方法。通过利用转录报告基因和荧光技术，研究人员可以有效地监测这些亚群。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物生物学
- 生物膜研究
- 细胞分析
背景
- 微生物生物膜由专门化的细胞亚群组成。
- 单细胞分析对于理解生物膜动力学至关重要。
- 荧光报告基因用于可视化这些亚群。
- 枯草芽孢杆菌是生物膜研究的模型生物。
研究目的
- 可视化枯草芽孢杆菌生物膜中的不同亚群。
- 量化专门化细胞在生物膜中的分化。
- 增进对微生物群落结构的理解。
使用的方法
- 将转录报告基因插入枯草芽孢杆菌染色体中。
- 使用生物膜诱导培养基促进生物膜的发展。
- 用甲醛分散和固定生物膜细胞。
- 通过显微镜和流式细胞术检测荧光信号。
主要结果
- 成功可视化不同的细胞亚群。
- 量化生物膜中专门化细胞的分化。
- 展示荧光显微镜和流式细胞术的有效使用。
- 对微生物群落结构的洞察。
结论
- 该协议能够详细分析生物膜亚群。
- 荧光报告基因对于研究微生物动力学至关重要。
- 这种方法可应用于其他微生物系统进行类似研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry enables precise quantification of specialized bacterial subpopulations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach enhances predictive confidence in microbial community behavior, informing target validation and assay development for anti-biofilm strategies. The method's adaptability to other microbial models broadens its portfolio impact across infectious disease and microbiome research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of functionally distinct cell subpopulations within biofilms.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing matrix producers from surfactin producers at single-cell resolution.
- Improves predictive confidence in target selection by revealing spatial and temporal organization of microbial communities.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of gene expression heterogeneity in prokaryotic systems.
Screening & Assay Development
- Provides validated biological systems for downstream screening of anti-biofilm compounds.
- Delivers quantitative, reproducible outputs through flow cytometry and fluorescence microscopy.
- Enables standardization of reporter-based assays for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on specific biofilm subpopulations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by capturing phenotypic heterogeneity in microbial communities.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by enabling single-cell resolution analysis.
- De-risks translational advancement by providing quantitative biomarkers of biofilm differentiation.
- Supports risk-adjusted decisions for advancing anti-biofilm candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for anti-biofilm and microbiome-targeted programs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by quantifying gene expression in specialized subpopulations.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating compound effects on biofilm architecture.
- Analytics: Delivers quantitative single-cell readouts for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and continuity across model systems when studying microbial heterogeneity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse microbial models and research objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-biofilm and microbiome assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, fluorescence microscopy, and flow cytometry.
- Demands access to calibrated flow cytometers and high-sensitivity fluorescence imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of reporter constructs and analytical protocols.
- Adaptable to other microbial models with appropriate reporter integration strategies.
- Potential limitations include detection thresholds for rare subpopulations and need for rigorous controls.
