Name: 实时监控的配体 - 受体相互作用的荧光共振能量转移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 学习利用荧光共振能量转移技术实时监测配体与受体相互作用的方法。本实验采用聚二乙炔脂质体作为传感平台，通过检测FRET效率变化实现生物分子的高灵敏度检测。

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本工作的经费由美国国家科学基金会、美国国立卫生研究院（NIH）、材料技术中心（MTC）以及SIUC的科研发展办公室（ORDA）提供支持。我们感谢国家科学基金会（NSF）提供的资助（CHE-0959568），用于购置场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）。我们感谢Matthew McCarroll教授在讨论中提供的有益建议。Julia Reyes谨此感谢哥伦比亚科学、技术和创新部（COLCIENCIAS）、哥伦比亚高等教育机构以及哥伦比亚 Pedagogica y Tecnologica 大学为其提供的奖学金和经费支持。

A. PDA 脂质体的合成与表征4,5,6
注意 1：在所有实验步骤中，使用铝箔包裹每个容器，以保护 PDA 溶液免受光照。
注2：按照步骤A（PDA脂质体的合成与表征）制备了两组不同的脂质体溶液（B和C）。
1. N-羟基琥珀酰亚胺二炔酸酯（NHS-PCDA）的合成
<ol>
 <li>制备脂质体时，需要一种关键成分PCDA-NHS。我们采用以下步骤合成PCDA-NHS：</li>
 <li>将10,12-二十二碳二炔酸（PCDA）（0.267 g，0.713 mmol）、N-羟基琥珀酰亚胺（0.0914 g，0.786 mmol）和1-(3-(二甲氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.144 g，0.713 mmol）加入到20 ml无水CH2Cl2中。</li>
 <li>室温下搅拌溶液2小时。</li>
 <li>使用旋转蒸发仪小心除去溶剂，得到干燥的薄膜。</li>
 <li>使用分液漏斗，用乙醚（25 ml）和水（25 ml）对残留物萃取三次。</li>
 <li>用MgSO4（1.0 g）干燥有机层半小时。过滤后，通过旋转蒸发除去溶剂，得到白色固体粉末（0.24 g，>90%）。</li>
 <li>采用核磁共振（NMR）分析最终化合物。</li>
 <li>1H NMR（300 MHz，DMSO），δ（ppm）：0.893（t，3H），1.268（m，26H），1.512（m，4H），1.754（m，2H），2.252（t，4H），2.365（m，1H），2.610（m，1H），2.842（s，2H）。</li>
</ol>
2. 脂质体的制备5,6,7
<ol>
 <li>将PCDA: PCDA-NHS: 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC）按8:1:1的比例溶于20 ml二氯甲烷中。</li>
 <li>用滤纸过滤溶液，以去除聚集体。</li>
 <li>完全蒸发溶剂，得到单体的薄膜。</li>
 <li>在真空条件下将薄膜干燥过夜。</li>
 <li>用去离子水（50 ml）水合薄膜，制备所需浓度（0.65–1 mM）的脂质体溶液。</li>
 <li>使用探头式超声仪在76 °C下对所得悬浮液超声处理约18分钟。</li>
 <li>小心地将溶液通过滤纸过滤，以去除脂质聚集体。</li>
 <li>将溶液在4 °C下冷却过夜，以促进单体的自组装。最终溶液应为光学透明。</li>
 <li>在空气中，使用Pen Ray紫外光源（4.5 mW/cm2）以254 nm紫外光照射约2分钟，使自组装的二炔单体（脂质体）发生聚合。</li>
 <li>该脂质体溶液在室温下至少可稳定保存两周；冷藏时稳定性更佳。</li>
</ol>
B. 罗丹明标记的牛血清白蛋白（BSA-Rh）修饰的PCDA脂质体的制备
1. BSA-Rh 与脂质体表面的结合
<ol>
 <li>将BSA-Rh溶解于PBS缓冲液（离子浓度为0.01 M，pH 7.2）中，配制成终浓度为1.2 μM的BSA-罗丹明溶液。</li>
 <li>在室温下，向步骤A.2.中制备的10 ml脂质体溶液（见上文）中加入2 ml（1.2 μM）的BSA-罗丹明溶液。</li>
 <li>参照经典的胺基与NHS活化的羧基之间的反应进行结合反应（反应示意图见图2）。NHS-PCDA的设计（图2，步骤1）旨在利用NHS-胺反应将蛋白质分子共价连接至脂质体（图2，步骤2）。NHS是一种优良的离去基团，可推动胺与羧酸反应正向进行。在适当条件下，该反应的产率应为定量完成。</li>
 <li>去除游离的BSA-Rh：将Spectra/Por Biotech纤维素酯（CE）透析膜（截留分子量CO：100,000）浸入去离子水中15分钟。该膜用于在去离子水中透析未反应的BSA-罗丹明（分子量约66,000 Da）。</li>
 <li>小心地将溶液转移至透析膜中。</li>
 <li>在透析过程中，分别于2小时、8小时、14小时、24小时和36小时更换透析液。</li>
 <li>将最终溶液收集至用铝箔包裹的样品瓶中。</li>
</ol>
C. SR-二胺和生物素标记脂质体的制备
1. 在步骤2.1中，不使用DMPC，而使用生物素标记的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素)（biotin-DOPE）。
<ol>
 <li>按照步骤 2.2 至 2.9 的所有操作进行。</li>
 <li>在步骤 B 中，不使用 BSA-Rh，而是使用带有二胺标记的磺基罗丹明（SR-diamine）。</li>
 <li>继续完成步骤 B 中的其余所有步骤。</li>
 <li>本制备中的脂质体在其表面含有生物素和 SR-diamine。后续步骤与 A 和 B 相似（见上文），唯一不同之处在于：向溶液中加入链霉亲和素，以通过 FRET 效率的变化来研究生物素-链霉亲和素相互作用。</li>
</ol>
D. 代表性结果
<img alt="FRET 机制示意图；紫外光影响发射；荧光过程；化学教育图示。" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Title Figure"> 
标题图。 一幅卡通图解，说明在脂质体表面发生的反应及FRET过程（按照步骤B制备）。
A. 使用FRET监测蛋白质与脂质体的结合1
监测在步骤B中制备的罗丹明与PDA脂质体之间的荧光共振能量转移（FRET）。
测定了BSA-Rh的激发和发射光谱以及PDA的吸收光谱（图3A）。可以明显看出，BSA-Rh的发射光谱与PDA的吸收光谱存在重叠，这满足了FRET机制的共振条件。对聚合前后标记了BSA-罗丹明的脂质体，采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱进行了分析。对于独立的供体和受体，FRET效率高度依赖于供体-受体之间的距离（r）和J1（j值）。由于光聚合后出现了蓝色PDA的电子吸收光谱，罗丹明与PDA之间发生FRET，导致发射光发生淬灭（图3B）。在本研究中，未聚合的脂质体与罗丹明之间的FRET效率为零，因为在可见光区未聚合脂质体的J值为0。
我们使用仅含PDA的脂质体进行了类似的实验，这些脂质体表面不含NHS。在这些情况下，BSA-Rh未标记到脂质体表面。因此，罗丹明与PDA之间的平均距离（r平均）远大于 Förster 半径（R0 = 2.8 nm）。因此，我们未观察到荧光强度显著下降。该结果也表明，当 r &lt; 2.8 nm 时，荧光猝灭占主导地位。
J 和 R0 值使用以下公式计算：[1]
J(λ)=∫FD(λ)εA(λ)λ4dλ
R0=0.211[k2n-4QDJ(λ)]1/6
消光系数（ε蓝色PDA的浓度范围约为2000-10000 M-1 cm-1 在加入链霉亲和素之前。蓝色-PDA 的消光系数依赖于光聚合条件。[2] 例如， ε 聚合时间较长的溶液，其值会更大。此外，二炔单体的自组装也可能影响ε值。 J 计算考虑了这些变化，并反映了由于生物素-链霉亲和素分子相互作用引起的PDA消光系数的变化。 J 使用实验测得的PDA吸收和SR-101发射数据计算数值。PDA和SR-101的相应变化 J 其数值变化是由于向溶液中加入链霉亲和素后，PDA 的电子吸收光谱发生偏移所致（图4C）。单位 J 值为 M-1cm-1纳米米4.
B. 通过向生物素标记的脂质体溶液中添加链霉亲和素来监测FRET
注意 1：监测上述步骤 C 中制备的罗丹明与 PDA 脂质体之间的荧光共振能量转移（FRET）。
测量了磺基罗丹明标记的二胺（SR-二胺）的激发光谱和发射光谱，以及PDA的吸收光谱（图4A）。使用紫外-可见光谱法和荧光光谱法分析了未聚合与已聚合的生物素标记脂质体。聚合后，罗丹明（SR-101）的发射强度降低了约45%图4B）表明由于FRET导致发射淬灭。添加 40 μl 等分试样（1 μM) 链霉亲和素溶液加入至 2 ml 脂质体溶液中。随着链霉亲和素加入溶液，溶液中发生的变化 J 观察到该值（图4C）。由于生物素与链霉亲和素结合，PDA脂质体的蓝色峰强度（中心位于约645 nm处 图1）降低，而在 540 nm 处的吸收峰则有所增加（F图1S). 图 4D 显示FRET效率的变化。FRET效率随链霉亲和素浓度增加而降低，这也与我们的预测一致。
每加入40 μl链霉亲和素后，记录SR的发射光谱。我们观察到，加入链霉亲和素后，罗丹明的发射光显著且持续增强（图5）。罗丹明发射增强的原因在于，生物素-链霉亲和素相互作用后，磺基罗丹明发射光谱与PDA吸收光谱之间的J值降低。在分子水平上，生物素与链霉亲和素的相互作用导致PDA有效共轭长度发生细微变化，从而促使蓝色PDA形式转变为更热力学稳定的红色PDA形式2。这正是J值变化的基础。有趣的是，通过本研究的传感检测方法，还可探测生物素以共价或非共价方式结合到PDA脂质体时所产生的分子相互作用的细微差异4。
我们还进行了对照实验，并在与链霉亲和素-生物素体系相同的实验条件下监测了对照样品的发射信号。对照实验包括：（1）向表面含有生物素的脂质体溶液中加入相同体积和浓度的缓冲溶液；以及（2）向表面不含生物素受体的脂质体溶液中加入相同体积和浓度的链霉亲和素。加入链霉亲和素后，标记生物素的脂质体溶液显示出增强的荧光强度；而对照实验中的脂质体溶液（例如，请参见图 2S）的发射强度则有所降低，这归因于溶液的稀释效应。这些实验结果明确表明，溶液荧光增强是由于特异性分子相互作用所致。
罗丹明与PDA配对的福斯特半径（R0）经计算（公式2）约为2.80 nm。这意味着，对于孤立的PDA-罗丹明配对，当两者距离 r 为2.80 nm时，50%的激发态罗丹明分子会将其能量转移给PDA。
我们观察到，当生物素共价连接到PDA主链时，其荧光发射增强程度是非共价结合到脂质体上生物素的2-3倍4。这些结果强烈表明，我们所提出的系统能够灵敏地区分脂质体上受体与信号转导元件（生物素与脂质体双分子层之间的连接臂）之间因共价或非共价结合而产生的微小相互作用差异。根据分光光度计的扫描和数据采集能力，该传感系统可实现对蛋白质相互作用的实时监测（时间尺度为毫秒至秒级），适用于紫外-可见光谱分析。
<img alt="光谱学的吸光度与波长关系图，显示两种具有不同光谱峰的样品。" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 蓝色和红色PDA溶液的吸收光谱。（插图）使用数码相机拍摄的光学显微图像。
<img alt="化学反应路径图：酯化和酰胺化合成步骤，显示化学结构。" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. PCDA-NHS 合成的反应路线（步骤 1）。PCDA-NHS 与蛋白质的氨基取代基反应（步骤 2）。步骤 2 是蛋白质中赖氨酸残基与 PCDA 单体的羧酸基团结合的基础。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="光谱分析图；蛋白质发射、吸收；PDA脂质体聚合效应；波长。" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3A"> 
图3A. 观察到的FRET效率变化是由于PDA吸收光谱的改变所致。在聚合之前，BSA-Rh的发射光谱与PDA的吸收光谱之间无重叠；但在聚合之后，PDA的吸收光谱与BSA-Rh的发射光谱出现重叠，这是发生FRET所必需的条件。罗丹明为供体（红色），聚合后的PDA脂质体作为受体（蓝色）。
<img alt="光谱拟合图，强度与波长关系，显示光谱研究中的发射分析。" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3B"> 
图 3B. BSA-Rh 标记的脂质体在 PCDA 聚合前（蓝色）和聚合后（红色）的荧光光谱。由于罗丹明与 PDA 之间的荧光共振能量转移（FRET），观察到罗丹明发射显著降低。
<img alt="PDA脂质体吸光度与磺基罗丹明发射波长的光谱图。" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4A"> 
图4A. PDA（蓝色或红色）吸收光谱与磺基罗丹明发射光谱（橙色）之间的光谱重叠（J）变化。图4A为极端条件下的代表性光谱，即向溶液中加入过量链霉亲和素时的情况。图4A显示，在加入过量链霉亲和素后，PDA几乎完全由蓝色转变为红色。显然可见，随着PDA吸收光谱的蓝移，光谱重叠（J）增加。
<img alt="光谱分析、吸收图、波长与强度、光子研究、发射光谱。" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4B"> 
图 4B. 脂质体聚合前（蓝色）和聚合后（红色）的荧光光谱。
<img alt="添加链霉亲和素与ΔI散点图；分析蛋白质结合相互作用结果。" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4C"> 
图4C. FRET条件：向脂质体溶液中添加链霉亲和素后，供体（磺酰罗丹明）与受体（PDA）之间的J值变化。
<img alt="FRET效率与链霉亲和素的关系，图表，荧光分析，分子相互作用研究。" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4D"> 
图 4D. 向脂质体溶液中添加链霉亲和素后，供体（磺基罗丹明）与受体（PDA）之间的FRET效率变化。
<img alt="添加链霉亲和素；吸收光谱图；显示PDA-rh-biotin样品中强度变化。" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 向PDA脂质体溶液中加入链霉亲和素等分试样后罗丹明的发射光谱。插图显示SR-101光谱中发射变化的放大视图。

<ol><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).</li>
<li>Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Colorimetric+Detection+of+a+Receptor-Ligand+Interaction+by+a+Polymerized+Bilayer+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly.</a> Science. 261, 585-588 (1993).</li>
<li>Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Conceptual+and+Technological+Advances+in+Polydiacetylene-based+Supramolecular+Chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).</li>
<li>Xuelian, L. i, Kohli, P. unit <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Molecular+Interactions+in+Biosensors+Based+on+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer.</a> J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).</li>
<li>Li, X., Matthews, S., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Polydiacetylene+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).</li>
<li>Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Conjugated+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes.</a> Langmuir. 22, (2006).</li>
<li>New, R. R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNew%2C+RRC+%22Liposomes%3A+A+Practical+Approach%22">Liposomes: A Practical Approach</a>. New, R. R. C. , Oxford University Press. Oxford. 33-104 (1990).</li>
<li>Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -M., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+and+Fluorometric+Detection+of+Cationic+Surfactants+Based+on+Conjugated+Polydiacetylene+Supramolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules.</a> Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).</li>
<li>Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Color+Display+System+Based+on+Thermochromic+Conjugated+Polydiacetylene%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Research%22%5BJournal%5D)">A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene.</a> Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们利用NHS-胺反应实现了蛋白质赖氨酸残基在脂质体表面的选择性结合。该基于FRET的方法能够实时监测生物素-链霉亲和素结合以及蛋白质（BSA）与脂质体表面的结合过程。类似的方法可应用于研究各种蛋白质与其特异性受体之间相互作用的动力学。在荧光染料的选择上具有灵活性，可根据荧光染料的光谱特性导致不同的J值变化。PDA是一种通用的受体，因此将PDA（受体）与多种荧光染料和受体联用，有望为我们提供多种传感器。我们所构建传感器的灵敏度可达亚纳摩尔水平，经过优化后还可进一步提高。传感器的特异性通过受体与配体之间的分子相互作用进行调控。这些传感器也可用于检测病毒和细菌等较大颗粒。
我们还获得了诸如供体与受体之间的距离、FRET 效率以及J值等有价值的信息。计算得到的供体与受体之间的距离为 2.8 nm，这与我们的预测结果一致。由于临床上迫切需要对隐匿性病毒、细菌及其他有害微生物进行监测，我们希望研制一种便携式设备，能够对有害生物分子进行实时检测。

<table><tbody><tr><td>10,12-二十二碳二炔酸（PCDA）</td><td>GFS chemicals</td><td>3261</td><td>光敏感</td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）</td><td>Acros Organics</td><td>157270250</td><td>对湿气敏感</td></tr><tr><td>1-(3-(二甲氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）</td><td>Chem-impex International</td><td>00050</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二肉豆蔻酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明标记的牛血清白蛋白（BSA-Rh）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4537</td><td></td></tr><tr><td>(1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷酸&amp;#8211;乙醇胺-N-(生物素)(生物素-DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870282</td><td></td></tr></tbody></table>

利用荧光共振能量转移实时监测配体-受体相互作用

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET 是一种通过长程偶极-偶极相互作用，将能量从激发态的供体分子非辐射地转移至基态受体分子的过程1。在本传感检测中，我们利用了PDA的一种特殊性质：当分析物与连接在PDA上的受体相互作用后，PDA的紫外-可见电子吸收光谱会发生蓝移（图1）2,3,4,7。该PDA吸收光谱的偏移会改变PDA（受体）与罗丹明（供体）之间的光谱重叠（J），从而引起FRET效率的变化。因此，分析物（配体）与受体之间的相互作用可通过供体荧光团与PDA之间的FRET进行检测。具体而言，我们展示了对模型蛋白分子链霉亲和素的传感检测。同时，我们还利用FRET机制演示了牛血清白蛋白（BSA）与脂质体表面的共价结合。这些双层脂质体与蛋白质分子之间的相互作用可实现实时检测。所提出的方法是一种适用于检测小分子化学物质和大分子生物分子的通用传感策略。由于荧光检测本身比比色法更灵敏，该检测方法的检测限可达到亚纳摩尔级别或更低8。此外，PDA可作为FRET中的通用受体，这意味着可以通过在PDA脂质体表面功能化不同的供体和受体，开发出多种基于PDA（受体）的传感器。

我们展示了共轭聚合物聚二乙炔（PDA）与连接在PDA脂质体表面的荧光团之间的荧光共振能量转移（FRET），用于生物分子的检测。PDA脂质体的表面还含有可作为探针的生物分子受体分子。配体-受体相互作用导致荧光团与PDA之间FRET效率的变化，这是该传感机制的基础。

FRET 是一种通过长程偶极-偶极相互作用，将能量从激发态的供体分子非辐射地转移至基态受体分子的过程。

以下实验的总体目标是利用荧光共振能量转移来监测配体-受体相互作用。本方法利用了PDA在紫外-可见电子吸收光谱中发生蓝移这一有趣的特性。当分析物与连接在PDA上的受体相互作用后，首先合成第一代聚合物D-乙炔酸（PDA），然后制备PDA脂质体。接下来，带有罗丹明标记的 BSA 会结合到 PDA 脂质体表面。随后测量荧光共振能量转移时，脂质体结合的 BSA 罗丹明结构域的发射光谱与 PDA 的吸收光谱发生重叠。这满足了FRET机制的共振要求。因此，可以获得表明配体与受体之间相互作用的数据。与ELISA等现有方法相比，该技术的主要优势在于操作简便且成本低廉。由于荧光检测的本征灵敏度高于量热法，因此该方法的检测限可达到亚纳摩尔甚至更低的浓度水平。该技术的应用前景包括细菌和病毒的检测，因为它能够选择性地在极低浓度下检测这些微生物。我们最初在2010年发现威胁检测用PAL线传感器的有效性时，便提出了这一方法的构想。假设我们有两种分子，即供体和受体，这两种分子相互耦合。当我们向供体提供一定能量时，供体会从基态被激发到激发态，随后该能量会转移给受体。因此，处于基态的受体接收此能量并被激发，这一过程称为荧光共振能量转移。同样的事情也会发生，但这是在荧光的层面上：供体被激发后，能量会转移到受体上，而由受体发出荧光。这就像两个灯泡放在一起，你只给其中一个通电，另一个没有通电的灯泡却亮了起来。在这里，我们希望展示FRET的距离依赖性。荧光共振能量转移（FRET）仅在供体与受体非常接近时才会发生，距离约为10纳米。我们在此激发供体分子，但如您所见，受体分子距离较远。因此，即使向供体提供一定能量，该能量也不会转移至受体分子。因此，F Fred 不起作用。F Fred 的效果与距离有关。羟基 CIN 助剂、D-乙炔或 N-H-S-P-C-D-A 是制备脂质体的关键组分。在整个操作过程中，应将 PDA 溶液避光保存。使用铝箔包裹每个容器，并在化学通风橱中开始合成反应。在圆底烧瓶中加入 10 12 戊二酸二异氰酸酯、端羟基 CIN 酰胺和 1,3-二甲基氨基丙基。在圆底烧瓶中，将三份乙基碳二亚胺盐酸盐溶于20毫升无水氯甲烷中。室温下搅拌溶液两小时。确保烧瓶密封严密。然后将烧瓶转移至旋转蒸发仪以除去溶剂。溶剂去除后，通风橱中会残留一层干燥的薄膜。向圆底烧瓶中加入由25毫升二乙醚和25毫升水组成的溶液，并轻轻旋转约一分钟。为了重新溶解残留物，将溶液转移至分液漏斗中并反复倒置数次以混合。待乙醚层与水层分离后，打开活塞，将水层放入烧杯中。接着，向分液漏斗中加入25毫升水，并进行混合。重复上述提取步骤，共进行三次提取。最后一次提取完成后，合并每次提取得到的有机相，加入一克硫酸镁干燥半小时。使用沃特曼滤纸，通过过滤纸过滤溶液。然后通过旋转蒸发除去乙醚，得到白色固体粉末 N-H-S-P-C-D-A。接下来，

real-time-monitoring-ligand-receptor-interactions-with-fluorescence

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

实时监控的配体 - 受体相互作用的荧光共振能量转移

荧光共振能量转移（FRET）显微技术是一种利用多种生物传感器作为报告分子，实时监测活细胞内信号事件的强有力方法。本文介绍如何使用市售组件构建定制化的落射荧光FRET成像系统，以及如何利用该系统开展FRET实验。...

使用单分子生物传感器通过FRET显微镜实时监测活细胞中的信号事件

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

本文介绍了一种改进的发光共振能量转移（LRET）方法，我们在供体和受体荧光基团位点之间引入了蛋白酶切割位点。这一改进使我们能够获得来自目标膜蛋白的特异性LRET信号，从而可在无需蛋白纯化的条件下对膜蛋白进行研究。...

利用生物发光共振能量转移研究哺乳动物细胞中表达的膜蛋白构象变化

表面等离子体共振（SPR）是一种无需标记、可实时检测生物分子相互作用的方法。本文描述了一项膜蛋白与受体相互作用实验的实验方案，并讨论了该技术的优缺点。...

利用表面等离子共振（SPR）实时测量膜蛋白与受体的相互作用

我们介绍一种技术，可同时在单个T淋巴细胞中测量受力调控的单受体-配体结合动力学，并实时成像钙信号传导。...

荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析

蛋白质-蛋白质相互作用对生物系统至关重要，对结合动力学的研究有助于揭示蛋白质复合物的动态特性与功能。本文介绍一种利用荧光共振能量转移和停流技术来定量测定蛋白质复合物动力学参数的方法。...

利用体外荧光共振能量转移研究蛋白质复合物在毫秒时间尺度上的动态变化

两种荧光分子之间的弗ör斯特共振能量转移（FRET）可用于研究活细胞中的蛋白质相互作用。本文提供了一种通过共聚焦激光扫描显微镜检测受体的敏化发射以及供体分子的淬灭来测量活细胞中FRET的实验方案。...

利用FRET敏化发射在活细胞中评估蛋白质相互作用

该研究详细介绍了FRET定位的方法学，包括标记位点的选择、染料的选用、数据采集以及数据分析。该方法在确定蛋白质体系中的结合位点、构象变化和动态运动方面具有显著效果，若与现有的三维结构信息结合使用，则效果更佳。...

荧光共振能量转移定位：一种阐明全局结构特征的新方法

本方案描述了一种基于生物发光共振能量转移（BRET）的检测方法，用于在活细胞中测量CRAF激酶与14-3-3蛋白之间的相互作用。本方案详细说明了细胞准备、BRET信号检测及数据分析的步骤。此外，还提供了一个示例结果，包括适当对照的设置以及用于优化检测条件的故障排除方法。...

基于生物发光共振能量转移（BRET）的活细胞内CRAF与14-3-3蛋白相互作用检测方法

电生理学是研究离子通道活性的金标准。然而，也存在多种替代方法，包括光学技术。本文介绍了一种利用亚基间基于荧光共振能量转移（FRET）的方法来监测富含亮氨酸重复序列8通道（LRRC8）形成的阴离子通道活性的技术。...

利用敏化发射型荧光共振能量转移（SE-FRET）监测富含亮氨酸重复序列8通道（LRRC8/VRAC）活性

本文详细介绍了如何制备用于固相支撑脂双层中单蛋白追踪的样品。同时阐述了一种具有单分子灵敏度和高帧率的简易荧光显微镜。最后，我们概述了提取单蛋白轨迹的实验步骤。...

使用荧光显微镜追踪脂双层中的单个蛋白质

学习利用荧光共振能量转移技术实时监测配体与受体相互作用的方法。本实验采用聚二乙炔脂质体作为传感平台，通过检测FRET效率变化实现生物分子的高灵敏度检测。

利用荧光共振能量转移实时监测配体-受体相互作用

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