实时监控的配体 - 受体相互作用的荧光共振能量转移

我们表明FRET之间的共轭聚合物的聚二乙炔（PDA）和荧光基团连接到PDA脂质体的生物分子的传感表面。 PDA脂质体也包含在其表面上的生物分子的受体分子可以用作探针。配体 - 受体相互作用导致这是传感机构的基础的荧光团和PDA之间的FRET效率的变化。

以下实验的总体目标是监测配体受体与荧光共振能量转移的相互作用。这里介绍的方法利用了 PDA BLUESHIFT 在 PDA 的紫外可见光电子吸收光谱中的一个有趣特性。在分析物与附着在 PDA 上的受体相互作用后，首先合成聚合物 D 乙炔或 PDA，并制备 PDA 脂质体。

接下来 R domine 标记的 BSA 与 PDA 脂质体表面结合。然后测量荧光共振能量转移。脂质体结合的 BSA Rod Domine 的发射光谱与 PDA 的吸收光谱重叠。

这满足了 Gret 机构的谐振要求。因此，可以获得表明配体和受体之间相互作用的数据。与 Eliza 等现有方法相比，这种技术的主要优点是这种方法非常简单且便宜。

由于荧光本质上比量热法更敏感，因此我们可以在非常低的亚纳摩尔或较低浓度下获得检测限。这项技术的影响延伸到细菌和病毒传感，因为它可以选择性地感知浓度非常低的微生物。当我们在 2010 年发现威胁访问 PAL 线传感器的有效性时，我们首次想到了这种方法。

假设我们有两个分子，供体和受体，它们都相互耦合。然后，当我们向供体提供一定量的能量时，供体从基态激发到激发态，然后这些能量转移到受体。因此，基态的受体接受这种能量并在荧光电阻能量转移中被激发。

同样的事情也会发生，但就荧光而言，供体被激发，但能量被转移到受体，而受体是产生荧光的受体。这就像你有两个灯泡在一起，你给其中一个灯泡供电，但另一个灯泡在没有任何电的情况下吹。这里我们想展示 Fread 的距离依赖性。

Fret 仅在供体和受体彼此非常接近（大约 10 纳米）时起作用。让我们在这里激发供体分子，但正如你所看到的，受体分子离得很远。因此，即使我们向供体提供一定量的能量，它也不会转移到受体分子。

所以 F Fred 不起作用。所以 F Fred 是距离依赖性的。羟基 CIN 助剂、D 乙炔或 N-H-S-P-C-D-A 是制备脂质体的重要组成部分。

在整个过程中，应避光保护 PDA 溶液。在每个容器上使用铝箔包装，在化学通风橱中开始合成。在一个圆底烧瓶中混合 10 个 12 五旬节二酸、末端羟基 CIN 酰胺和一个三甲基氨基丙基。

三乙基碳酰亚胺盐酸盐，最终体积为 20 mL，干燥氯甲烷，装在圆底烧瓶中。在室温下搅拌溶液 2 小时。确保培养瓶紧闭。

然后将烧瓶转移到旋转蒸发器中以去除溶剂。去除溶剂后，干燥的薄膜将保留在通风橱下。将由 25 mL 乙醚和 25 mL水组成的溶液加入圆底培养瓶中，轻轻旋转约一分钟。

为了重新配制残留物，将溶液转移到分离漏斗中并倒置数次以混合。乙醚和水层分离后，打开水龙头，将水层去除到烧杯中。接下来，在分离漏斗中加入 25 毫升水并混合。

像以前一样重复提取过程，总共提取三次。在最后一次提取后，将每次提取的有机层混合，用 1 克硫酸镁干燥有机层半小时。用沃特曼滤纸，分级滤纸，滤液。

然后通过旋转蒸发除去乙醚，得到 N-H-S-P-C-D-A 的白色固体粉末。接下来，将 2 到 3 毫克粉末转移到 NMR 管中的氘代氯仿中。使用核磁共振分析 N-H-S-P-C-D-A，如图所示。

新的 NMR 峰位于 2.842 处。要在圆底烧瓶中制备，将 PCDA 与 P-C-D-A-N-H-S 溶解到 20 毫升二氯甲烷中，同时搅拌，将 PCDA 与 P-C-D-A-N-H-S 溶于 20 毫升二氯甲烷中，溶于 1 比 20 甘油、3 磷酸胆碱、8 比 1 中。接下来，将 watman 滤纸放入漏斗中，将溶液倒入以去除聚集体。

将其收集在圆底烧瓶中。将烧瓶转移到旋转蒸发仪中，然后完全蒸发溶剂，产生一层单体薄膜。使用真空将薄膜干燥过夜。

第二天，加入 50 毫升去离子水，制成 0.65 至 1 毫摩尔的脂质体溶液。然后将溶液转移到新的 50 mL 烧杯中，并用探针架在 76 摄氏度下对所得悬浮液进行超声处理约 18 分钟。小心地将溶液通过漏斗中的 watman 滤纸，以去除脂质聚集体并将其收集在烧瓶中。

将溶液在 4 摄氏度下放置过夜，以促进单体的自组装。第二天的溶液应该是光学透明的，通过用 254 纳米的紫外线照射约两分钟，聚合自组装的二乙炔单体脂质体。在空气中使用笔式射线紫外线源，透明溶液在紫外线照射下会变成蓝色。

脂质体溶液在室温下至少可稳定两周，冷藏后会更稳定。为了将 BSA 杆状胺与脂质体表面结合，将 BSA 杆状胺溶解在 PBS 中至终浓度为 1.2 微摩尔的 BSA Rod Domine 溶液，在室温下将 2 毫升 BSA 杆状胺加入 10 毫升上一节制备的脂质体溶液中。遵循蛋白质赖氨酸残基中的胺基与 NHS 基团活化的羧酸结合的经典反应。

N-H-S-P-C-D-A 设计用于使用 NHS Amin 反应将蛋白质分子与脂质体共价结合。NHS 是一种优良的脱离剂，可正向驱动 Amin 羧酸反应。在适当条件下该反应的产率应该是定量的。

为了去除游离的 BSA Rod Domine，将截留分子量为 100， 000 的生物技术纤维素酯膜浸泡在 1 升烧杯中的去离子水中 15 分钟，以去除分子量约为 66， 000 的未反应性 BSA 瘤胃。道尔顿小心地将溶液转移到透析膜上，并将其浸入 800 毫升中。在黑暗中去离子水，在 2 8、14、24 和 36 小时换水，48 小时后，将最终溶液转移到覆盖有铝箔的小瓶中。

将小瓶储存在 4 摄氏度下，以使用 fret BSA 监测蛋白质结合。用 UV V 和荧光光谱分析聚合前后的 Rod Domine 标记的脂质体，如此处可见分离的供体和受体。品格效率在很大程度上取决于供体受体距离和 J.由于电子吸收的出现，r domine 和 PDA 之间的品格，因此观察到发射中的猝灭。

光聚合后蓝色 PDA 的光谱。在这里，未聚合脂质体和棒状 domine 的品格效率为零，因为在可见光区域中未聚合脂质体的光谱重叠为零。为了监测本视频中描述的 rod Domine 和 PDA 脂质体之间的品丝，使用紫外可见分光光度计和荧光光谱分析了 UN 聚合和聚合生物素标记的脂质体。

从这里可以看出，聚合后瘤胃 SR 1 0 1 的发射减少了约 45%，这表明在溶液中加入链霉亲和素是由于 Fret 而导致发射猝灭。J 值指示的光谱重叠减小，如图所示。fret 效率随着链霉亲和素浓度的增加而降低。

由于生物素链霉亲和素相互作用后 sofo R domine 发射光谱和 PDA 吸收光谱的 J 值降低，因此加入链霉亲和素后 R 多米释放增加。这表明，在分子水平上，生物素链霉亲和素相互作用导致 PDA 有效偶联长度的细微变化，从而导致蓝色 PDA 形式减少为热力学上更稳定的红色 PDA 形式。观看此视频后，您应该对如何使用威胁选择性地监测配体受体相互作用有一个很好的了解遵循此程序。

可以执行 Eliza 等其他方法来回答其他问题，例如蛋白质的选择性结合。