初级小胶质细胞的分离，从新生大鼠脑组织胶质细胞混合文化

隔离初级小胶质细胞的大脑细胞的异质性是必不可少的，以调查他们在生理和病理条件下的作用。本协议描述了机械隔离和混合细胞培养技术，提供高产量和高纯度的，可行的初级小胶质细胞

该程序的总体目标是从新生大鼠大脑中制备原代小胶质细胞培养物。这是通过首先隔离大脑并去除脑膜来实现的。第二步是将大脑匀浆并将混合的神经胶质细胞培养物接种到 T 75 培养瓶中。

接下来，将培养瓶孵育 10 至 14 天，直到星形胶质细胞单层达到汇合。最后一步是摇动培养瓶以释放生长在星形胶质细胞单层顶部的小胶质细胞，从而得到纯化的小胶质细胞培养物。最终，高纯度原代小胶质细胞可用于后续的体外单细胞培养和共培养测定。

与 Perico 梯度法等现有方法相比，该技术的主要优点是名义上的机械破坏最大限度地减少了小胶质细胞功能障碍或激活，并且用于实验的小胶质细胞可以在初始准备后数周内产生。我将与 Clifton Dau guard 博士实验室的研究生 Tammy Tero 一起演示该程序。在该方案中获得的高纯度小胶质细胞培养物可用于体外实验，以研究正常生理条件下的小胶质细胞功能以及病理疾病条件下的功能。

小胶质细胞、对组织损伤的反应性以及炎症刺激与神经损伤和神经退行性疾病状况直接相关。一般来说，刚接触这种方法的人可能会遇到困难，因为他们不熟悉如何及时从脑组织中去除脑膜，以减少原代小胶质细胞培养物中的成纤维细胞污染。此外，在摇动培养瓶和处理小胶质细胞培养物期间，应注意不要损坏星形胶质细胞单层。

为了准备手术，Chi Livi 将 L 15 培养基加热至 4 摄氏度，准备好放入含有 L 15 培养基的 60 x 15 毫米培养皿中，并置于冰上。将培养基加热至 37 摄氏度，并确保所有手术工具均已消毒。用锋利的剪刀将 P 1 到 P 5 大鼠幼崽斩首后，将头部放入 70% 乙醇中。

收集五只大鼠幼崽的头部后，将头部转移到盐水溶液中。通过在耳朵上方的颅骨两侧小心地切开，然后将大脑拉出并放入冰上含有 L 15 培养基的 Petri 问题之一，从每个头部中取出整个大脑。一旦前五个大脑被转移到冰上的 L 15，接下来的五个幼崽就可以在收集所有大脑后以相同的方式处理。

用镊子轻轻抓住脑膜片的边缘，然后小心地将其从下面的皮层上剥离，以去除脑膜。必须彻底去除脑膜并尽快去除。去除脑膜后，将每个大脑转移到冰上 L 15 培养基的新鲜培养皿中。

使用 10 毫升移液器将脑组织和培养基从板中吸出到无菌的 50 毫升锥形管中。然后在 4 摄氏度下以 2， 500 RCF 离心 5 分钟。离心后吸出。

然后，脊髓离心管使用无菌 10 毫升移液器对 Reese 进行注射。将沉淀悬浮在 4 至 5 毫升新鲜的 L 15 培养基中，上下移液 10 次。接下来，将 100 微米的孔细胞过滤器放在新的 50 毫升锥形管上。

使用无菌的 5 毫升移液器上下移液组织悬液，然后将移液管冲洗到细胞过滤器上，通过细胞过滤器将材料分配到锥形管中。用 4 到 5 mL 新鲜冷藏的 L 15 培养基冲洗过滤器。然后将 2， 500 RCF 离心 4 摄氏度 5 分钟。

对于处理的每个大鼠幼崽大脑，通过向每个培养瓶中加入 12 毫升战前培养基来制备无菌 T 75 培养瓶。接下来，从沉淀的细胞中吸出 sup natant 后，向细胞沉淀中加入 5 至 6 毫升培养基，用 10 毫升移液管上下移液 10 次。然后将等体积的细胞悬液转移到每个 T 75 培养瓶中。

将培养瓶在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中孵育 1 至 3 周，让细胞在初次铺板后的前 5 天不受干扰地放置。5 天后，用 12 mL 新鲜培养基替换每个培养瓶中的条件培养基，以实现汇合。这必须非常小心地进行，不要接触细胞附着的培养瓶底部。

一旦混合的神经胶质细胞培养物完全汇合，从培养箱中取出培养瓶。用参数盖住培养瓶盖，以防止与环境空气进行气体交换，并将培养瓶放入设置为 100 RPS 和 37 摄氏度的振荡培养箱中一小时，一小时后，使用 10 毫升移液器从培养瓶中收集培养基，不破坏星形胶质细胞层，并分配到 50 毫升锥形管中。将新鲜培养基加入培养瓶中，然后放回培养箱中。

在 2， 500 RCF 下在 4 摄氏度下离心试管 5 分钟后，吸出旋后部分并将细胞重新悬浮在 1 毫升小胶质细胞铺板培养基中。然后使用人细胞仪和标准程序对细胞进行计数。确定细胞数量后，加入适当体积的小胶质细胞铺板培养基以获得细胞。

浓度为 2 倍 10 至每毫升板中的 5 个细胞是适合实验的，并放回培养箱中。让小胶质细胞附着过夜。细胞已使用对 IBA one 具有特异性的抗体（一种小胶质细胞标志物）进行免疫染色，该抗体呈红色。

细胞对培养物的污染最小，如使用新 NA 神经元标志物抗体进行免疫染色的显微镜图像所示，该抗体呈红色。载玻片已用 DPI 进行反染，以将所有细胞核染成蓝色。该图显示了 GFAP 和星形胶质细胞标志物的免疫染色。

星形胶质细胞呈绿色。在这里，我们看到了用 CC one（一种少突胶质细胞标志物）特异性抗体染色的小胶质细胞培养物免疫染色的图像。少突胶质细胞呈红色。

该直方图显示了每种细胞类型的定量结果。可以看出，铺板的小胶质细胞培养物纯度超过 90%。该荧光显微镜图像显示了一种小胶质细胞培养物，该培养物已被 IBA 1 免疫染色。

红色区域是荧光标记的乳胶珠。此处显示的小胶质细胞培养物已用每毫升 1 纳克脂肪多糖处理，可以看出小胶质细胞吞噬了荧光标记的乳胶珠。在这里，吞噬作用测定的结果显示在直方图中。

用 LPS 治疗后看到吞噬作用增加。该图显示，添加 LPS 后，小胶质细胞培养物中的一氧化氮产生也增加。最后，直接或 transwell 插入分离的小胶质细胞神经元培养物在与 LPS 孵育后都容易增加细胞死亡，通过乳酸脱氢酶释放来测量一旦掌握了该技术的第一部分，直到接种到 T 75 中，烧瓶可以在一个半小时内完成，完整的程序可以在两周内完成。

优化此协议期间的另一个考虑因素是确定持续时间。在分离原代小胶质细胞进行接种之前，应保持混合神经胶质细胞培养物建立高纯度培养物。使用该程序，可以在体外评估小胶质细胞功能，一氧化氮产生、细胞因子和趋化因子释放的测量，以及阶段活性都可以使用常规实验室测定来确定和测量。

因此，随着该程序的发展，神经科学领域的研究人员有能力在均匀的细胞环境中探索小胶质细胞的活动，并研究它们在各种神经系统条件下的作用。观看此视频后，您应该对如何从新生大鼠大脑制备原代小胶质细胞培养物有很好的了解。首先分离大脑并去除脑膜，然后将大脑匀浆并接种到培养瓶中，然后将培养瓶孵育 10 至 14 天，直到星形胶质细胞单层达到汇合。

最后一步是摇动培养瓶以释放生长在星形胶质细胞单层顶部的小胶质细胞，从而产生纯化的小胶质细胞培养物。