Name: 在三维自组装多肽水凝胶的人类神经祖细胞的培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学习利用自组装多肽水凝胶三维支架培养人类神经祖细胞的方法，通过流式细胞术分析神经元分化与凋亡标志物。该技术可加速神经分化定量研究，适用于干细胞生物学与神经科学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 Norman Krüger 提供出色的技术支持。

1. 第1部分：在PuraMatrix中培养人神经前体细胞（hNPCs）
<ol>
	<li>在制备浓度为0.25%且不含层粘连蛋白的PuraMatrix支架之前，需预先配制以下溶液</li>
	<li>配制含有20%蔗糖和含有10%蔗糖的溶液，均用无菌蒸馏水溶解。</li>
	<li>对于溶液1，取120 μl 20%蔗糖溶液与120 μl蒸馏水在1.5 ml锥形管中混合。</li>
	<li>对于溶液2，取60 μl PuraMatrix溶液与60 μl 20%蔗糖溶液在1.5 ml锥形管中混合。</li>
</ol>
制备含有层粘连蛋白（每100 μl基质含8 μg）且PuraMatrix浓度为0.25%的支架时，需准备以下溶液。
<ol class="lroman">
	<li>配制溶液1：在1.5 ml锥形管中加入72 μl蒸馏水、120 μl 20%蔗糖溶液和48 μl层粘连蛋白。</li>
	<li>配制溶液2：在1.5 ml锥形管中混合60 μl PuraMatrix溶液与60 μl 20%蔗糖溶液。</li>
</ol>
<ol start="5">
	<li>对于将细胞包埋于PuraMatrix中，需准备一个4孔细胞培养板，并在其中两个孔中放置灭菌的玻璃盖玻片（直径13 mm）。将培养板存放于超净工作台中以备后续使用。玻璃盖玻片仅用于免疫细胞化学研究。若不进行免疫细胞化学染色，此步骤可省略。</li>
</ol>
为了将人神经前体细胞（hNPCs）包封在三维支架中，需准备以下溶液。将Benzonase用胰蛋白酶/EDTA溶液稀释，稀释比例为1:10,000。配制胰蛋白酶抑制剂/Benzonase溶液：DMEM/F12培养基中加入Benzonase至终浓度25 U/μl、1%人血清白蛋白（HSA）以及胰蛋白酶抑制剂（终浓度0.5 mg/ml）。
<ol start="6">
	<li>加入 500 μl 胰蛋白酶/苯佐核酸酶溶液，于培养箱（37°C，5% CO2）中孵育 5 分钟以解离细胞。使用胰蛋白酶抑制剂/苯佐核酸酶溶液终止反应。随后将解离的细胞在 3000 × g 条件下离心 5 分钟。用 5 ml 10% 蔗糖溶液洗涤细胞，再次离心。弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 10% 蔗糖溶液中，最终细胞悬液浓度应为 1×106 个细胞/ml。</li>
</ol>
由于PuraMatrix溶液的pH值较低，可能对细胞有害，因此接下来的步骤1.8至1.11应尽快完成。
<ol start="8">
	<li>将60 μl细胞悬液与溶液1混合。</li>
	<li>将含有细胞的120 μl溶液1缓慢加入含有溶液2的锥形管中，并轻轻混匀。</li>
	<li>立即将100 μl混合液分别加入置于4孔板内的盖玻片上。</li>
	<li>每孔缓慢加入200 μl细胞培养基，2–3分钟后再次加入200 μl。这将启动基质的自组装过程。</li>
	<li>将细胞置于洁净台内的加热板或洁净台的加热区域，于37 °C孵育1小时。在此期间应尽量避免移动培养板，以免影响基质的组装。</li>
	<li>用1000 μl移液器吸除大部分培养基，但不要完全吸干，以防基质干裂。加入500 μl培养基洗涤基质10分钟。最后吸除旧培养基，加入500 μl新鲜培养基，将培养板放入培养箱（37°C，5% CO2）中。由于基质对震动敏感，应尽量减少移动培养板，若条件允许，应将其放置于独立的培养箱中。</li>
	<li>本实验所用的人神经前体细胞（hNPCs）在3D支架中增殖7天后，通过去除生长因子诱导其分化13。每2–3天更换一次培养基。</li>
</ol>
2. 第二部分：完整基质的免疫细胞化学染色
<ol>
	<li>染色操作前需预先配制以下溶液：封闭缓冲液，由5%正常山羊血清和0.3% Triton X-100溶于PBS中制成；4%多聚甲醛溶液，以0.1 M PBS为基础配制；如需进行细胞核染色，还需配制含100 ng/mL DAPI（4',6-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸盐）的PBS溶液。样品使用Mowiol与DABCO混合液封片。</li>
	<li>洗涤基质时，用1000 μl移液器吸除培养基，并用PBS洗涤支架一次，每次5分钟。</li>
	<li>固定支架时，吸除PBS，向每孔中加入400 μl 4%多聚甲醛溶液（溶于0.1 M PBS），室温孵育30分钟。固定后的支架可保存于含0.02% NaN3的PBS中，4°C条件下可保存数周至数月。</li>
	<li>染色前，用PBS洗涤支架5分钟。</li>
	<li>将支架置于封闭缓冲液中孵育。封闭液每2–3小时更换一次，共更换三次，随后于4°C过夜孵育。</li>
	<li>吸除封闭缓冲液，加入用含1%正常山羊血清的PBS稀释的一抗溶液，于4°C过夜孵育。</li>
	<li>去除一抗溶液，用PBS洗涤支架4次，每次2小时，随后于4°C过夜洗涤，全程避光。</li>
	<li>吸除PBS，加入用含1%正常山羊血清的PBS稀释的二抗溶液，室温避光孵育4小时。</li>
	<li>用PBS洗涤样品4–6次，每次1小时，随后于4°C过夜洗涤，全程避光。</li>
	<li>如需进行细胞核染色，可加入400 μl DAPI溶液，孵育30分钟。</li>
	<li>封片时需使用显微镜载玻片。在载玻片上滴加50 μl Mowiol/DABCO封片剂。从4孔板中取出盖玻片，小心地将其放置于封片剂上。</li>
	<li>本实验采用Biozero 8000显微镜（Keyence，德国卡尔斯鲁厄）获取单张显微图像及z轴层扫图像（z-stacks）。每个z轴层扫包含30张单图，层间距离为1–2 μm。使用配套分析软件去除荧光成像固有的模糊效应后，生成z轴层扫的完整投影图像。</li>
</ol>
3. 第三部分：从支架中释放hNPCs用于流式细胞术分析
<ol>
	<li>在从支架中释放细胞之前，先用 500 μl HBSS 清洗支架。</li>
	<li>使用 1000 μl 移液器将支架转移至含有细胞培养基的 15 ml 锥形管中。</li>
	<li>为机械性破坏支架，用 1000 μl 移液器反复重悬细胞溶液数次，随后在 3000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>用移液器吸除上清液，加入 500 μl 胰蛋白酶/苯佐内酯溶液，并反复重悬细胞沉淀数次。</li>
	<li>将细胞在 37°C 下孵育 5 分钟以进行胰蛋白酶/苯佐内酯消化。为终止反应，加入 1 ml 胰蛋白酶抑制剂/苯佐内酯溶液，并反复吹打数次。</li>
	<li>将细胞悬液在 3000 × g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液后用 2 ml HBSS 缓冲液洗涤细胞。重复此步骤两次。该步骤可去除基质碎片。</li>
	<li>将细胞悬液通过细胞筛网（孔径 70 μm）过滤，以去除细胞团块，并将细胞收集于细胞培养基中。所得细胞可重新接种，例如接种于盖玻片上用于膜片钳或荧光检测等功能研究。若需进行流式细胞术分析，应立即固定细胞（见 4.1）。</li>
</ol>
4. 第4部分：通过流式细胞术定量分析βIII-微管蛋白阳性细胞
<ol>
	<li>将步骤 3.7 中获得的释放细胞用 1% PFA 在室温下固定 15 分钟。</li>
	<li>将细胞悬液在 3000 × g 条件下离心 5 分钟，并弃去上清液。如需保存以备后续分析，可将细胞重悬于洗涤缓冲液（含 0.5% BSA 和 0.02% 叠氮化钠的 PBS）中，并置于 4°C 保存。</li>
	<li>为进行流式细胞术前处理，将细胞悬液在 350 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，然后将细胞重悬于 25 μl 抗体溶液中。第一抗体需用皂苷缓冲液按 1:100 的比例稀释，例如 βIII-微管蛋白抗体。皂苷缓冲液由 PBS 配制，其中皂苷浓度为 0.5%，BSA 浓度为 0.5%，叠氮化钠浓度为 0.02%。</li>
	<li>将细胞悬液与第一抗体在室温下于摇床上孵育 2 小时。设置阴性对照组时，制备不含第一抗体的样本。</li>
	<li>第一次洗涤时，直接向细胞中加入 300 μl 皂苷缓冲液，将细胞悬液在 350 × g 条件下离心 5 分钟。第二次洗涤时，弃去上清液，加入 300 μl 缓冲液，再在 350 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 25 μl 含第二抗体的溶液（例如 Alexa Fluor 647，1:1000，溶于皂苷缓冲液中）。将细胞在室温下避光孵育 1 小时。</li>
	<li>第一次洗涤时，直接向细胞中加入 300 μl 皂苷缓冲液，将细胞悬液在 350 × g 条件下离心 5 分钟。第二次洗涤时，弃去上清液，加入 300 μl 缓冲液，再在 350 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 500 μl 洗涤缓冲液中，用于流式细胞术分析。</li>
</ol>
5. 代表性结果
图1展示了在自组装水凝胶支架PuraMatrix中培养的人神经前体细胞（hNPCs）的一个示例。在未修饰的PuraMatrix（PM）中，hNPCs以类球状结构生长。在此培养条件下，细胞在透射光下难以识别，但球状结构之间可见突起形成的束状结构（图1A）。根据所用细胞类型的培养条件，可对基质进行修饰，例如添加层粘连蛋白（laminin）。对于ReNcell VM（Millipore）这一hNPC细胞系，添加层粘连蛋白可诱导形成细胞聚集密度较低但分布更均匀的生长模式（图1B）。无论是否进行修饰，该基质均可用于研究神经元分化等过程。图1C展示了hNPCs经神经元标志物βIII-微管蛋白染色的结果。在本示例中，细胞在基质中培养7天，随后撤除生长因子EGF和bFGF以诱导分化，并继续分化4天13。细胞胞体及细胞形成的致密突起网络清晰可辨。然而，显然对细胞数量进行定量分析十分耗时，因为必须分析基质多个区域的大量图像，才能获得用于统计分析的可靠数据集。图1D显示了从基质中释放后接种于盖玻片上的细胞示例。这些细胞可用于功能研究。
从三维支架中释放细胞后，可对多种参数进行分析，例如标志物蛋白的表达、通过Annexin V/PI染色或TUNEL实验检测细胞存活率等。图2展示了通过流式细胞术分析βIII-微管蛋白+细胞百分比的示例。图2A显示了阴性对照（未标记βIII-微管蛋白的细胞），此类对照用于确定后续检测βIII-微管蛋白+细胞的设门范围（图2B）。图2C比较了人工细胞计数与流式细胞术分析的结果。βIII-微管蛋白+细胞的百分比通过荧光图像中总细胞数（通过细胞核DAPI染色计数）和βIII-微管蛋白+细胞数量的统计来确定。
<img alt="显微镜下的细胞培养：细胞结构、神经网络、荧光染色图像。" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 在自组装肽水凝胶 PuraMatrix 中培养的人神经前体细胞（hNPCs）。 A) 包埋于 PuraMatrix（PM）中的 hNPCs 形成球形、致密堆积的结构，球体直径可达数百 μm。在球体之间可见由细胞形成的突起束（箭头所示）。B) 在添加层粘连蛋白（laminin）的 PuraMatrix（PML）中包埋的细胞生长为较松散、分布更均匀的结构。在添加层粘连蛋白的基质中，可在较稀疏区域观察到单个细胞（箭头所示），但难以准确量化细胞数量。C) hNPCs 在 PML 中分化 4 天后表达神经元标志物 βIII-微管蛋白（绿色）。为评估阳性细胞百分比，需通过细胞核染色（如 DAPI，蓝色）确定总细胞数。该显微照片为使用 Biozero-8000 显微镜拍摄的 z 轴层扫图像的全投影。D) 从基质中释放的细胞可接种于盖玻片等表面，用于进一步的功能研究。该显微照片显示细胞在释放后继续培养 3 天的结果。βIII-微管蛋白染色（红色）显示其形态与三维支架内培养的细胞相似。
<img alt="流式细胞术图示（A、B）和图表（C），显示βIII-微管蛋白细胞随时间的分化情况。" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 从PuraMatrix中释放的细胞进行流式细胞术分析。 为克服显微照片定量分析耗时的问题，我们采用了一种从PuraMatrix中释放细胞的方案，从而实现通过流式细胞术进行更快速的分析。A）未染色细胞作为阴性对照，用于设定后续分析（如βIII-微管蛋白阳性细胞）的门控（黑色框）。B）为定量βIII-tubulin+细胞的比例，使用了在阴性对照中设定的相同门控。阳性细胞位于x轴右侧，其中还观察到一个中间群体（虚线框），很可能代表细胞碎片。C）手动计数与流式细胞术计数结果的比较显示，流式细胞术检测出更高比例的阳性细胞，且βIII-tubulin+细胞数量随时间变化的趋势相似，表明该流式细胞术方案具有可靠性。

<ol><li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer.+Biol%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li>
<li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li>
<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture%3A+building+a+better+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li>
<li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li>
<li>Teng, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+mediated+by+a+unique+polymer+scaffold+seeded+with+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).</li>
<li>Silva, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303, 1352-1355 (2004).</li>
<li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+ONE%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).</li>
<li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li>
<li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).</li>
<li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+oligopeptide+matrices+support+mammalian+cell+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment.</a> Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).</li>
<li>Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+significantly+enhance+osteoblast+proliferation%2C+differentiation+and+3-D+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+ONE%22%5BJournal%5D)">Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration.</a> PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).</li>
<li>Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compatibility+of+human+fetal+neural+stem+cells+with+hydrogel+biomaterials+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro.</a> Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).</li>
<li>Ortinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Eng.+Online%22%5BJournal%5D)">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).</li>
<li>Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PuraMatrix+Encapsulation+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).</li>
<li>Morgan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+neurons+derived+from+human+neural+progenitor+cells+by+veratridine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine.</a> Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).</li>
<li>Giese, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+and+the+effect+of+oxygen+during+proliferation+and+differentiation+of+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells.</a> BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).</li>
<li>Schmöle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+indolylmaleimide+acts+as+GSK-3beta+inhibitor+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).</li>
<li>PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPuraMatrix%2C+BD+%22Guidelines+for+Use%22">Guidelines for Use</a>. Catalog No 354250, BD. (2006).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

使用三维支架为研究不同类型细胞在更接近体内环境的细胞培养条件下的发育提供了机会。然而，在进行神经元分化分析或功能性研究时，必须克服一些障碍，才能获得可靠的定量细胞类型等数据。
本文描述了在基于多肽水凝胶PuraMatrix的支架中培养人神经前体细胞（hNPCs），以及随后将细胞释放用于二维条件下的研究，从而便于使用FACS或功能检测等工具。近期，我们通过原子力显微镜证明了PuraMatrix浓度对三维支架形成的影响，并研究了其对细胞存活和分化的作用。13 然而需要注意的是，不同细胞类型可能需要不同的培养条件，或由其他材料（如Matrigel或胶原蛋白）构成的基质。
细胞释放的方案基于制造商提供的方案18 其方法可与制备原代神经元培养物的常规方案相比较，即首先通过机械法分离细胞，随后利用酶消化去除周围组织成分。细胞对此处理过程具有良好的耐受性，保持活性，并重新长出突起，当再次接种于层粘连蛋白（laminin）包被的表面时，可表达神经元标志物如βIII-微管蛋白。本研究...

<table><tbody><tr><td>PuraMatrix 肽水凝胶 </td><td>BD 生物科学</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白 I</td><td>Cultrex</td><td>400-2009090</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>卡尔罗斯特有限责任公司</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco</td><td>Biochrom AG</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>14170-088</td><td>汉克斯&amp;rsquo; 平衡盐溶液 1X</td></tr><tr><td>&amp;#946;III-tubulin 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-51670</td><td>小鼠，单克隆，1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A 11029</td><td>山羊 &amp;alpha; 小鼠，1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A 11031</td><td>山羊 &amp;alpha; 小鼠，1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A 21235</td><td>山羊 &amp;alpha; 小鼠，1:1000</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 试剂</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Aldrich</td><td>D2,780-2</td><td>1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷 98%</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>BD 生物科学</td><td>352350</td><td>70 &amp;#x03BC;m 孔径大小</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>默克 &amp;amp; Co., Inc.</td><td>7695</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase 250 U/&amp;mu;l</td><td>默克 &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.01654.0001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522（500 mg）</td><td></td></tr><tr><td>20% HSA</td><td>Octapharma</td><td>人血清白蛋白 Kabi 20%</td><td></td></tr></tbody></table>

三维自组装肽水凝胶中人类神经前体细胞的培养

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

为了探索神经系统疾病或神经退行性疾病中基于细胞的标准化治疗方法，研究三维（3D）支架对细胞生长、增殖以及最终神经元分化的影响具有重要意义。相较于二维培养，三维结构被认为能够提供更接近体内环境的培养条件。在再生医学领域，将生物材料支架与神经干细胞及前体细胞相结合，展现出巨大的治疗潜力1-5。已有研究表明，模拟三维环境的培养系统可影响多种干细胞和前体细胞的增殖与分化。其中，三维微环境的构建与功能化对于决定包埋细胞的存活状态及其命运至关重要6-8。本研究采用PuraMatrix9,10（RADA16，PM），这是一种基于多肽的水凝胶支架，已被广泛描述并用于研究三维环境对不同类型细胞的影响7,11-14。PuraMatrix易于定制，其纳米纤维为人工合成，所提供的三维培养系统具有高度可靠性，且不含异源成分。
最近，我们研究了PM浓度对支架结构形成的影响13。在本研究中，所使用的PM浓度直接影响了三维结构的形成，这一结果通过原子力显微镜得以证实。随后对人神经前体细胞（hNPCs）的存活与分化情况进行分析，发现所用PM浓度对包埋细胞的命运具有影响。然而，通过免疫荧光技术对细胞存活或神经元分化进行分析时存在一些困难。为了获得可靠的数据，必须确定基质内细胞的总数，从而计算出由βIII-微管蛋白标记的神经元细胞等特定细胞类型的相对数量。这就要求采用共聚焦显微镜或能够获取样品z轴层扫描图像的荧光显微镜等类似技术，对支架进行三维分析。此外，此类分析极为耗时。
本文展示了一种从3D支架中释放细胞的方法，以便后续进行分析，例如流式细胞术。在本实验方案中，人神经前体细胞（hNPCs）ReNcell VM细胞系（Millipore USA）在由PuraMatrix（PM）或添加了层粘连蛋白的PuraMatrix（PML）构成的3D支架中进行培养和分化。据我们经验，0.25%的PM浓度最适合细胞培养13，但该浓度可根据其他细胞类型进行调整12。释放后的细胞可用于免疫细胞化学研究，并进一步通过流式细胞术进行分析。该方法可加快分析速度，更重要的是，所得数据基于更广泛的样本基础，从而提高了数据的可靠性。

本文描述了利用自组装三维支架培养人类神经前体细胞的方法。我们提供了一种从支架中释放细胞的方案，以便后续对细胞进行分析，例如通过流式细胞术。该方案可适用于其他细胞类型，以开展深入的机制性研究。

三维支架对细胞生长、增殖以及最终神经元分化的影响在寻找新型...研究中备受关注

本实验的总体目标是加快分析三维培养环境下人神经前体细胞的神经元分化过程。首先，将细胞培养在基于自组装肽的纯水凝胶基质中；随后，将细胞从三维支架中释放出来，从而实现这一目标。第三步中，对细胞进行免疫植物化学染色，作为最后一步。通过流式细胞术分析对细胞进行计数。最终，可通过针对神经元标志物或凋亡标志物的流式细胞术分析，分别确定神经元分化率或凋亡率。采用该技术，神经分化定量的速度显著加快，且Optane数据西区采用更广泛的基础以及显微摄影技术。为将细胞包埋于纯基质中，首先将无菌的直径13毫米的玻璃盖玻片分别放入四孔细胞培养板的两个孔中。随后将培养板置于洁净台中，以备后续使用。接下来，通过加入2.5毫升新鲜配制的胰蛋白酶，使人神经前体细胞（hNPCs）脱离培养表面。将苯佐溶液加入培养皿中，于37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育细胞悬液。五分钟后，用胰蛋白酶抑制剂苯佐溶液终止反应。然后在室温下以3000 × g离心五分钟，使脱离的细胞沉淀，再用5毫升10%蔗糖溶液重悬所得沉淀，并在相同的离心条件下洗涤细胞悬液。弃去上清液 Resus 后，将沉淀重悬于蔗糖溶液中，使细胞终浓度为每毫升1×10⁶个细胞。随后尽快将60 µL细胞悬液与溶液一混合，取120 µL该混合悬液加入含有溶液二的锥形管中，轻轻混匀，然后立即向四孔板中的每个盖玻片上各加入100 µL混合液。最后，向每个孔中缓慢加入200 µL细胞培养基。两到三分钟后，向孔中再加入 200 µL 细胞培养基，以启动基质的自组装。将细胞在洁净工作台的加热区域于 37 °C 下孵育一小时。基质组装完成后，尽量避免移动细胞培养板，使用 1000 µL 移液器吸除大部分但非全部培养基，以防止基质干燥。然后用500 µL新鲜培养基洗涤基质10分钟。最后移除洗涤用培养基。再加入500 µL培养基，并将培养板放入培养箱中。如果可能，将支架置于独立的培养箱中保存，以避免染色实验第一天时结构受到意外震荡。使用 1000 微升移液器移除支架中的培养基，随后用 PBS 清洗支架一次，持续五分钟。然后吸除 PBS，每孔加入 400 µL 多聚甲醛以固定基质，在室温下孵育 30 分钟。支架固定后，用 500 µL PBS 洗涤 5 分钟。随后将结构与封闭缓冲液在 4 °C 过夜孵育，孵育时间为 6 至 9 小时，每 2 至 3 小时更换一次缓冲液，次日取出封闭缓冲液。将抗体溶液加入孔中，并在4°C下再次孵育基质过夜。随后，移除一抗溶液，用500 µL PBS清洗支架，每次8小时，每2小时更换一次PBS，然后在4°C下用新鲜PBS继续过夜清洗。过夜清洗后，移除PBS，将支架与二抗溶液在室温避光条件下孵育4小时。随后用 PBS 每次一小时，共洗涤样品四至六次，然后将结构置于新鲜 PBS 中，于 4 摄氏度避光孵育过夜。现在，在载玻片上加入 50 微升 MOE all dab co，以准备基质的封片。然后小心地将盖玻片逐个封于载玻片上。最后，使用荧光显微镜获取单个显微图像和Z轴层扫图像，类似于此处所示的H NPCs经绿色染色标记神经元标志物beta three tubulin的结果。用500微升HBSS洗涤支架1分钟之后，使用1000微升移液器将支架转移至15毫升锥形管中。接着，用1000微升移液器反复吹打细胞悬液数次，以机械方式破坏基质，随后将支架悬液在室温下以3000 × g离心5分钟，用移液器吸除上清液，再通过反复吹打将沉淀重悬于500微升胰蛋白酶苯酯溶液中。然后在 37 摄氏度下孵育细胞。五分钟后加入一毫升胰蛋白酶抑制剂终止反应。在相同离心条件下离心细胞悬液后，用移液器反复吹打数次苯扎南酶溶液。用两毫升 HBSS 缓冲液洗涤细胞两次，以去除任何基质碎片。最后，在相同条件下，将细胞悬液通过 70 微米细胞筛离心，以去除聚集体，并将细胞收集至细胞培养基中。首先，在摇床上，室温下用 1% 多聚甲醛固定解离的细胞 15 分钟。离心收集细胞后，将沉淀重悬于洗涤缓冲液中。随后在4°C、350 × g条件下离心10分钟，再将所得沉淀重悬于25 µL抗体溶液中。将细胞悬液在室温下于摇床上孵育2小时。然后向样品中直接加入 300 µL pon 缓冲液，并在相同的离心条件下将细胞悬液洗涤两次。第二次洗涤后，加入 25 µL 二抗，然后在室温避光孵育一小时。再次用皂苷缓冲液洗涤细胞两次后，将沉淀重悬于 500 µL 洗涤缓冲液中，用于流式细胞术分析。在此图中，显示了包裹在纯基质中的H NPCs，细胞生长为球形、致密堆积的结构，球体直径可达数百微米。细胞之间可见由细胞形成的突起束，如白色箭头所示。尽管单个细胞难以辨认，但在添加了层粘连蛋白的纯基质中包裹的细胞则生长为密度较低的结构，并且分布更为均匀，如本图所示，在密度较低的区域甚至可以识别出单个细胞，如黑色箭头所示。此处，H NPCs在添加层粘连蛋白的纯基质中分化了四天，绿色染色显示神经元标志物的表达。通过展示 βIII 微管蛋白以评估阳性细胞的百分比。总细胞数量可通过计数经 DAPI 染色呈蓝色的细胞核来确定。该显微照片代表了使用荧光显微镜拍摄的 Z 轴层叠图像的完整投影。从基质中释放的细胞可再次接种，例如本图所示，将其接种于盖玻片上以进行后续功能研究。该显微照片显示了经过前述释放步骤后、在三维环境中培养三天的细胞。红色显示的βIII微管蛋白染色结果表明，其形态与三维支架中培养的细胞相似，以未染色细胞作为阴性对照。图中以黑色框表示的门控区域（GA）用于后续分析该点图中βIII微管蛋白阳性细胞，阳性细胞出现在X轴右侧黑色框内，虚线框内为中间群体，很可能代表细胞碎片，也可观察到。本最终图示比较了人工细胞计数与流式细胞术计数的结果。如空心黑色方块所示，通过流式细胞术分析可检测到更高比例的阳性细胞，而实心黑色三角形所示的人工计数通常检测到的阳性细胞比例较低。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用贫瘠培养基在三维支架中培养边缘型 MPC，并掌握如何将细胞从支架中释放以进行流式细胞分析。

cultivation-human-neural-progenitor-cells-3-dimensional-self

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

在三维自组装多肽水凝胶的人类神经祖细胞的培养

本文描述了利用数字微镜装置在常规细胞培养基底上进行动态掩模投影光刻，快速制备微加工神经培养系统的简单技术。这些培养系统可能更接近天然生物结构，且所述技术可针对多种应用进行调整。...

使用动态掩模投影光刻技术制备用于神经培养系统的微图案化水凝胶

本方案展示了在定制设计的电趋化室中建立二维和三维环境的方法，可用于追踪细胞 体内/离体 利用单细胞水平的时间延时记录，以研究趋电性（galvanotaxis/electrotaxis）及其他细胞对直流电场（DC...

电场控制下神经前体细胞在二维和三维环境中的定向迁移

本视频展示了人类神经干细胞在三维支架内的发育与分化过程。支架表面的层粘连蛋白涂层可促进细胞黏附，而无生长因子的神经培养基则诱导细胞分化为神经前体细胞。这些细胞在多孔结构中向多个方向延伸其突起，形成三维培养体系。...

利用多孔支架将人神经干细胞分化为三维培养

本视频展示了一种建立胶质细胞三维培养的技术。将来源于大鼠脑的胶质细胞包埋在含有细胞外基质成分的光交联聚合物基质中。在培养基中孵育后，胶质细胞在支撑基质内增殖，形成三维培养体系。...

建立大鼠脑源性胶质细胞的三维培养

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

本文介绍了一种大鼠脑源性胶质细胞（包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）的三维培养方案。我们展示了原代细胞培养、甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶的合成、HAMA光聚合与细胞包封，以及用于共聚焦显微镜和扫描电子显微镜成像的样品处理方法。...

改进的原代胶质细胞三维水凝胶培养方法 体外 神经炎症建模

本文介绍了一种在自组装肽支架中建立三维培养系统以促进去分化的成人关节软骨细胞向类软骨组织分化的实验方案。...

在三维肽支架中培养哺乳动物细胞

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

本文提供了一种在三维基质中分析生长轴突行为的方法，以模拟其自然发育过程。...

生成基于三维胶原的水凝胶以分析神经系统发育过程中的轴突生长与行为

本文介绍了一种利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和星形胶质细胞进行三维生物打印共培养的实验方案。该共培养模型在96孔或384孔板中的水凝胶支架内构建，打印后细胞存活率高，7天内可见明显的神经突生长，并表达两种细胞类型的成熟标志物。...

利用人iPSC来源的神经元-星形胶质细胞共培养体系进行三维生物打印以用于筛选应用

学习利用自组装多肽水凝胶三维支架培养人类神经祖细胞的方法，通过流式细胞术分析神经元分化与凋亡标志物。该技术可加速神经分化定量研究，适用于干细胞生物学与神经科学研究。

三维自组装肽水凝胶中人类神经前体细胞的培养

探索更多视频