三维自组装肽水凝胶中人类神经前体细胞的培养

本实验的总体目标是加快分析三维培养环境下人神经前体细胞的神经元分化过程。首先，将细胞培养在基于自组装肽的纯水凝胶基质中；随后，将细胞从三维支架中释放出来，从而实现这一目标。

第三步中，对细胞进行免疫植物化学染色，作为最后一步。通过流式细胞术分析对细胞进行计数。最终，可通过针对神经元标志物或凋亡标志物的流式细胞术分析，分别确定神经元分化率或凋亡率。

采用该技术，神经分化定量的速度显著加快，且Optane数据西区采用更广泛的基础以及显微摄影技术。为将细胞包埋于纯基质中，首先将无菌的直径13毫米的玻璃盖玻片分别放入四孔细胞培养板的两个孔中。随后将培养板置于洁净台中，以备后续使用。接下来，通过加入2.5毫升新鲜配制的胰蛋白酶，使人神经前体细胞（hNPCs）脱离培养表面。

将苯佐溶液加入培养皿中，于37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育细胞悬液。五分钟后，用胰蛋白酶抑制剂苯佐溶液终止反应。然后在室温下以3000 × g离心五分钟，使脱离的细胞沉淀，再用5毫升10%蔗糖溶液重悬所得沉淀，并在相同的离心条件下洗涤细胞悬液。

弃去上清液 Resus 后，将沉淀重悬于蔗糖溶液中，使细胞终浓度为每毫升1×10⁶个细胞。随后尽快将60 µL细胞悬液与溶液一混合，取120 µL该混合悬液加入含有溶液二的锥形管中，轻轻混匀，然后立即向四孔板中的每个盖玻片上各加入100 µL混合液。最后，向每个孔中缓慢加入200 µL细胞培养基。

两到三分钟后，向孔中再加入 200 µL 细胞培养基，以启动基质的自组装。将细胞在洁净工作台的加热区域于 37 °C 下孵育一小时。基质组装完成后，尽量避免移动细胞培养板，使用 1000 µL 移液器吸除大部分但非全部培养基，以防止基质干燥。

然后用500 µL新鲜培养基洗涤基质10分钟。最后移除洗涤用培养基。再加入500 µL培养基，并将培养板放入培养箱中。

如果可能，将支架置于独立的培养箱中保存，以避免染色实验第一天时结构受到意外震荡。使用 1000 微升移液器移除支架中的培养基，随后用 PBS 清洗支架一次，持续五分钟。

然后吸除 PBS，每孔加入 400 µL 多聚甲醛以固定基质，在室温下孵育 30 分钟。支架固定后，用 500 µL PBS 洗涤 5 分钟。随后将结构与封闭缓冲液在 4 °C 过夜孵育，孵育时间为 6 至 9 小时，每 2 至 3 小时更换一次缓冲液，次日取出封闭缓冲液。

将抗体溶液加入孔中，并在4°C下再次孵育基质过夜。随后，移除一抗溶液，用500 µL PBS清洗支架，每次8小时，每2小时更换一次PBS，然后在4°C下用新鲜PBS继续过夜清洗。过夜清洗后，移除PBS，将支架与二抗溶液在室温避光条件下孵育4小时。

随后用 PBS 每次一小时，共洗涤样品四至六次，然后将结构置于新鲜 PBS 中，于 4 摄氏度避光孵育过夜。现在，在载玻片上加入 50 微升 MOE all dab co，以准备基质的封片。然后小心地将盖玻片逐个封于载玻片上。

最后，使用荧光显微镜获取单个显微图像和Z轴层扫图像，类似于此处所示的H NPCs经绿色染色标记神经元标志物beta three tubulin的结果。用500微升HBSS洗涤支架1分钟之后，使用1000微升移液器将支架转移至15毫升锥形管中。接着，用1000微升移液器反复吹打细胞悬液数次，以机械方式破坏基质，随后将支架悬液在室温下以3000 × g离心5分钟，用移液器吸除上清液，再通过反复吹打将沉淀重悬于500微升胰蛋白酶苯酯溶液中。

然后在 37 摄氏度下孵育细胞。五分钟后加入一毫升胰蛋白酶抑制剂终止反应。在相同离心条件下离心细胞悬液后，用移液器反复吹打数次苯扎南酶溶液。

用两毫升 HBSS 缓冲液洗涤细胞两次，以去除任何基质碎片。最后，在相同条件下，将细胞悬液通过 70 微米细胞筛离心，以去除聚集体，并将细胞收集至细胞培养基中。首先，在摇床上，室温下用 1% 多聚甲醛固定解离的细胞 15 分钟。

离心收集细胞后，将沉淀重悬于洗涤缓冲液中。随后在4°C、350 × g条件下离心10分钟，再将所得沉淀重悬于25 µL抗体溶液中。将细胞悬液在室温下于摇床上孵育2小时。

然后向样品中直接加入 300 µL pon 缓冲液，并在相同的离心条件下将细胞悬液洗涤两次。第二次洗涤后，加入 25 µL 二抗，然后在室温避光孵育一小时。再次用皂苷缓冲液洗涤细胞两次后，将沉淀重悬于 500 µL 洗涤缓冲液中，用于流式细胞术分析。

在此图中，显示了包裹在纯基质中的H NPCs，细胞生长为球形、致密堆积的结构，球体直径可达数百微米。细胞之间可见由细胞形成的突起束，如白色箭头所示。尽管单个细胞难以辨认，但在添加了层粘连蛋白的纯基质中包裹的细胞则生长为密度较低的结构，并且分布更为均匀，如本图所示，在密度较低的区域甚至可以识别出单个细胞，如黑色箭头所示。此处，H NPCs在添加层粘连蛋白的纯基质中分化了四天，绿色染色显示神经元标志物的表达。

通过展示 βIII 微管蛋白以评估阳性细胞的百分比。总细胞数量可通过计数经 DAPI 染色呈蓝色的细胞核来确定。该显微照片代表了使用荧光显微镜拍摄的 Z 轴层叠图像的完整投影。

从基质中释放的细胞可再次接种，例如本图所示，将其接种于盖玻片上以进行后续功能研究。该显微照片显示了经过前述释放步骤后、在三维环境中培养三天的细胞。红色显示的βIII微管蛋白染色结果表明，其形态与三维支架中培养的细胞相似，以未染色细胞作为阴性对照。

图中以黑色框表示的门控区域（GA）用于后续分析该点图中βIII微管蛋白阳性细胞，阳性细胞出现在X轴右侧黑色框内，虚线框内为中间群体，很可能代表细胞碎片，也可观察到。本最终图示比较了人工细胞计数与流式细胞术计数的结果。如空心黑色方块所示，通过流式细胞术分析可检测到更高比例的阳性细胞，而实心黑色三角形所示的人工计数通常检测到的阳性细胞比例较低。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用贫瘠培养基在三维支架中培养边缘型 MPC，并掌握如何将细胞从支架中释放以进行流式细胞分析。