白色念珠菌生物膜芯片（CA BChip）为高通量的抗真菌药物筛选
July 18th, 2012
我们已经开发出一种高密度芯片平台的3D纳米生物膜的组成 C。白念珠菌称为钙 BChip。上测试药物的敏感性个人资料钙 BChip是传统的96孔板模式相媲美，表明真菌的芯片非常适合真正的高通量筛选抗真菌药物。
该程序的总体目标是开发基于微阵列的高通量生物膜筛选，用于抗真菌药物的发现。这是通过首先对显微镜载玻片的表面进行化学改性来实现的。接下来，将酵母细胞封装在胶原蛋白基质中。
然后使用机器人微阵列制备白色念珠菌生物膜芯片或 cab 芯片。最后，使用 cab 芯片估计药物敏感性。最终，使用微阵列扫描仪进行的活力测定显示了抗真菌药物对 cab chipp 上形成的纳米生物膜的敏感性特征。
与现有方法（如行业标准的 9 0 6 孔板）相比，这种基于微阵列的技术的主要优点是这是真正的高通量。快速、稳定 使用更小的工作体积并节省时间 制备功能化载玻片 首先将显微镜载玻片放在可拆卸的载玻片架中。通过将载玻片浸入含有 99% 组织学等级的染色罐中洗涤载玻片两次。乙醇。
然后戴上护目镜和耐化学手套，用纸巾擦拭载玻片并压缩氮气晾干。将玻片浸入硫酸中，第二天在室温下孵育过夜，对玻片进行超声处理 30 分钟，然后用 milq 水洗涤 30 分钟，然后用丙酮洗涤 5 分钟。这种处理将泰诺基团暴露在玻璃表面以覆盖载玻片。
将它们浸入三氨基丙基三乙基或 A-P-T-E-S 溶液中 30 分钟。然后在 Milli Q 水中清洗 3 次，每次 15 次，然后在 110 摄氏度的炉中烘烤载玻片 15 分钟。要交联 A-P-T-E-S 以涂覆单层疏水涂层，在通风橱下工作，移液管将两毫升聚苯乙烯彗发声和氢化物或 PSMA 和甲苯移液到安装在旋转编码器中的干净载玻片上，并以 3000 RPM 旋转 30 秒。
玻片可在干燥、无尘的环境中存放长达一个月。在 2 到 8 摄氏度。通过将单个菌落接种到 10 至 20 毫升 YPD 中，制备海洋白化酶菌株 SC 53 14 的过夜培养物。
将培养物在轨道振荡器中以大约 150 至 200 RPM 和 30 摄氏度孵育过夜。第二天。通过离心收获细胞，并洗涤两次，每次 10 分钟。
1 毫升 PBS 以 1900 RPM 的速度离心细胞 10 分钟，然后将它们重悬于 1 毫升重建缓冲液中。在明场显微镜下使用血细胞计数器，对细胞进行计数，并将细胞密度调整为每毫升 10 至第 7 个细胞的 5 倍。使用 10 X-R-P-M-I 1640 和补充有 L-谷氨酰胺的拖把将悬浮液进一步稀释 10 倍。
将细胞悬液与 1 型胶原蛋白混合，最终浓度为每毫升细胞的 4 倍 10 至 6 个细胞。打印前将悬浮液放在冰上，以防止胶原蛋白胶凝。使用 70% 乙醇，清洁和消毒微阵列的所有表面，包括源板站、清洗和真空站、真空载玻片和打印室，在剧烈打印之前，通过真空将所需数量的 PSMA 涂层载玻片放置在微稀有的载玻片甲板上。
涡旋胶原蛋白中的细胞悬液，并将 100 微升转移到 96 孔板的孔中。将此源板放在加载站中，以在整个打印过程中保持 100% 的相对湿度。使用带有锥形 190 微米孔口、陶瓷尖端和非接触式沉积的微阵列点样器打开加湿器。
打印 50 纳升细胞悬液点，相距 1.2 毫米，排列成 48 行和 16 列的阵列。灌注冲洗和吸尘。每轮打印后，打印后立即擦干尖端两次。
将玻片置于密封加湿室中，在 37 摄氏度下孵育 24 小时，以形成生物膜，以测试生物膜对抗抗真菌剂的作用。首先在我们的 PMI 1640 培养基修复中准备药物的工作溶液。将储备液稀释两倍，每种化合物的八种不同浓度。
稀释度跨越一个范围，化合物的估计 IC 50 位于中间。生物膜生长 24 小时后，使用微型 Rare 打印 50 纳升 8 种不同浓度的药物以及阳性和阴性对照，并在生物膜上至少重复 6 次。将芯片与药物在加湿室中于 24 摄氏度下孵育 37 小时。
接下来，将 cab 芯片浸入 PBS 中 3 到 5 次，每次 2 分钟，洗去药物。然后将芯片与 0.5 微摩尔基金 1 在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。在 PBS 中清洗 cab 芯片 3 到 5 次，然后在氮气流下干燥。
使用微射线扫描仪读取荧光强度。将阳性对照和死生物膜点的荧光强度分别设置为 100% 和 0%。使用以下方程确定相对于对照点平均值的荧光强度降低的抑制百分比，其中 FF max 和 F 为零。
原始荧光、药物处理强度、无药物控制和漂白处理斑点分别为。最后，通过拟合可变斜率山坡计算 50% 抑制浓度或 IC 50。此处显示的方程式是由 48 x 16 阵列的纳米生物膜组成的代表性白色念珠菌芯片。
明场显微镜显示了生物膜的整体结构特征，扫描电子显微镜图像显示，直径为 2 微米和 100 纳米的真菌菌丝嵌入胶原纤维的基质中。有趣的是，染色的微阵列扫描仪图像显示了真菌生物膜特征的酵母和 FL 形式。有趣的 2D 和 3D 共聚焦荧光图像。
可以看到一个染色的生物膜与散布着细胞外基质的代谢活性细胞区域具有空间异质性，这些细胞不会被代谢眼染色。生物膜的厚度估计约为 50 微米。cab 芯片用于估计氟康唑和两性霉素 B 的抗真菌敏感性，如此处所示，与已发表的行业标准 96 孔板测定报告一致，生物膜对氟康唑具有耐药性，两性霉素 B 的计算 IC 50 为 0.3 微克/毫升一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 48 小时内完成。
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概述
本研究介绍了一个高密度微阵列平台Ca BChip，利用C. albicans的3D纳米生物膜进行抗真菌药物筛选。从Ca BChip获得的药物敏感性分析与传统方法相当，表明其在高通量应用中的潜力。
关键研究组成部分
科学领域
- 微阵列技术
- 抗真菌药物发现
- 生物膜研究
背景
- 开发基于微阵列的药物筛选平台。
- 高通量方法在抗真菌研究中的重要性。
- 传统药物敏感性测试的挑战。
- 生物膜在研究真菌耐药性中的应用。
研究目的
- 创建一个用于高通量抗真菌药物筛选的微阵列平台。
- 评估Ca BChip与传统方法相比的有效性。
- 促进快速的药物敏感性测试。
所用方法
- 显微镜玻片的化学修饰。
- 将酵母细胞包裹在胶原蛋白基质中。
- 使用机器人微阵列技术准备Ca BChip。
- 通过微阵列扫描仪的活性分析估算药物敏感性。
主要结果
- Ca BChip展示了与传统方法相当的药物敏感性分析。
- 高密度微阵列允许高效筛选多种抗真菌药物。
- 机器人准备增强了重复性和通量。
- 活性分析确认了该平台的有效性。
结论
- Ca BChip是抗真菌药物发现的一种有前景的工具。
- 它为传统测试方法提供了高通量的替代方案。
- 未来的应用可能包括更广泛的抗真菌敏感性测试。
常见问题
Executive Industry Relevance
The CaBChip platform addresses the critical need for high-throughput antifungal screening by miniaturizing biofilm-based assays into a microarray format. This enables rapid evaluation of compound libraries against drug-resistant C. albicans biofilms, a major clinical challenge in nosocomial infections. By reducing reagent consumption and assay time while maintaining phenotypic relevance, the platform supports early-stage target validation and lead identification in antifungal discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of antifungal targets within physiologically relevant biofilm structures that exhibit intrinsic drug resistance.
- Operational Value: Supports mechanistic de-risking by preserving biofilm architecture and metabolic heterogeneity during compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative fluorescence-based readouts via FUN1 staining to measure metabolic inhibition in nano-biofilms.
- Operational Value: Delivers true high-throughput capacity with ~750 spatially distinct biofilm spots per chip, enabling parallel compound testing.
- Strategic Value: Reduces reagent use and hands-on time through nanoliter-scale printing and automated processing versus 96-well formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant biofilm phenotypes including morphological complexity and extracellular matrix production.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized robotic printing and incubation conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The CaBChip fits within the antifungal discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for compounds targeting biofilm-associated resistance mechanisms.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on biofilm formation, matrix production, and fungal persistence pathways.
- Screening: Enables primary and secondary screening campaigns with Z'-factor compatible outputs for hit confirmation.
- Analytics: Generates dose-response data suitable for IC50 determination via Hill equation fitting.
- Translational Research: Preserves clinically relevant resistance phenotypes observed in patient-derived isolates.
- Enterprise Reuse: Compatible with existing microarray scanners and liquid handling systems for multi-project deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in lead compounds through assessment against resistant biofilm states.
- Operational Value: Standardization, miniaturization, and reduced variability via robotic array printing.
- Strategic Value: Improved capital efficiency in antifungal programs by accelerating early go/no-go decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of scaffolds based on biofilm penetration and activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray printing, biofilm microbiology, and fluorescence viability assays.
- Depends on access to robotic spotters, humidified chambers, and microarray scanners.
- Necessitates cross-team standardization of biofilm growth and drug exposure protocols.
- Adaptation considerations include extracellular matrix compatibility and antifungal compound solubility in printing buffers.
- Practical limitations include biofilm thickness variability and potential edge effects in dense arrays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Preparation of Functionalized Slides
2:30
Preparation of Yeast Inocula and Collagen Encapsulation
3:40
Preparation of CaBChip
4:57
Susceptibility Testing of Preformed Biofilms in CaBChip against Antifungal Agents
6:38
Representative Biofilm Chip Results
7:48
Conclusion
