表达黄色荧光蛋白的小鼠脑组织透明化后的多光子显微成像

固定组织的多光子显微成像通常仅限于几百微米的浅层穿透深度。我们近期首次展示了利用苯甲醇与苯甲酸苄酯溶液进行光学透明化处理，将多光子显微成像深度推进至数毫米的固定小鼠器官内部。在最初的演示中，该技术用于成像组织的内源性荧光。

然而，人们日益关注将光学透明化方法应用于表达荧光蛋白（如GFP）的组织。本文介绍了一种利用苯甲醇溶液对透明化脑组织进行多光子显微成像的实验方案，该溶液可保留小鼠腿部表达的黄色荧光蛋白的荧光信号。通过在成像前对器官进行光学透明化处理，无需清除即可实现利用多光子显微镜对整只小鼠器官进行高分辨率成像。多光子。

由于水和构成脑组织的蛋白质之间的折射率差异所产生的散射效应，脑组织成像通常局限于组织表面下300微米以内。为了克服这一限制，需将器官脱水，并用水折射率与组织蛋白相近的液体替代组织中的水分。这种光学透明化处理可显著减少光散射，从而实现对组织表面更深层区域的更佳成像。

Batta 等人的图像展示了如何利用内源性荧光和二次谐波生成技术观察小鼠不同器官的组织学结构。第一幅图像为小鼠睾丸组织，成像深度位于组织表面下 1.4 毫米处。多光子显微镜的高分辨率特性使我们能够放大观察生精小管中正在形成的单个精子细胞。

如最右侧所示，我们展示了一张小鼠肺部的图像，该图像同样是在组织表面下方 1.4 毫米处获取的。此图像展示了双通道多光子成像结果，其中弹性蛋白成分以红色标记，胶原蛋白以绿色标记，放大后可清晰分辨单个肺泡结构。最后，我们展示了小鼠脑内区域的高分辨率图像，成像深度为组织表面下 850 微米。通过放大脑部的新皮层和海马体区域，可清楚观察到单个星形胶质细胞和神经元细胞体。

然而，当对含有荧光蛋白（如YFP）的器官进行光学透明化处理时，badra所采用的光学透明化方案完全无法保存这些荧光蛋白的荧光信号。本文所介绍的方法是一种新型的全器官光学透明化与小鼠脑组织成像技术，可在保留YFP荧光信号的同时实现透明化。该方法通过梯度乙醇系列对脑组织进行脱水，并使用1:2的苯甲醇-苯甲酸苄酯（benzo alcohol benzoate，简称BAB）溶液进行透明化处理，已被证实可减少对荧光蛋白的损伤，从而有效维持其荧光信号。进行多光子成像前，首先称量表达YFP的小鼠体重，随后通过腹腔注射酮胺和赛拉嗪对其进行麻醉。

在开始手术前，必须确认动物已达到外科麻醉水平。应每隔五分钟检查一次动物，观察其对用力夹捏脚趾或尾巴是否有反应。如果动物有反应，则需要追加一次氯胺酮和赛拉嗪的补充剂量。

麻醉后，将小鼠四肢用实验室胶带固定于手术台上，使其呈仰卧位，暴露胸部以进行手术。首先，在剑突下方做一切口，然后使用剪刀沿肋骨基部切割，同时用镊子牵拉皮肤。接着，在小鼠胸骨两侧各做一切口，形成一个组织瓣，并用止血钳将其固定于胸腔外，以暴露心脏。随后，将一根23号针头插入心脏左心室，并在右心房的肌壁上做一小切口，以使血液流出。右心房切开后，立即开始用4°C的磷酸盐缓冲盐水进行灌注，直至右心房不再有血液流出为止。

灌流过程中使用蠕动泵，并调节泵速，使液体从针尖喷出距离为1.5至2英寸。待血液完全排出后，将灌流液更换为4%多聚甲醛溶液（4°C），直至小鼠身体明显变得僵硬。灌流结束后，将小鼠从手术台取下并断头，随后使用镊子和虹膜剪开始分离脑组织。

从颅骨后部开始向前，将颅骨分小块逐步移除。使用剪刀在颅骨上每隔2至4毫米进行小切口，同时用镊子小心地将骨片一小块一小块地从脑组织上剥离，直至完全暴露脑的整个上表面。随后用外科刮匙将脑组织从颅骨中取出，并置于含有4%多聚甲醛的玻璃小瓶中，固定6小时。

尽管本次演示主要关注表达YFP的小鼠脑组织成像，我们还将对小鼠的后肢进行光学透明化处理，并对小肠进行切片，以充分展示该方法的透明化能力。固定后，脑组织及其他组织样本用PBS洗涤两次。随后，组织样本在室温下通过一系列浓度分别为50%、70%、90%和100%的乙醇孵育进行脱水处理。

每次孵育持续两小时，随后进行第二次孵育。为有效去除固定组织中的水分，需使用100%乙醇孵育12小时。脱水后，倒出最后一次的100%乙醇溶液，将组织样本浸入等体积乙醇与BAB的混合溶液中孵育两小时，然后再转移至100% BAB透明溶液中浸泡。

进入 BAB 后，脑组织及其他组织样本将在四到五小时内明显变得透明。此处展示的是光学透明化过程最初六小时的延时视频。跳转标记处表示将乙醇与 BAB 的 1:1 溶液更换为 100% BAB 溶液的时间点。

六小时后，所有器官均显示出透明化迹象，例如，小鼠后肢的骨骼现已清晰可见，表明透明化效果最佳。大脑应在避光条件下于室温继续透明化六天。一旦大脑完成透明化并准备成像，可使用Sano丙烯酸树脂或超级胶水将其固定在培养皿底部。

胶水干燥后，将脑组织浸入BAB中，并将培养皿置于物镜下进行成像。成像时，我们使用配备MI tie钛宝石激光器的多光子显微镜，其激发波长可调节范围为710至990纳米。用于生成YFP信号的激发波长为886纳米。

然后使用尼康（NIK icon）5倍物镜捕获反射荧光信号，该物镜可实现大视野成像。反射荧光信号通过535/50带通滤光片进行过滤，并利用高量子效率的光电倍增管进行采集。来自OMA Matsu的图像使用ScanImage软件处理，扫描分辨率为2048×2048像素，扫描速率为每行2毫秒，以生成高分辨率的YFP图像。

成像完成后，将脑组织从P型培养皿中取出，置于BAB溶液中避光保存，以备后续成像使用。此处展示的代表性图像和视频展示了光学透明化技术实现的高分辨率多光子成像能力。全脑成像可使海马体和新皮层不同层次中YFP标记的神经元清晰可见，成像深度可达组织表面下2毫米。

在此展示一段完整的口腔拉伤样本的1.2毫米图像堆栈视频，成像深度为脑组织表面下0.8至2毫米，以揭示海马体的不同解剖层次。以下是取自2毫米深度图像堆栈的冠状切面代表性图像，位置为Bregma 1.94毫米处，图中已标注海马体的不同层次。通过放大新皮层区域，可清晰分辨新皮层第五层锥体神经元的单个轴突及神经元胞体，直至组织表面下1.02毫米深度。

此处展示的是一组位于组织表面下700至1020微米深度的第五层神经元的图像层析图。以下是该图像层析图中深度为774微米处的代表性图像。利用同一组图像层析图，通过Image J软件对神经元区域进行了三维重建。

多光子显微镜的高分辨率能力还使我们能够呈现完整单个神经元的图像。在此，我们展示了一种新皮层第五层神经元的重建图像，其中D基因的突起结构清晰可见。至此，我们完成了关于光学透明化处理、表达YFP的完整小鼠脑组织的展示。

执行该技术相对简单，正如我们所展示的，可用于观察和成像小鼠扭伤的许多不同区域和结构。感谢您的观看，祝您实验顺利。