多光子显微镜的清除小鼠脑组织表达YFP

整个小鼠脏器的多光子显微镜能够通过光学成像之前清零器官，但并非所有协议保留的荧光蛋白的荧光信号。使用光学乙醇脱水和苯甲醇苯甲酸苄酯结算的结算方法，显示高分辨率的多光子图像的整个小鼠脑组织表达YFP。

固定组织的多光子显微镜通常仅限于几百微米的浅层穿透深度。我们最近首次展示了使用苯并醇和苯甲酸苯甲酰酯溶液的光学透明化，将深至几毫米的多光子显微镜应用于固定的小鼠器官。我们的初步演示是该技术对内在组织荧光进行成像。

然而，人们对使用光学透明化方法处理表达荧光蛋白（如 GFP）的组织越来越感兴趣。在这里，我们提出了一种用相同的苯并醇溶液对透明化的脑组织进行多光子显微镜检查的方案，该溶液保留了大腿表达的黄色荧光蛋白的荧光。小鼠大脑中的一个启动子 使用多光子显微镜进行高分辨率全小鼠器官成像，方法是在成像前对器官进行光学透明化而不进行透明化。多光子。

由于水和构成脑组织的蛋白质的折射率差异会产生高光散射效应，因此大脑的成像仅限于组织表面以下 300 微米。为了克服这一限制，器官脱水，水被一种液体取代，这种液体的折射率与构成组织的蛋白质相似。这种光学透明化过程有助于大大减少光散射，从而在组织表面下更远的地方提供更好的成像。

Batta 等人的图像展示了如何应用该技术使用内禀荧光和二次谐波产生来观察不同小鼠器官的组织学。第一张图像是小鼠睾丸，在组织表面以下 1.4 毫米处拍摄。多光子显微镜的高分辨率特性使我们能够放大并清楚地观察在生精管中形成的单个精子细胞。

如最右侧所示，我们显示了小鼠肺的图像，该图像也是在组织表面以下 1.4 毫米处拍摄的。该图像是双通道多光子成像的演示，其中弹性蛋白成分标记为红色，而胶原蛋白标记为绿色，放大单个 oli 很容易区分。最后，我们展示了小鼠大脑内部区域的高分辨率图像，在组织表面以下取 850 微米通过放大大脑的新皮层和海马体，可以清楚地看到单个星形胶质细胞和神经元细胞体。

然而，当光学透明化可含有荧光蛋白（如 YFP）的器官时，badra 的光学透明化方案根本不会保留这些荧光蛋白的荧光信号。这里介绍的方案是一种新颖的方法，可以进行小鼠扭伤的全器官光学透明化和成像，同时保留 YFP 和神经元的荧光信号，使用乙醇分级系列使大脑脱水，并用苯并醇苯甲酸盐的一至两种溶液清除，也称为 BAB，已被发现可以减少对荧光蛋白的损伤并保留其荧光信号。对于多光子成像，首先称重YFP小鼠，然后用腹膜内注射氯胺酮甲苯噻嗪麻醉。

进行手术之前，必须确认手术麻醉板。应每五分钟检查一次动物，看看它是否对用力的脚趾或尾巴挤压有反应。如果动物出现反应，则需要补充 S 剂量的氯胺酮甲苯噻嗪。

麻醉后，通过使用实验室胶带将每个肢体粘在手术床上，使小鼠处于仰卧姿势，露出胸部进行手术 首先，在剑突下方做一个切口，以便在切割时用剪刀和镊子沿着胸腔底部切开皮肤， 然后在小鼠胸骨的两侧进行两次切割，以形成一个组织瓣，该组织瓣使用止血钳远离胸腔，使心脏暴露在外。接下来，将一根 23 号针头插入心脏的左心室，并在右心房的肌肉壁上做一个小切口，让血液逸出。切开右心房后，立即开始灌注 4 摄氏度的磷酸盐缓冲盐水，直到没有更多的血液从右心房流出。

在灌注过程中，使用会阴泵并将其设置为泵送功率，将液体喷射到距离针尖 1.5 到 2 英寸的地方。一旦所有血液都排空，将灌注介质在 4 摄氏度下切换到 4% 多聚甲醛溶液，直到小鼠的身体变得明显僵硬和僵硬。灌注后，将小鼠从手术床中取出并斩首，开始使用镊子和虹膜剪刀切除大脑。

颅骨后部开始，将颅骨分成小段切除，然后向前移动。用剪刀在颅骨上每 2 到 4 毫米做一次小切口，同时用镊子小心地将骨头分成小段从大脑中拉出，直到大脑的整个顶面暴露出来。然后使用手术刮刀从颅骨中切除大脑，并取出 4% 多聚甲醛的玻璃瓶固定 6 小时。

虽然我们主要关注表达 YFP 的小鼠大脑的成像以进行此演示，但我们也将光学清除小鼠、后腿和小肠切片，以最好地展示该程序的清除能力。固定后，将脑和其他组织在 PBS 中洗涤两次。然后，通过一系列浓度为 50%、70%、90% 和 100% 乙醇的乙醇孵育，在室温下对组织样品进行脱水。

每次孵育持续 2 小时，然后持续 1 秒。进行 12 小时的 100% 乙醇孵育，以有效地从固定组织中提取水分。脱水后，倒出最后的 100% 乙醇溶液，将组织样品浸入乙醇与 BAB 的一对一溶液中 2 小时，然后浸入 100%BAB 透明溶液中。

一旦进入 bab，大脑和其他组织样本将在 4 到 5 小时内变得明显透明。在这里，我们展示了光学清除过程前 6 小时的延时视频。跳跃标记乙醇与 BAB 的一对一溶液被 100%BAB 溶液取代的时间。

在六个小时结束时，所有器官都显示出透明的迹象，例如，老鼠后腿的骨头现在清晰可见，以获得最佳清除效果。大脑应在室温下清除六天，同时避开强光。一旦大脑被清理干净并准备好进行成像，它就会用 Sano 丙烯酸或强力胶将其固定在培养皿的底部。

胶水干燥后，大脑出现在 BAB 中，并将培养皿置于物镜下方进行成像。对于成像，我们使用多光子显微镜，该显微镜包含一个 MI tie 钛蓝宝石激光器，可在 710 至 990 纳米激发波长之间调节。我们用于生成 YFP 信号的激发波长为 886 纳米。

然后使用 NIK icon 5 倍物镜捕获反射荧光信号，该物镜可实现大视场成像。使用 5 35 50 带通滤光片过滤反射荧光信号，并使用高量子效率文件夹收集。OMA Matsu 图像的倍增 2 使用扫描图像软件以 2048 x 2048 像素的分辨率进行处理，扫描速率为每行 2 毫秒，以生成高分辨率的 YFP 图像。

成像完成后，将大脑从 P 2 培养皿中取出并储存在 BAB 中并遮光以备将来成像。此处显示的代表性图像和视频展示了光学清除实现的高分辨率多光子成像能力。全脑成像允许海马体和新皮层不同层中的 YFP 标记神经元在组织表面以下 2 毫米深处清晰可见。

在这里，我们展示了一段 1.2 毫米的全口扭伤图像堆栈视频，该视频被拍摄到大脑中 0.8 到 2 毫米，以揭示海马体的不同解剖层。以下是伯格曼 （Bergman） 称呼的 1.94 毫米冠状切片的代表性图像，该图像取自海马体不同层的 2 毫米深图像。通过放大新皮层，新皮层第 5 层孔神经元的单个轴突和神经元细胞体在组织表面以下 1.02 毫米处可以清晰区分。

在这里，我们展示了在组织表面下 700 到 1020 微米之间拍摄的第 5 层神经元卡住的图像。以下是从该堆栈中采集到大脑 774 微米的代表性图像。使用相同的图像堆栈，使用 Image J 软件对神经元区域进行了 3D 重建。

多机器人显微镜的高分辨率功能还使我们能够呈现整个单个神经元的图像。在这里，我们展示了新皮层第五层神经元的重建，其中 D 遗传过程清晰可见。我们对表达 YFP 的光学透明化、全小鼠扭伤的介绍到此结束。

执行这种技术相对简单，正如我们所展示的，可用于查看和成像小鼠扭伤的许多不同区域和结构。感谢您的观看，祝您好运。