使用人工痰液培养基在更贴近囊性纤维化肺部环境的条件下测试抗生素对Pseudomonas aeruginosa的疗效

本实验的目的是在模拟囊性纤维化患者肺部慢性感染的条件下，使用一种确定的人工痰液培养基，评估抗生素对铜绿假单胞菌生物膜的抑制效果。细菌生物膜在24孔微孔板中培养。

随后将生物膜暴露于抗生素中。接着，使用纤维素酶破坏经抗生素处理的培养物，并加入代谢染料srin进行孵育，该染料可被活细胞从蓝色还原为粉红色。通过测定各孔的吸光度，可确定生物膜中最低抑菌浓度（B-S-M-I-C），从而在接近生理条件下定量评估抗生素的敏感性。

与现有方法（如基于浮游培养测定最低抑菌浓度）相比，该技术的主要优势在于，细菌在含有痰液所有组分的特殊培养基中生长，从而促进生物膜的形成。这些生物膜对抗生素的耐受性显著增强。配制该培养基时，首先准备两个瓶子，在第一个瓶子中加入250毫升无菌水。

逐渐加入搅拌，然后将四克鱼精DNA加入250毫升无菌水中。室温下搅拌溶液，使DNA溶解至第二个瓶子中。随后，逐渐加入五克来自猪胃的2型黏蛋白，并进行搅拌。

待DNA和黏蛋白溶液准备好后，将氨基酸溶解于100毫升无菌水中，但L-酪氨酸和L-半胱氨酸除外，前者应溶解于25毫升水中，后者应溶解于25毫升0.5摩尔/升氢氧化钾溶液中。接下来，将5.9毫克DTPA、5克氯化钠和2.2克氯化钾溶于100毫升水中。将所有不同的溶液混合至一个1升容量的瓶中，然后加入5毫升蛋黄乳剂，并加水定容至850毫升。

使用 1 摩尔的 Tris 将 pH 值调节至 6.9，并加水定容至 1 升，以制备培养基。将培养基用真空泵进行过滤除菌，所用设备为 ME2 隔膜真空泵和 Millipore Steritop 滤器，滤器规格为 45 毫米接口、0.2 微米孔径。过滤过程可在两天内完成。ASM 培养基可在 4°C 下保存最多一个月。

首先，将过夜培养的铜绿假单胞菌（pseudomona arosa）培养物在LB培养基中稀释，使OD值达到0.05。然后将细菌以1:100的比例进一步稀释，在24孔细胞培养板的21个孔中，每孔加入1.8毫升稀释后的细菌培养物；在剩余的3个孔中加入等体积的SM培养基，作为阴性空白对照。用封口膜密封24孔板，并将其置于微需氧条件下培养以促进生物膜形成，该条件可通过在大型厌氧罐中使用Campi Gen气体发生包获得。

将培养物置于摇床中，在 37 摄氏度、75 RPM 条件下孵育三天。三天后，生物膜将呈现为含有细菌细胞的凝胶状团块，且无法通过移液操作打散。生物膜形成后，向每孔加入 200 微升经连续稀释浓度的抗生素。每种药物浓度至少设置四个重复孔，并保留四个含有生物膜但不加药物处理的孔，作为阴性对照。

随后，将之前已孵育的平板继续孵育24小时，孵育时需添加抗生素。使用纤维素酶，用柠檬酸盐缓冲液将其稀释至100毫克/毫升，每孔加入100微升，以破坏生物膜；将平板置于摇床中，在37摄氏度、有氧条件下以150转/分钟（RPM）振荡孵育1小时。此次孵育后，若在培养基中可见细胞团块，可采用手动移液方式进一步分散生物膜。

接下来，每孔加入 100 µL 的 rezin，用于定量分析从生物膜中释放的细胞的活力，并将细胞在 37 °C 下孵育一至两小时。在此温度下，只有活细胞能够将蓝色的 zarin 染料代谢为其粉红色荧光形式。孵育结束后，将样品转移至 96 孔板中，并使用 540 nm 激发波长和 590 nm 发射波长测定各孔的荧光强度。

为了定量测定细菌活力和药物敏感性，首先从其他孔中减去空白对照的背景荧光值。接着，将每个浓度下的平均荧光值除以未处理对照组的平均荧光值，再乘以100，计算抑制率。B-S-M-Y-C 定义为引起代谢活性抑制达90%的抗生素浓度，如这些电子显微照片所示，以生物膜形式生长的细胞与浮游培养的细菌存在显著差异。

特别是，在绿色生物膜中的细胞周围存在大量呈黄色的细胞外基质，而在浮游菌落中则无此现象。此外，在本实验中，生物膜中的细菌通常对抗生素具有更强的耐药性。铜绿假单胞菌浮游培养物（蓝色）对妥布霉素的最低抑菌浓度被确定为约每毫升4微克。

相比之下，如红色所示，生物膜中的细菌在高达每毫升512微克的抗生素浓度下仍能100%存活。观看本视频后，您应能充分掌握如何在特定的人工痰液培养基中培养细菌。您还应能够开展抗生素敏感性试验，以确定在更接近囊性纤维化患者肺部环境的条件下抑制细菌生长所需的最低抑菌浓度。