Name: 使用人工痰介质测试抗生素药效试验绿脓杆菌更多相关的肺囊肿性纤维化的条件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 了解使用人工痰液培养基评估铜绿假单胞菌生物膜抗生素敏感性的方法。该技术模拟囊性纤维化肺部环境，通过代谢染料测定生物膜最小抑菌浓度，为研究慢性感染治疗策略提供可靠实验模型。

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我们感谢英国国家卫生研究所研究、人道研究哈德温博士信托基金、英国领先的 exclusively 资助非动物研究技术以替代动物实验的医学研究慈善机构，以及惠康信托基金（资助号 089215）的支持。我们还感谢诺华制药英国有限公司（无限制教育资助）。

1. 人工痰液培养基（ASM）的制备
<ol>
 <li>在数小时内，将 4 g 鱼精 DNA 缓慢加入 250 ml 无菌水中。DNA 完全溶解需要数小时，可在室温下搅拌过夜。</li>
 <li>将 5 g 猪胃黏蛋白（II 型）缓慢加入 250 ml 无菌水中，直至完全溶解。该溶液可在 4 °C 下搅拌过夜。</li>
 <li>除 L-酪氨酸和 L-半胱氨酸外，将每种必需和非必需 L-氨基酸各 0.25 g 溶于 100 ml 无菌水中。将 0.25 g L-半胱氨酸溶于 25 ml 0.5 M 氢氧化钾（Mr 56.11 g/mol）中，将 0.25 g L-酪氨酸溶于 25 ml 无菌水中。</li>
 <li>将 5.9 mg 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、5 g NaCl 和 2.2 g KCl 溶于 100 ml 无菌水中。</li>
 <li>将 DNA、黏蛋白、L-氨基酸、DTPA、NaCl 和 KCl 混合至一个 1 升的容器中。</li>
 <li>加入 5 ml 蛋黄乳剂，并用无菌水定容至约 850 ml。</li>
 <li>用 1 M Tris（pH 8.5；Mr 121.14）调节 pH 至 6.9，并用无菌水定容至 1 升。</li>
 <li>通过过滤对 ASM 进行灭菌，使用 Vacuubrand ME 2 隔膜真空泵和 Millipore Steritop 滤器装置，其孔径和接口尺寸分别为 0.22 μm 和 45 mm。每个 Steritop 滤器装置可立即重复使用最多三次；但重复使用前需用无菌水冲洗两次。过滤过程较慢，可持续进行两天。已有其他版本的 ASM 采用添加抗生素代替过滤的方法11，但由于可能存在药物相互作用，我们不推荐将该方法用于此特定应用。</li>
 <li>未过滤和已过滤的 ASM 均应避光保存于 4 °C。建议使用新鲜配制的 ASM，但在上述条件下最长可保存一个月。</li>
</ol>
2. 浮游固着细胞最低代谢抑制浓度（PSMIC）的测定
<ol>
 <li>为测定15株浮游培养的P. aeruginosa分离株的最低代谢抑制浓度（PSMIC）值，应按照英国抗菌化疗学会（BSAC）指南12所述方法进行微量稀释法。将本实验中选用的抗生素（硫酸妥布霉素）在96孔微孔板中用Luria-Bertani（LB）培养基进行系列稀释，以获得适当的抗生素浓度范围。</li>
 <li>将过夜培养的P. aeruginosa菌液用LB培养基稀释至OD600为0.05（±0.01），然后取100 μl加入含有100 μl系列稀释抗生素的96孔板各孔中。本实验中，硫酸妥布霉素的最终浓度范围为512 - 0.5 μg/ml。每种抗生素浓度应设置八个重复孔。</li>
 <li>应为每株菌设置不含抗生素的阴性对照孔。此外，应设置八个仅含LB培养基的孔，作为后续分析（第2.6节）中的空白对照。</li>
 <li>将96孔微孔板在37 °C下孵育1 - 2天，孵育过程中不振荡，置于有氧或微需氧（5 % O2、10 % CO2和85 % N2）条件下进行。微需氧条件可通过在大型厌氧罐中使用CampyGen气体发生袋获得。</li>
 <li>孵育结束后，使用Fluostar Omega酶标仪及MARS数据分析软件，在600 nm波长下测定各孔细菌培养物的吸光度，以确定细菌生长情况。</li>
 <li>抗生素处理的浮游菌液吸光度（Aantibiotic treated planktonic cells）和阴性对照吸光度（Anegative control）需减去仅含LB的空白孔背景吸光度（Ablank）进行校正。随后计算存活抑制率，公式为（Aantibiotic treated planktonic cells均值 / Anegative control均值）× 100 %。PSMIC90定义为引起浮游细菌生长抑制率达90 %的抗生素浓度。</li>
 <li>为测定抗生素处理后细菌的存活情况，向每孔加入10 μl 0.02 %（v/v）的刃天青（用蒸馏水稀释），然后在37 °C、150 rpm振荡条件下，于有氧环境中孵育1 - 2小时。活菌可将蓝色的刃天青还原为粉红色荧光的试卤灵。</li>
 <li>刃天青孵育结束后，使用Fluostar Omega酶标仪在激发波长540 nm、发射波长590 nm条件下检测各孔的荧光强度。数据应按以下所述方法进行分析。</li>
</ol>
3. 生物膜固着细胞最低抑菌浓度（BSMIC）的测定
<ol>
 <li>过夜培养的 P. aeruginosa （本案例中为15株分离株） P. aeruginosa 应使用LB培养基将（所用菌液）稀释至OD600 0.05（±0.01），然后在新鲜ASM中进一步按1:100稀释（总体积1.8 ml）。</li>
 <li>将稀释后的培养物（1.8 ml）加入24孔组织培养处理板的每孔中。应设置三个仅含ASM的孔，用于后续分析中的空白对照（第3.9节）。</li>
 <li>用实验室封口膜密封24孔板，在有氧或微需氧条件下于37°C培养3天 37 °C，同时以 75 rpm 振荡。应使用 CampyGen 气体发生包在大型厌氧罐中创造微需氧条件。</li>
 <li>将所选抗生素（本例中为硫酸妥布霉素）稀释，以在新鲜ASM中提供适当的浓度范围。本实验中，最终浓度范围为512 - 1 μg/ml. 按每种抗生素浓度，分别加入相应体积的溶液 200 μl，加入24孔板的相应孔中。每种抗生素浓度应设置四个重复。未暴露于所选抗生素的生物膜作为阴性对照。</li>
 <li>用实验室封口膜密封24孔板，并在有氧或微需氧条件下于37°C继续孵育24小时 37 °C，同时以 75 rpm 振荡。</li>
 <li>在选择的抗生素存在下孵育后，使用以下方法破坏细菌生物膜 100 μl 100 mg/ml 纤维素酶（溶于 0.05 M 柠檬酸盐缓冲液 [9.6 g/l Citrate.H20 的水中，并用 NaOH 调节 pH 至 4.6]，然后将 24 孔板在有氧条件下于 37 °C，同时以150 rpm振荡1小时。如有需要，可在此阶段通过手动移液进一步破坏生物膜。</li>
 <li>为了测定从破裂的生物膜中释放出的细菌细胞的代谢活性， 100 μl 每孔加入 0.02 % (v/v) 刃天青（用蒸馏水稀释）100 μL，置于 24 孔板中，于 37 °C、5 % CO₂ 条件下孵育 1 - 2 h 37 °C，同时以150 rpm振荡。</li>
 <li>在与刃天青孵育后，使用Fluostar Omega酶标仪及MARS数据分析软件，以540 nm激发波长和590 nm发射波长测定每孔的荧光强度。</li>
 <li>抗生素处理的生物膜发出的荧光（F经抗生素处理的生物膜）以及阴性对照的荧光（F阴性对照) 应通过减去仅含ASM孔的背景荧光值（F空). 随后按（F的平均值经抗生素处理的生物膜/平均值 F阴性对照) × 100%。BSMIC90 定义为引起代谢活性90%抑制的抗生素浓度。</li>
</ol>
4. 代表性结果
在小体积（2 ml）条件下即可实现ASM生物膜的形成，且生物膜在3天内完全成熟（图1A）。通过剧烈吹打生物膜可验证其稳定性，此时生物膜应难以被破坏。所形成的微菌落与在较大体积中培养的微菌落相似4（图1B）。图2展示了浮游培养细胞与生物膜中生长细胞之间的主要差异，该差异通过电子显微镜图像分析检测获得。生物膜培养物明显显示出大量包裹细胞的胞外基质，且生物膜内的个体结构难以分辨。
多项研究表明，生物膜生活方式可能影响微生物对抗菌药物的敏感性13, 14。我们的小规模人工唾液培养基（ASM）检测可用于同时测定多种抗生素对多个分离株的生物膜抑制浓度（BSMIC）。该检测的工作流程见图3。可利用刃天青（resazurin）检测法测定抗生素对细菌细胞活性的影响。在此情况下，可将抗生素（如妥布霉素）加入已形成的生物膜中，并孵育24小时。随后破坏生物膜并加入刃天青。
代谢活跃的细胞可还原刃天青染料，导致颜色由蓝色（resazurin）变为粉红色（resorufin） 15. 图 4A 展示了一个示例检测方法，其中 P. aeruginosa 在微量滴定板中，经不同浓度的妥布霉素处理后，进行生物膜破坏并加入刃天青。蓝色非荧光颜色表明细胞无活性，而有活性的细胞则将染料还原为粉红色荧光形式的试卤灵。随后可通过将荧光值转换为细菌存活力的百分比来计算最小抑制浓度（SMIC）。 图4B 显示了随着妥布霉素浓度增加，存活率（%）的变化情况。为计算最小抑菌浓度（SMIC），将10%的存活率设定为阈值。90.
在有氧条件下，以生物膜形式生长的细胞其妥布霉素SMIC90值高于浮游培养的细胞。表1显示了所有测试菌株的PSMIC90和BSMIC90值的变化情况。表2显示，在有氧条件下，与LB培养基中（浮游模式）相比，大多数菌株在ASM培养基中（生物膜模式）生长时对妥布霉素的耐药性显著增加（SMIC值升高2至>32倍）。此外，与有氧条件下生长的生物膜相比，微需氧条件下生长的生物膜对妥布霉素的SMIC值进一步增加，升高幅度为2至>128倍。
<img alt="培养皿和液体培养基中的植物组织培养；生长实验装置，生物科学研究。" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 铜绿假单胞菌在 ASM 中的生物膜形成 P. aeruginosa 菌株 PAO1 在 ASM 中培养时会形成肉眼可见的团块（微菌落）。A，在螺旋盖玻璃杜兰瓶中培养 7 天后，30 ml ASM 培养体系（大规模）中的生物膜形成情况。B，在 24 孔聚苯乙烯板中培养 3 天后，2 ml ASM 培养体系（小规模）中的生物膜形成情况。
<img alt="显微照片中的细胞结构比较；细胞形态变异的显微成像。" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. ASM 生物膜的透射电子显微镜（TEM）显微照片 A/C 分别为浮游生长和在 ASM 中生长的 PAO1 的 TEM 显微照片（×27,000），B/D 分别为浮游生长和在 ASM 中生长的 PAO1 的 TEM 显微照片（×57,000）。浮游细菌在 LB 肉汤中培养过夜。生物膜在 30 ml ASM 培养物中培养 7 天。黑色箭头指示生物膜内的细胞，星号指示细胞外空间。比例尺 = 1 μm。
<img alt="生物膜破坏过程示意图；抗生素处理、代谢染色、荧光分析。" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. ASM生物膜抗菌药物敏感性检测的工作流程。
<img alt="96-well plate assay for bacterial viability with tobramycin; results charted in bar graph format." src="/files/ftp_upload/3857/3857fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 利用刃天青测定抗生素敏感性 将细菌细胞与不同浓度的抗生素共同孵育，然后使用刃天青（resazurin）测定残留的代谢活性。 A蓝色非荧光性的刃天青氧化形式指示非活细胞，可被代谢活跃的细胞还原为粉红色荧光的试卤灵。 B荧光强度被转换为细菌存活力的百分比。以10%的存活力作为阈值，用于计算MSMIC90。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3857/3857fig4large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td rowspan="2">菌株</td>
 <td colspan="2">PSMIC 90 (μg/ml) 1</td>
 <td colspan="2">BSMIC 90 (μg/ml) 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>需氧条件</td>
 <td>微需氧条件2</td>
 <td>需氧条件</td>
 <td>微需氧条件 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAO1</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 <td>8</td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="5">利物浦流行株 (LES) 分离株</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LESB5821</td>
 <td>8</td>
 <td>64</td>
 <td>64</td>
 <td>128</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LES40022</td>
 <td>32</td>
 <td>128</td>
 <td>8</td>
 <td>256</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LESB25</td>
 <td>16</td>
 <td>32</td>
 <td>256</td>
 <td>512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LESB55</td>
 <td>16</td>
 <td>64</td>
 <td>64</td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LESB64</td>
 <td>16</td>
 <td>64</td>
 <td>&gt;512</td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LES43122</td>
 <td>4</td>
 <td>8</td>
 <td>32</td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LESB49</td>
 <td>16</td>
 <td>64</td>
 <td>64</td>
 <td>256</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LES109</td>
 <td>32</td>
 <td>128</td>
 <td>32 </td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="5">非 LES 分离株</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>49461</td>
 <td>16</td>
 <td>32</td>
 <td>16</td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>59032</td>
 <td>0.5</td>
 <td>2</td>
 <td>4</td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>59073</td>
 <td>&gt;512</td>
 <td>&gt;512</td>
 <td>&gt;512</td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>59076</td>
 <td>16</td>
 <td>32</td>
 <td>32</td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27</td>
 <td>8</td>
 <td>16</td>
 <td>4</td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>45</td>
 <td>16</td>
 <td>32</td>
 <td>4</td>
 <td>&gt;512</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1．铜绿假单胞菌对妥布霉素的敏感性。
1为测定PSMIC和BSMIC，采用2倍系列稀释的妥布霉素 
512 - 0.5 μg/ml （每个浓度 n = 8）和 512 - 1 μg/ml （每组 n = 4） 
浓度），分别；PSMICs 采用标准方法测定 
微量稀释法1.
2微需氧条件为5 % O2、10 % CO2和85 % N2。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td rowspan="2">菌株</td>
 <td colspan="4">PSMIC90/BSMIC90倍数变化1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PSMIC有氧 → 
 PSMIC微需氧</td>
 <td>BSMIC有氧 → 
 BSMIC微需氧</td>
 <td>PSMIC有氧 → 
 BSMIC有氧</td>
 <td>PSMIC微需氧 → 
 BSMIC微需氧</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAO1</td>
 <td>0</td>
 <td>&gt;64</td>
 <td>2</td>
 <td>128</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="5">LES分离株</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LESB58</td>
 <td>8</td>
 <td>2</td>
 <td>8</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LES400</td>
 <td>4</td>
 <td>32</td>
 <td>0.25</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LESB25</td>
 <td>2</td>
 <td>2</td>
 <td>16</td>
 <td>16</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LESB55</td>
 <td>4</td>
 <td>&gt;8</td>
 <td>4</td>
 <td>&gt;8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LESB64</td>
 <td>4</td>
 <td>ND</td>
 <td>&gt;32</td>
 <td>&gt;8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LES431</td>
 <td>2</td>
 <td>&gt;16</td>
 <td>8</td>
 <td>&gt;64</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LESB49</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LES109</td>
 <td>4</td>
 <td>16</td>
 <td>0</td>
 <td>&gt;4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="5">非LES分离株</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>49461</td>
 <td>2</td>
 <td>&gt;32</td>
 <td>0</td>
 <td>&gt;16</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>59032</td>
 <td>4</td>
 <td>&gt;128</td>
 <td>8</td>
 <td>&gt;256</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>59073</td>
 <td>ND</td>
 <td>ND</td>
 <td>ND</td>
 <td>ND</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>59076</td>
 <td>2</td>
 <td>&gt;16</td>
 <td>2</td>
 <td>&gt;16</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27</td>
 <td>2</td>
 <td>&gt;128</td>
 <td>0.5</td>
 <td>&gt;32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>45</td>
 <td>2</td>
 <td>&gt;128</td>
 <td>0.25</td>
 <td>&gt;16</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. PSMICs 和 BSMICs 对妥布霉素的倍数变化。
1ND，未测定；加粗数值表示SMIC倍数变化 &gt;10。

<ol><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+%28version+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li>
<li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li>
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<li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

在本研究中，我们采用了一种新型 体外 基于ASM的模型以复制 P. aeruginosa 囊性纤维化肺部中的生物膜环境4该模型已成功改进，可用于小规模、高通量的抗菌剂测试。
	该检测的关键步骤如下：
	<ol>
	<li>人工唾液培养基（ASM）的配制需保持一致性，并维持无菌状态。我们投入了大量时间优化各组分的添加方式，以确保每次实验结果的可重复性。ASM 的过滤灭菌过程较慢，但优于高压灭菌，因为后者可能破坏黏蛋白组分。我们不建议添加抗生素（如其他研究者所建议的11），因为这可能施加显著的选择压力，促使突变发生，诱导前噬菌体裂解16，并显著改变多种细菌基因的表达。</li>
	<li>应根据所用 ASM 的体积对实验条件进行优化。体积较小时需提高振荡速度，且可观察到更短的生物膜生命周期。</li>
</ol>
	小规模ASM生物膜模型的一个明显应用是更真实地测定生物膜对抗菌药物的敏感性（BSMIC90）。囊性纤维化（CF）肺部存在厌氧和微需氧的微环境，且有证据表明在成熟生物膜的深层区域氧气供应受限2, 17。本文中我们证明，在ASM条件下，来自CF患者痰液的14株临床P. aeruginosa isolates中有10株在微需氧环境中对妥布霉素的敏感性显著降低（4至≥128倍）。本研究结果提示，像妥布霉素这样的抗生素在CF肺部对抗P. aeruginosa感染的效果可能低于常规药敏试验方法所显示的结果。这些结果与既往关于生物膜抗菌药物敏感性的研究一致10。因此，小规模ASM检测提供了一种简单且高通量的平台，可用于生成具有实际意义的抗生素敏感性数据，从而更好地指导治疗决策。该检测的局限性与常规抗生素敏感性检测相同，即筛选时仅挑取单个菌落，可能无法代表整个菌群。然而，我们认为，采用（i）非表面附着的生物膜生长方式，并（ii）适用于微需氧条件的方法，是对现有技术的一种明确替代方案，并具有潜在改进价值。我们得出结论：该检测是研究P. aeruginosa生物膜菌群的合适模型。未来在临床环境中进一步验证，将有助于确定基于生物膜培养的P. aeruginosa所获得的抗生素敏感性结果是否会导致不同的抗生素选择，从而可能改善微生物学和临床疗效。类似的研究已使用经典生物膜模型表明，BSMIC值可导致不同的抗生素治疗建议5,17。
	除了用于检测抗感染药物的有效性外，ASM 系统还为旨在研究多样化的研究提供了廉价、简单且可重复的动物模型替代方案 P. aeruginosa 种群。我们在自然种群中观察到广泛的异质性 P. aeruginosa 从囊性纤维化患者痰液中分离获得 18, 19在ASM中培养时，也可观察到类似的表型和基因型多样化。4 （以及我们未发表的数据），使其成为一个有吸引力的选择 体外 CF肺部条件的模型。ASM模型的相对简便性使其易于设计长期适应性实验，例如用于监测抗生素或其他应激因素对 P. aeruginosa 种群分化。此外，其他细菌病原体也可在ASM中培养。例如，Fouhy 等 2007年，研究人员利用ASM研究生物膜的形成 S. maltophillia20.

<table><tbody><tr><td>鱼精DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74782</td><td></td></tr><tr><td>猪胃黏蛋白，II型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2378</td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>102830250</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-天冬酰胺一水合物</td><td>Acros Organics</td><td>175271000</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-天冬氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>105041000</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-谷氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>156211000</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>220911000</td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-异亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-赖氨酸单盐酸盐</td><td>Acros Organics</td><td>125222500</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>130310250</td><td></td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-丝氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>132660250</td><td></td></tr><tr><td>L-苏氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>138930250</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-色氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>140590250</td><td></td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>140641000</td><td></td></tr><tr><td>L-缬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>二乙烯三胺五乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3160/60</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>VWR</td><td>BDH0262</td><td></td></tr><tr><td>蛋黄乳剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17148</td><td></td></tr><tr><td>ME 2 隔膜真空泵</td><td>Vacuubrand</td><td>696126</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 滤器（孔径：0.22 &amp;mu;m，接口尺寸：45 mm）</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPT10RE</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基（Luria-Bertani培养基）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>82.1581</td><td></td></tr><tr><td>24孔组织培养处理板</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>CampyGen 气体发生包</td><td>Oxford Labware</td><td>CN0025</td><td></td></tr><tr><td>微需氧培养舱</td><td>Oxford Labware</td><td>HP0011</td><td></td></tr><tr><td>妥布霉素硫酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1783</td><td></td></tr><tr><td>纤维素酶，来源于 &lt;em&gt;Aspergillus niger&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22178</td><td></td></tr><tr><td>刃天青</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199303</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>VWR</td><td>BDH0288</td><td></td></tr><tr><td>Fluostar omega 微孔板读数仪</td><td>BMG-Labtech</td><td>SPECTROstar Omega</td><td></td></tr></tbody></table>

使用人工痰液培养基在更贴近囊性纤维化肺部环境的条件下测试抗生素对pseudomonas aeruginosa的疗效

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

随着将in vitro抗菌药物敏感性试验应用于囊性纤维化（CF）患者来源的P. aeruginosa分离株，其相关性日益引发关注。现有方法依赖于在有氧和浮游条件下培养的单一或少数几个分离株，并采用预设的折点来判断细菌对特定抗生素是否敏感或耐药1。然而，在囊性纤维化患者的慢性肺部感染过程中，P. aeruginosa菌群以生物膜形式存在，且有证据表明其生存环境主要为微需氧状态2。肺部细菌所处环境与诊断检测时的条件存在显著差异，这已引起人们对这些检测方法的可靠性甚至适用性的质疑3。
 人工痰液培养基（ASM）是一种含有囊性纤维化（CF）患者痰液成分的培养基，包括氨基酸、黏蛋白和游离DNA。P. aeruginosa在ASM中的生长情况模拟了其在CF感染期间的生长状态，可形成自聚集的生物膜结构并出现种群分化4,5,6。本研究的目的是建立一种基于ASM中生长的微孔板法，用于研究P. aeruginosa在微需氧和有氧条件下的抗菌药物敏感性。
 本研究在微量滴定板中建立了模拟囊性纤维化患者气道分泌物（ASM）的检测方法。P. aeruginosa 生物膜在加入不同浓度的抗菌药物前，先培养3天，随后孵育24小时。生物膜破坏后，通过刃天青（resazurin）染色测定细胞活性。该方法用于测定15株不同的P. aeruginosa分离株在需氧和微需氧条件下的生物膜最低抑制浓度（SMIC），并与标准肉汤培养法所得结果进行比较。尽管在ASM中培养的菌株相较于浮游状态菌株显示出一定的MIC升高趋势，但最大的差异出现在微需氧条件下测试的细菌，与需氧条件下的检测结果相比，其对妥布霉素的耐药性显著增强，最高可达&gt;128倍。
 当前药敏试验方法与临床疗效之间缺乏关联性，这已对现有方法的有效性提出了质疑3。此前已有多种体外模型用于研究P. aeruginosa的生物膜7, 8。然而，这些方法依赖于附着在表面的生物膜，而ASM生物膜更接近囊性纤维化（CF）肺部所观察到的生物膜9。此外，黏液中较低的氧浓度已被证明会改变P. aeruginosa的行为2，并影响其对抗生素的敏感性10。因此，在微需氧条件下使用ASM可提供一个更接近真实环境的体系，用于研究抗菌药物的敏感性。

目前的临床诊断中，抗菌药物敏感性检测依赖于病原菌在营养丰富且富氧条件下的浮游生长。本研究采用一种替代性的人工痰液培养基，以模拟囊性纤维化患者肺部更具代表性的富氧及微需氧环境，从而研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜状态下的抗菌药物敏感性。

使用人工痰液培养基在更贴近囊性纤维化肺部环境的条件下测试抗生素对Pseudomonas aeruginosa的疗效

人们对将体外抗菌药物敏感性试验应用于囊性纤维化患者来源的铜绿假单胞菌分离株时的适用性日益关注……

本实验的目的是在模拟囊性纤维化患者肺部慢性感染的条件下，使用一种确定的人工痰液培养基，评估抗生素对铜绿假单胞菌生物膜的抑制效果。细菌生物膜在24孔微孔板中培养。随后将生物膜暴露于抗生素中。接着，使用纤维素酶破坏经抗生素处理的培养物，并加入代谢染料srin进行孵育，该染料可被活细胞从蓝色还原为粉红色。通过测定各孔的吸光度，可确定生物膜中最低抑菌浓度（B-S-M-I-C），从而在接近生理条件下定量评估抗生素的敏感性。与现有方法（如基于浮游培养测定最低抑菌浓度）相比，该技术的主要优势在于，细菌在含有痰液所有组分的特殊培养基中生长，从而促进生物膜的形成。这些生物膜对抗生素的耐受性显著增强。配制该培养基时，首先准备两个瓶子，在第一个瓶子中加入250毫升无菌水。逐渐加入搅拌，然后将四克鱼精DNA加入250毫升无菌水中。室温下搅拌溶液，使DNA溶解至第二个瓶子中。随后，逐渐加入五克来自猪胃的2型黏蛋白，并进行搅拌。待DNA和黏蛋白溶液准备好后，将氨基酸溶解于100毫升无菌水中，但L-酪氨酸和L-半胱氨酸除外，前者应溶解于25毫升水中，后者应溶解于25毫升0.5摩尔/升氢氧化钾溶液中。接下来，将5.9毫克DTPA、5克氯化钠和2.2克氯化钾溶于100毫升水中。将所有不同的溶液混合至一个1升容量的瓶中，然后加入5毫升蛋黄乳剂，并加水定容至850毫升。使用 1 摩尔的 Tris 将 pH 值调节至 6.9，并加水定容至 1 升，以制备培养基。将培养基用真空泵进行过滤除菌，所用设备为 ME2 隔膜真空泵和 Millipore Steritop 滤器，滤器规格为 45 毫米接口、0.2 微米孔径。过滤过程可在两天内完成。ASM 培养基可在 4°C 下保存最多一个月。首先，将过夜培养的铜绿假单胞菌（pseudomona arosa）培养物在LB培养基中稀释，使OD值达到0.05。然后将细菌以1:100的比例进一步稀释，在24孔细胞培养板的21个孔中，每孔加入1.8毫升稀释后的细菌培养物；在剩余的3个孔中加入等体积的SM培养基，作为阴性空白对照。用封口膜密封24孔板，并将其置于微需氧条件下培养以促进生物膜形成，该条件可通过在大型厌氧罐中使用Campi Gen气体发生包获得。将培养物置于摇床中，在 37 摄氏度、75 RPM 条件下孵育三天。三天后，生物膜将呈现为含有细菌细胞的凝胶状团块，且无法通过移液操作打散。生物膜形成后，向每孔加入 200 微升经连续稀释浓度的抗生素。每种药物浓度至少设置四个重复孔，并保留四个含有生物膜但不加药物处理的孔，作为阴性对照。随后，将之前已孵育的平板继续孵育24小时，孵育时需添加抗生素。使用纤维素酶，用柠檬酸盐缓冲液将其稀释至100毫克/毫升，每孔加入100微升，以破坏生物膜；将平板置于摇床中，在37摄氏度、有氧条件下以150转/分钟（RPM）振荡孵育1小时。此次孵育后，若在培养基中可见细胞团块，可采用手动移液方式进一步分散生物膜。接下来，每孔加入 100 µL 的 rezin，用于定量分析从生物膜中释放的细胞的活力，并将细胞在 37 °C 下孵育一至两小时。在此温度下，只有活细胞能够将蓝色的 zarin 染料代谢为其粉红色荧光形式。孵育结束后，将样品转移至 96 孔板中，并使用 540 nm 激发波长和 590 nm 发射波长测定各孔的荧光强度。为了定量测定细菌活力和药物敏感性，首先从其他孔中减去空白对照的背景荧光值。接着，将每个浓度下的平均荧光值除以未处理对照组的平均荧光值，再乘以100，计算抑制率。B-S-M-Y-C 定义为引起代谢活性抑制达90%的抗生素浓度，如这些电子显微照片所示，以生物膜形式生长的细胞与浮游培养的细菌存在显著差异。特别是，在绿色生物膜中的细胞周围存在大量呈黄色的细胞外基质，而在浮游菌落中则无此现象。此外，在本实验中，生物膜中的细菌通常对抗生素具有更强的耐药性。铜绿假单胞菌浮游培养物（蓝色）对妥布霉素的最低抑菌浓度被确定为约每毫升4微克。相比之下，如红色所示，生物膜中的细菌在高达每毫升512微克的抗生素浓度下仍能100%存活。观看本视频后，您应能充分掌握如何在特定的人工痰液培养基中培养细菌。您还应能够开展抗生素敏感性试验，以确定在更接近囊性纤维化患者肺部环境的条件下抑制细菌生长所需的最低抑菌浓度。

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