从使用吸吸液管技术的嗅觉受体神经元的气味引起的反应记录
April 5th, 2012
嗅觉受体神经元（ORNs）气味信号转换成一个受体的电流，从而触发动作电位，被输送到第二个神经元在嗅球中。这里，我们描述的吸入移液管的技术，同时记录从小鼠ORNs电流和动作电位的加臭剂诱导的受体。
该程序的总体目标是记录小鼠嗅觉受体神经元的气味诱导反应。这是通过首先解剖嗅觉上皮并分离小鼠嗅觉受体神经元来实现的。第二步是将分离的嗅觉受体神经元放置在安装在倒置显微镜上的记录室中。
微型机械手固定记录电极和溶液更换器。接下来，将已识别的嗅觉受体神经元吸入吸液管电极的尖端。最后一步是将吸取的细胞放在溶液更换器前面，使神经元暴露在气味中。
最终，抽吸移液器记录方法用于研究嗅觉受体神经元功能。与现有方法（如全电池电压钳技术）相比，该技术的主要优点是它允许使用快速和精确的解决方案更改来延长记录持续时间。这种方法的视觉演示至关重要，因为记录移液器的形状很重要，并且很难将插座电池稳定地放置在移液器的尖端。
通过在具有长锥度的微量移液器拉拔器中拉动带有 UNFI 的 bo 硅酸盐玻璃毛细管的微量移液器来开始此过程。然后将移液器转移到安装在正置显微镜上的定制微量移液器支架上。显微镜在目镜中有一个 redle，载物台上装有一把可移动的金刚石刀。
接下来，在 20 x 物镜下观察移液器的尖端。使用 redle 作为指南。使用定制的金刚石刀在移液管外径为 90 微米处以 10 度角轻轻划线移液器。
将金刚石刀进一步移向尖端。逐渐对其施加压力。移液器吸头应在划线处干净地断裂。
然后在 40 倍物镜火下，使用电加热细丝将移液器尖端抛光至 5 微米的内径。完成后，微量移液器即可用于记录来自小鼠巢穴的电流。在下一步中，牺牲一只老鼠并移除它的头。
然后剥去头骨上的皮肤，然后沿中线将头部一分为二。接下来，将两个 Hemi 头转移到解剖立体显微镜中。拉出鼻中隔并去除嗅鼻甲。
将组织放入装有葡萄糖的哺乳动物林格溶液的培养皿中。之后，从两个鼻甲上剥下下面的软骨上的嗅觉上皮。将组织转移到含有 250 微升林格液的 einor 管中。
然后将剩余的组织储存在 4 摄氏度以备后用。使用含有嗅觉上皮的 EOR 管以中速短暂涡旋两次，持续一秒钟。此步骤导致 NS 与上皮细胞的机械解离。
接下来，将含有解离的 orns 的林格溶液放入安装在显微镜上的记录室中，使用一对细镊子去除悬浮液中的大块组织。让 ORN 静置 20 分钟，然后开始用林格溶液进行连续灌注，然后在此过程中进行记录，用林格溶液填充移液器。将移液器放入移液器支架中，并将支架连接到膜片钳放大器头级。
接下来，将油管连接到移液器支架的侧端口。然后将移液器放入记录室中。调节储油罐的高度，在移液器吸头处建立略微正压。
这可以通过观察细胞碎片从移液器移出或移向移液器来完成。尽量不要用细胞碎片污染移液器的尖端。接下来，扫描记录室以查找孤立的 ORN，使用 20 至 40 倍的放大倍率可以通过其典型的双极形态来识别。
然后将记录电极移动到靠近 ORN 电池体的位置。轻轻吸吮连接到储油罐的空气管，使细胞体进入移液器的尖端。继续小心缓慢地吸力，直到整个细胞体被吸入抽吸移液管的尖端，使树突和纤毛暴露在浴液中。
将吸液管从包含沉淀管的部分移动到腔室的记录部分。小心地将吸液管放在三桶管的前面进行溶液交换。吸液管应放置在离三桶管开口足够近的位置，以便 ORN 暴露在层流中，从而避免混合湍流 为了实现溶液交换，请将流动溶液的平行流之间的边界从溶液更换器的三个桶管移过吸液管的尖端，以监测溶液交换的质量和可靠性。
可以测量在不同离子组成的溶液之间移动池所引起的结电流。解决方案交换的时间过程通常约为 20 毫秒。当嗅觉受体神经元进入气味剂溶液时，可以在此处引发气味剂诱发的反应。
ORN 暴露于 100 颗微磨牙丁香酚 1 秒钟，如记录上方的条形所示。在上面板中，接收器电流在 0 到 50 赫兹的带宽下过滤以显示接收器电流 只有下面板显示相同的记录，在 0 到 5， 000 赫兹的宽带宽下过滤，以显示动作电位。以下是丁香酚反应性 ORN 的剂量反应丁香酚的使用浓度范围为 0.3 微摩尔至 1000 微摩尔。
刺激持续时间为 1 秒，迹线在 0 到 50 赫兹处过滤。加臭剂浓度的逐渐增加导致更大、更快的上升响应，而这种响应的终止速度也更慢。一旦终止气味剂暴露，ORNS 就会在中等气味剂浓度下进行长时间刺激时表现出振荡反应模式。
在这里，苯乙酮反应性 ORN 在刺激开始时出现快速和短暂的峰值响应后被刺激 8 秒。尝试此过程时，会观察到一系列较小的重复响应。重要的是要记住小心处理嗅觉受体神经元并保持非常耐心。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文描述了一种记录由气味诱导的小鼠嗅觉受体神经元（ORNs）反应的程序。吸引管技术允许同时记录这些神经元的受体电流和动作电位。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 嗅觉系统
背景
- 嗅觉受体神经元将气味信号转换为电信号响应。
- 了解ORN反应对于研究嗅觉处理至关重要。
- 吸引管技术是一种用于电生理记录的有价值的方法。
- 本研究专注于嗅觉研究的小鼠模型。
研究目的
- 记录小鼠ORN的受体电流和动作电位。
- 研究ORN对各种气味的反应。
- 增强对嗅觉信号传导的理解。
使用的方法
- 剥离嗅觉上皮以分离ORN。
- 将分离的神经元放置在倒置显微镜上的记录腔中。
- 使用微操作器夹持记录电极。
- 应用吸引管技术记录神经元反应。
主要结果
- 成功记录了ORN的气味诱导的受体电流。
- 特定气味触发了动作电位。
- 该技术在捕捉神经元反应方面表现出高保真度。
- 结果有助于理解嗅觉处理机制。
结论
- 吸引管技术可有效用于研究ORN反应。
- 研究结果提供了对嗅觉信号传导途径的洞察。
- 该方法可应用于进一步的嗅觉神经科学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable measurement of odorant-induced responses in olfactory receptor neurons (ORNs) is critical for de-risking early-stage sensory biology targets and validating mechanistic hypotheses in chemosensory R&D. The suction pipette technique enables simultaneous recording of receptor currents and action potentials, supporting quantitative assessment of neuronal function and pharmacological modulation. This capability strengthens predictive confidence at the target validation and assay development inflection points for biopharma portfolios focused on sensory pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of ORN function in response to defined odorant stimuli.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing receptor current and action potential kinetics.
- Facilitates validation of genetic or pharmacological perturbations in knockout or labeled mouse models.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, high-fidelity recordings suitable for assay standardization.
- Allows rapid and precise solution changes for controlled compound or odorant application.
- Enables separation of slow receptor currents and fast action potentials for robust readouts.
- Prepares validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling recordings from wild type and genetically modified mice.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of sensory targets.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
- Reduces risk of late-stage biological failure by confirming functional target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The suction pipette technique integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a bridge from mechanistic hypothesis testing to quantitative assay development in sensory neuroscience pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct measurement of ORN responses to odorants and modulators.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides kinetic and amplitude measurements of receptor currents and action potentials for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with preclinical models and supports biomarker development when used with genetically defined ORNs.
- Enterprise Reuse: Adaptable for use across wild type, knockout, and fluorescently labeled ORNs, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in sensory target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of electrophysiological assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of sensory biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology and precise micro-manipulation techniques.
- Demands specialized instrumentation, including suction pipette setup and rapid solution exchange systems.
- Necessitates cross-team standardization of recording parameters and data analysis workflows.
- Adaptable to various mouse models, including wild type, knockout, and fluorescently labeled ORNs.
- Careful handling of neurons and pipette preparation is essential to maintain recording fidelity.
