Name: 将生物探针使用硅烷偶联剂的硅光学生物传感器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习使用硅烷偶联剂将生物素共价固定在硅光学生物传感器表面的方法。该技术通过羟基化、气相沉积和NHS酯化学三步流程，在保持高灵敏度的同时增强传感器稳定性与特异性，适用于多种生物分子检测平台。

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作者们衷心感谢南加州大学的 Andrea Armani 教授在本实验方案开发期间提供的支持。本研究初期开发工作得到了美国国家科学基金会 [085281 和 1028440] 以及美国国立卫生研究院（NIH）通过 NIH 创新者奖项目 [1DP2OD007391-01] 提供的资助。更多相关信息请访问 <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/~hunthk/</a>。

1. 背景
通过一个简单的三步过程，将生物素连接到这些装置的表面（图1）。首先，我们通过将装置暴露于氧气等离子体或piranha溶液中，对表面进行清洗并使其表面富含羟基。其次，我们采用气相沉积法，通过水解和缩合反应将末端带有伯胺基团的硅烷偶联剂连接到羟基上。第三步，我们利用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯化学法将生物素连接到表面。有关这些技术的开发细节以及我们选择这些技术的动机，建议感兴趣的读者参阅我们之前的文献8。
在加入伯胺以及生物素后，可通过光学显微镜和荧光显微镜评估这些反应的成功程度。光学显微镜可用于判断表面功能化流程是否对微球表面造成损伤或污染；而荧光显微镜则用于验证生物素分子在表面覆盖的质量与均匀性，以及表面生物素与（链霉）亲和素结合的能力。为评估表面伯胺的覆盖情况，我们使用了异硫氰酸荧光素（FITC）荧光染料，该染料可与伯胺反应，在微球表面形成稳定的共价硫脲键连接。为标记表面的生物素基团，采用与亲和素偶联的德克萨斯红（Texas Red）荧光染料，通过生物素-亲和素相互作用进行标记。在这两种情况下，所选用的染料均可通过受体-配体相互作用或共价键合方式与表面的功能基团发生作用。
在此，含有三个离去基团和一个功能基团的硅烷偶联剂在无机表面与有机探针分子之间起到桥梁作用。伯胺功能基团可与NHS酯定量反应，形成稳定的酰胺键。本例中，我们使用一种生物素探针分子，其缬氨酸侧链上已修饰有NHS酯基团。实际上，任何可通过以下方案在其表面引入NHS酯基团的探针分子均可适用。此外，这些方案具有通用性，可用于在任何二氧化硅器件表面进行生物素功能化修饰。
这些方案的主要挑战实际上并不在于化学反应本身，而在于二氧化硅微球的处理。请注意，在整个实验过程中，应使用尖头镊子轻轻夹住微球的茎部进行操作。这样可使镊子远离微球本体，便于在各步骤之间轻松转移。以下方案中的许多步骤均专门针对这一因素而设计。
2. 微球制备
<ol>
	<li>构建微球的存储装置。
	<ol>
		<li>使用美工刀将一块¼英寸厚的纸板裁剪成1英寸×1英寸的正方形；将其用胶带固定在标准尺寸的玻璃载片上，并将一段1英寸长的透明胶带两端相接形成卷状，粘附在纸板上。</li>
		<li>由此可形成一个平台，使微球得以抬高并与其周围环境隔离，从而防止其表面受损。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>使用剪刀从光纤卷盘上截取一段3英寸长的光纤。</li>
	<li>使用No-Nik光纤剥线钳，去除所截光纤末端最后0.5英寸的保护性聚合物涂层，仅保留石英纤芯。用浸有甲醇的Kimwipe轻轻擦拭光纤表面，以清除残留的聚合物。</li>
	<li>使用裸光纤切割刀修剪已剥除涂层的端部，使光纤末端仅保留约1毫米的裸露部分。</li>
	<li>将光纤的裸露端放入CO2激光器的光路中，注意垂直对准光纤，使其裸露端朝下。</li>
	<li>开启CO2激光器，并将激光束对准光纤裸露端的表面。激光将在2秒内以约3.5%的功率将光纤裸露端熔融成球形。</li>
	<li>使用镊子小心夹住微球的茎部（即光纤未剥除涂层的部分），并将茎部固定在微球存储装置的胶带卷上。该玻璃载片本身可存放于培养皿中，以便安全保存微球。</li>
</ol>
3. 在表面引入羟基
<ol>
	<li>使用piranha溶液：
	<ol>
		<li>在带有铰链盖的60 mL聚丙烯小瓶中，通过向瓶中加入5 mL过氧化氢，然后加入11.6 mL发烟硫酸，配制piranha溶液（按体积比70:30的发烟H2SO4:H2O2（30 wt%））。注意：需佩戴耐酸手套。</li>
		<li>将至少含有一个微球的载玻片转移至该小瓶中。微球应与液体接触，但液体不得接触纸板。如有需要，可调整溶液体积。</li>
		<li>小心地将载玻片从瓶中取出，并插入另一个装有去离子水（DDI H2O）的塑料小瓶中。让样品在溶液中静置5分钟。</li>
		<li>小心地将载玻片从瓶中取出，放入80 °C的烘箱中干燥10分钟，以干燥表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用氧气等离子体处理：
	<ol>
		<li>将至少含有一个微球的载玻片转移至氧气等离子体腔室中。</li>
		<li>设定氧气压力为200 mTorr，功率为120 W，使样品暴露于氧气等离子体中2分钟。</li>
		<li>将载玻片从等离子体腔室中取出。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将硅烷偶联剂连接到表面
<ol>
	<li>将含有至少一个微球的载玻片放入通风橱中的真空干燥器内。</li>
	<li>同样在通风橱中，打开硅烷偶联剂瓶（本实验中使用的是氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）），并将打开的瓶子放入干燥器中。</li>
	<li>盖上真空干燥器的盖子，并将出口端连接至抽气泵或实验室真空管线。</li>
	<li>开启实验室真空系统或水抽装置，对真空干燥器进行抽真空。当盖子与底座之间形成真空密封后，开始计时反应。此过程将在表面沉积一层硅烷偶联剂的薄膜。</li>
	<li>15 分钟后，关闭真空系统，并缓慢打开通气口，使空气进入干燥器。对于该偶联剂，15 分钟足以在表面形成均匀的单分子层。对于其他偶联剂，可能需要调整反应时间。</li>
</ol>
5. 将生物素连接至表面
<ol>
	<li>在连接生物素前约一小时，于一个带铰链盖的60 mL聚丙烯瓶中，用无水二甲基亚砜（DMSO）配制10 mM的N-羟基琥珀酰亚胺生物素（NHS-biotin）溶液。
	<ol>
		<li>若NHS-biotin曾低温保存，请在称量前使其平衡至室温。</li>
		<li>将溶液超声处理1小时，以使NHS-biotin粉末在溶剂中完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有微球的玻片转移至另一个塑料瓶中，使微球位于瓶底，而玻片的柄部朝上。</li>
	<li>使用塑料移液管，沿瓶壁缓慢加入适量NHS-biotin溶液，置于玻片后方（确保溶液加入时不接触微球），加入足够体积以覆盖微球表面。</li>
	<li>将含有微球及NHS-biotin DMSO溶液的瓶子置于摇摆式孵育器（倾斜托盘）中，在室温下以5 rpm的转速和5度的倾斜角度孵育30分钟。</li>
	<li>小心地将玻片从瓶中取出，轻轻滑入另一个盛有去离子水（DDI H2O）的瓶中。将瓶子再次置于倾斜托盘上，以与之前相同的转速和倾斜角度孵育10分钟。每次均更换新鲜水，重复此步骤两次。该步骤有助于去除表面残留的过量DMSO，并清除未共价结合而仅物理吸附在表面的生物素。</li>
	<li>将玻片从瓶中取出，放入80 °C烘箱中加热10分钟，或直至表面所有水滴完全蒸发。</li>
</ol>
6. 胺基封端二氧化硅的荧光标记
<ol>
	<li>为了标记经 APTMS 处理后暴露的氨基基团，需在避光环境中配制 FITC 溶液：将 1 mg FITC 溶解于 1 mL 无水 DMSO 中。</li>
	<li>通过将 50 μL FITC 溶液加入 1 mL 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液中，稀释步骤 6.1 中的溶液。</li>
	<li>将该溶液置于一个带铰链盖的 60 mL 聚丙烯瓶中，轻轻将载于玻璃载玻片上的氨基末端微球滑入瓶内。</li>
	<li>将瓶子置于冰浴中，在避光条件下使样品与 FITC 溶液反应至少 4 小时。</li>
	<li>通过两次、每次 10 分钟的碳酸钠缓冲液冲洗去除多余的荧光染料。与之前相同，将带铰链盖的 60 mL 聚丙烯瓶装满缓冲液，轻轻将玻璃载玻片滑入溶液中，注意仅使微球部分浸没于溶液，避免接触纸板支架。用铝箔覆盖瓶口，并将瓶子置于倾斜 5 度、转速 5 rpm 的倾斜托盘上，操作同前。</li>
	<li>轻轻将玻璃载玻片从瓶中取出，再小心滑入另一个装有去离子水（DDI H2O）并用铝箔覆盖的瓶子中。将瓶子置于相同转速和倾斜角度的托盘上，持续 10 分钟。每次使用新鲜水重复此步骤两次，以帮助去除表面残留的染料。</li>
	<li>轻轻将玻璃载玻片从瓶中取出，在成像前于 80 °C 烘箱中干燥 10 分钟。</li>
</ol>
7. 生物素末端修饰二氧化硅的荧光标记
<ol>
	<li>在磷酸盐缓冲液中配制浓度为 10 μg/mL 的 Texas-Red 标记亲和素溶液。</li>
	<li>将该溶液加入一个带铰链盖的 60 mL 聚丙烯瓶中，然后轻轻将载有生物素末端微球的玻片滑入溶液中，使微球刚好被溶液覆盖。</li>
	<li>在室温避光条件下反应 30 分钟。</li>
	<li>通过在 PBS 缓冲液中清洗微球两次，每次 10 分钟，以去除多余的荧光染料。
	<ol>
		<li>同前，将带铰链盖的 60 mL 聚丙烯瓶用缓冲液装满，然后轻轻将玻片滑入溶液中，注意仅使溶液覆盖微球，避免接触纸板外壳。</li>
		<li>用铝箔覆盖瓶口，同前将瓶子置于倾斜角为 5 度、转速为 5 rpm 的倾斜托盘上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心将玻片从瓶中取出，再轻轻滑入另一个装有去离子水（DDI H2O）并用铝箔覆盖的瓶子中。将瓶子置于相同转速和倾斜角度的倾斜托盘上，继续处理 10 分钟。每次均更换新鲜去离子水，重复此步骤两次。此过程有助于去除表面多余的染料。</li>
	<li>小心将玻片从瓶中取出，在 80 °C 的烘箱中干燥 10 分钟，然后进行成像。</li>
</ol>
8. 代表性结果
通过光学显微镜和荧光显微镜可以识别正确功能化的微球。如果表面功能化操作正确，微球表面应形成均匀且高密度的生物素分子覆盖层，并且在功能化后表面应保持无缺陷和无污染物，以确保在检测实验中维持其高灵敏度。光学显微镜可用于检测后者，而荧光显微镜则可用于评估表面覆盖的质量和均匀性。图2展示了正确功能化微球的示例。这些图像表明，功能化过程未造成表面损伤或污染（图2a），且微球表面呈现出均匀一致的氨基（图2b）或生物素基团（图2c）覆盖。 
如果微球未正确进行功能化处理，光学显微镜下的微球图像将显示出表面污染、聚集或覆盖不均，以及明显的表面缺陷（如表面裂纹）（图3）。此处展示了一个常见的表面污染示例，系由试剂在表面聚集所致。
<img alt="表面修饰过程；SiO₂、气相沉积、FITC标记及Texas Red-Avidin整合示意图。" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 将探针分子连接至二氧化硅微球表面的三步反应示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="用于材料分析的不同荧光滤光片下的微结构显微图像。" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 二氧化硅微球。a) 经氧气等离子体处理后表面富含羟基的二氧化硅微球的光学显微图像；b) 表面修饰有伯胺基团并用 FITC 染料标记的二氧化硅微球的荧光显微图像；c) 表面修饰有生物素并用 Texas Red-亲和素偶联物标记的二氧化硅微球的荧光显微图像。经 Soteropulos, C. E., Hunt, H. K. &amp; Armani, A. M. 允许转载，摘自《利用回音壁模式微腔测定结合动力学》，Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011)。版权所有 2011，美国物理联合会。17
<img alt="用于基因工程过程的单细胞显微注射装置的显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 功能化不良微球的光学显微图像。在此图像中，您可以看到右上方表面存在灰尘，以及延伸出表面的污染物。此外，光学微球的右侧表面显示出一个小凹坑。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

如实验方案所述，我们设计了一种承载平台，用于在功能化过程中通过微球的茎部对其进行转移。该承载平台的开发旨在解决微球在功能化流程中与各种容器壁接触所导致的表面污染和损伤问题。我们发现，主要困难在于功能化过程中需要反复将单个微球连接和脱离不同的容器。当使用镊子夹持微球茎部逐个移动时，很难避免微球与物体表面发生刮擦。通过将每个微球固定在载玻片上的特定位置，我们仅需操作载玻片本身，而非微球的茎部，即可方便地将多个微球整体移入或移出不同的容器。通过这种方法，我们能够同时对大量微球进行功能化处理，并消除了因操作不当引起的污染和表面损伤，最终实现了约90%的完整且成功功能化的微球制备成功率。
如实验方案所述，我们探索了两种对二氧化硅微球进行羟基化的方法。虽然通常使用piranha溶液进行该处理，但该方法耗时较长，且需要湿化学操作。在处理微球时，我们发现通过氧气等离子体处理进行羟基化具有更优的效果。氧气等离子体处理无需接触液体溶液、无需干燥步骤，也无需直接操作二氧化硅微球。此外，该方法在表面引入羟基的速度要快得多。然而，我们认识到并非所有研究团队都能获得氧气等离子体设备，因此可能需要使用pira...

使用硅烷偶联剂将生物探针连接到二氧化硅光学生物传感器上

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

为了与生物环境相互作用，生物传感器平台（例如广泛使用的Biacore系统，基于表面等离子体共振（SPR）技术）采用多种表面修饰技术，这些技术可以防止表面污染、调节表面的疏水性/亲水性、适应多种电子环境，而最常见的是赋予传感器对特定目标分子的选择性。1-5 这些技术将原本高灵敏度的生物传感器功能拓展至复杂环境下的实际应用，例如血液、尿液和废水分析。2,6-7 尽管Biacore等商用生物传感平台已有明确且标准化的表面修饰方法，但这些方法尚未以标准化的方式应用于其他无标记生物传感平台，例如回音壁模式（Whispering Gallery Mode, WGM）光学谐振器。8-9
回音壁模式（WGM）光学谐振器是一种极具前景的技术，可用于在极低浓度下实现对多种物质的无标记检测。6,10-12 这类平台的高灵敏度源于其独特的几何光学特性：WGM光学谐振器将循环光限制在特定的整数共振频率上。13 与表面等离子体共振（SPR）平台类似，光学场并非完全局限于传感器器件内部，而是会发生倏逝；这种“倏逝尾部”可与周围环境中的物质发生相互作用。该相互作用会引起光学场有效折射率的变化，从而导致器件共振频率发生微小但可检测的偏移。由于光学场在谐振器内循环传播，可多次与周围环境相互作用，因而实现了信号的内在放大，使器件对环境中的微小变化具有极高的灵敏度。2,14-15
为了在复杂环境中实现靶向检测，这些平台必须通过表面修饰与探针分子（通常为结合对的一半，例如抗体/抗原）相偶联。2 尽管回音壁模式（WGM）光学谐振器可由多种材料体系制成多种几何结构，但二氧化硅微球是最常见的类型。这些微球通常在光纤末端制备，从而形成一个“茎部”，便于在功能化和检测实验中操作微球。可采用二氧化硅表面化学方法将探针分子固定在其表面；然而，为平面基底开发的传统技术通常不适用于这些三维结构，因为微球表面的任何变化（如灰尘、污染、表面缺陷或涂层不均）都可能对其检测能力产生严重不利影响。本文中，我们展示了一种简便的方法，利用硅烷偶联剂在无机表面与生物环境之间搭建桥梁，将生物素连接到二氧化硅表面，从而实现二氧化硅微球WGM光学谐振器的表面功能化。8,16 尽管本研究中以二氧化硅微球WGM谐振器作为传感系统，但所描述的实验方案具有普适性，可用于将生物素功能化至任何二氧化硅器件的表面。

生物传感器通过表面修饰将高灵敏度传感器与高特异性探针结合，从而与复杂的生物环境相互作用并实现靶向检测。在此，我们演示了使用硅烷偶联剂作为桥梁，通过生物素对二氧化硅光学传感器进行表面功能化修饰的方法。

为了与生物环境进行交互，生物传感器平台（如广泛使用的Biacore系统，该系统基于表面等离子体共振（SPR）技术）……

本实验的总体目标是通过共价结合的方法，在不降低器件灵敏度的前提下，将生物素涂覆于硅基微球光学谐振器的表面。该过程分为三个步骤：首先使用氧气等离子体或Piranha蚀刻法进行羟基化处理，随后通过硅烷偶联剂的蒸气沉积实现硅烷化，最后利用NHS酯化学方法将生物素的戊酸侧链与谐振器表面的伯胺基团连接，完成生物素化修饰。最终，该方法可构建一种对目标分子具有高灵敏度和高特异性的光学生物传感器，并可通过荧光标记末端硅烷以及Ava tin-生物素复合方法进一步改造，从而构建适用于多种潜在目标分子的生物传感平台。与物理吸附等现有表面功能化方法相比，该技术的主要优势在于探针分子以共价键形式固定，使传感器更加稳定可靠。这意味着传感器可长期储存仍保持其功能，并在功能化后仍维持高度的灵敏性。通常，初次接触该方法的研究人员会因在功能化过程中难以操作微米级尺寸的装置而遇到困难。操作技术不当最容易导致传感器光学性能下降，并在传感器表面产生污染。使用剪刀将一块四分之一英寸厚的纸板裁剪成一英寸乘一英寸的正方形。将此物粘贴到标准玻片上，并在纸板上固定一段一英寸长的卷状透明胶带。这样可形成一个平台，用于抬高微球并将其与周围环境隔离，同时防止使用剪刀时对其表面造成损伤。从线轴上截取一段三英寸长的光纤。接下来，使用无划痕光纤剥线钳剥离光纤切割段末端最后0.5英寸的保护性聚合物涂层，仅留下石英纤芯；用沾有甲醇的无尘纸轻轻擦拭光纤表面，清除残留的聚合物。使用裸光纤切割刀修剪已剥除涂层的端部，使光纤末端仅保留约1毫米的裸露部分。将光纤的裸露端放入二氧化碳激光器的光路中，并注意保持垂直。调整光纤位置，使其裸露端朝下。打开二氧化碳激光器，并将其对准光纤剥除端的表面。激光将在两秒内以约3.5%的功率将光纤剥除端熔化成一个微球。使用镊子小心夹住微球的茎部。将茎部连接到微球外壳的胶带卷上。载玻片可存放在培养皿中，以便将微球安全地储存在60毫升带铰链盖的聚丙烯瓶中。通过向瓶中加入3毫升过氧化氢，再加入7毫升发烟硫酸，配制匹兰沙溶液。将载有至少一个微球的玻片转移至小瓶中。微球应与液体接触，但液体不得接触到纸板。必要时调整溶液的体积。将小球浸入食人鱼溶液15分钟后，轻轻将玻片从瓶中取出，并插入另一个装有去离子蒸馏水的塑料瓶中。将瓶子置于倾斜托盘上，以5度倾角和5 rpm转速倾斜5分钟。然后轻轻将玻片从瓶中取出，放入80摄氏度的烘箱中加热10分钟。为了干燥表面，将载有至少一个微球的玻片放入真空干燥器中进行干燥。打开硅烷偶联剂瓶（如 A-P-T-M-S），并将打开的瓶子放入干燥器内。盖上真空干燥器的盖子，并将出口端连接至抽吸泵或实验室真空管线。打开房屋、真空泵或水路开关，抽空真空干燥器。当盖子与底座之间形成真空密封后，开始计时反应。这将使硅烷偶联剂以薄膜形式沉积在表面。15分钟后，关闭真空泵并缓慢打开端口，使空气进入干燥器。对

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使用硅烷偶联剂将生物探针连接到二氧化硅光学生物传感器上

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