Name: 实时定量PCR（qPCR的microRNA检测在前列腺肿瘤） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习使用实时定量PCR技术检测前列腺癌组织中的microRNA表达水平。该方法通过提取总RNA、逆转录生成cDNA并进行SYBR Green荧光定量PCR，实现高灵敏度、高准确度的miRNA定量分析，为肿瘤生物标志物研究提供可靠工具。

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本工作由加拿大癌症协会研究所资助，资助编号 019038。

1. 前列腺样本采集
<ol>
 <li> 在前列腺切除术时采集前列腺样本。使用解剖学标志对样本进行定位。前列腺和精囊用以下方式标记：右侧涂绿色，左侧涂蓝色。</li>
 <li> 取与直肠面垂直的前列腺随机横切中段，浸入液氮中速冻，并于 -80 °C 下保存9。</li>
 <li> 将保存的组织切片进行复印，根据前、后、右、左方向进行定位，并将其四等分。使用冷冻切片机进行切片。</li>
 <li> 切片用 H&amp;E 染色，并由病理学家进行评估，以在染色切片及其对应图像上确定并勾画出肿瘤区域与正常区域。所标记的区域作为后续步骤中提取用于RNA提取的肿瘤组织的参考依据。</li>
</ol>

2. 从样品中分离总RNA（包括miRNA）
<ol>
 <li>将冷冻的前列腺样本置于干冰上，并参照已标记的复印件，切取前列腺肿瘤的一小部分（50 至 100 mg）。</li>
 <li>将前列腺肿瘤组织在 1 mL TRIzol 试剂中匀浆。后续步骤中的用量均基于使用 1 mL TRIzol 试剂。</li>
</ol>
 注意：此处我们使用TRIzol试剂提取RNA，但其他可分离含小RNA的总RNA的试剂盒也可使用。
<ol start="3">
 <li>将匀浆样品在室温下孵育 5 分钟。</li>
 <li>向样品中加入 0.2 mL 氯仿，剧烈振荡 15 秒。室温孵育 3 分钟，然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。</li>
 <li>将无色的上层水相转移至新的离心管中，加入 0.5 mL 异丙醇。室温孵育 10 分钟，然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。</li>
 <li>小心吸除上清液，避免扰动含有 RNA 的沉淀。用 1 mL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。涡旋混匀样品，并在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟，重新沉淀 RNA。</li>
 <li>小心吸除上清液，将 RNA 沉淀干燥 5–10 分钟，注意确保 RNA 沉淀不完全干燥。根据沉淀大小，用无核酸酶水重新溶解。使用 NanoDrop 1000 分光光度计测定 RNA 浓度（在 260 nm 和 280 nm 处测定吸光度）。</li>
 <li>使用 Agilent Bioanalyzer 检测 RNA 样品的质量和完整性。</li>
</ol>
3. RNA 逆转录
<ol>
 <li>使用miScript逆转录试剂盒（Qiagen）按照制造商说明书进行RNA的逆转录。该试剂盒包含逆转录酶和多聚腺苷酸聚合酶（poly(A) polymerase）。miScript RT缓冲液包含Mg2+、dNTPs、oligo-dT引物和随机引物。</li>
 <li>使用10 pg至1 μg的RNA合成cDNA。若RNA用量超过1 μg，需按比例线性放大反应体系至适当体积。</li>
 <li>配制主混合液，其中包含5X miScript RT缓冲液（4 μl）、miScript逆转录混合液（1 μl）以及无RNase水，使反应终体积为20 μl。同时在主混合液中加入模板RNA（最多1 μg）。</li>
 <li>将样品在37 °C孵育60分钟，随后立即在95 °C孵育5分钟。该步骤可在PCR仪、加热块或水浴中进行，其中热循环仪为最适宜且精确的方法。cDNA可短期保存于冰上，长期保存则置于-20 °C。</li>
</ol>
4. 生成标准曲线
<ol>
 <li>在对目标miRNA进行实验之前，需使用已知浓度的cDNA与其扩增循环阈值（CP）建立标准曲线（图2）。</li>
 <li>准备一系列稀释样品，分别为原始cDNA的2倍、10倍、50倍、250倍和1250倍稀释，该样品已知其目的基因有较高表达水平。</li>
 <li>按照第5节“miRNA实时PCR检测”中指定的条件进行PCR扩增，唯一修改是cDNA采用系列稀释浓度，而非固定的40倍稀释。</li>
 <li>使用Roche公司的RelQuant软件进行分析，生成标准曲线。</li>
 </ol>
注意：每种目的基因都必须生成一条新的标准曲线。
5. miRNA 检测的实时 PCR
<ol>
 <li>根据制造商说明（Qiagen），使用 miScript SYBR Green PCR 试剂盒和 miScript 引物检测进行 miRNA 的实时 PCR。配制总反应体系，包含 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、10x miScript Universal Primer、10x miScript Primer Assay 和无 RNase 水。为 20 μl 反应体积配制总反应混合液。</li>
 <li>引物检测针对目标 miRNA 特异性设计。为配制 10x miScript 引物检测液，短暂离心试剂管，加入 550 μl TE 缓冲液（pH 8.0）。短暂涡旋混匀，将引物分装为小体积，于 -20 °C 保存。需要两种引物：目标基因引物和参考基因引物。RNU6B 用作参考基因。</li>
 <li>将 cDNA 稀释 40 倍，并将多余分装样品于 -20 °C 保存。</li>
 <li>cDNA 作为 PCR 的模板。取 2 μl 40 倍稀释的 cDNA，加入 20 μl Light Cycler 毛细管（Roche）中。</li>
 <li>向每根毛细管中加入 18 μl 总反应混合液，并使用毛细管适配器进行离心。</li>
 <li>将毛细管放入基于毛细管的实时 PCR 仪中，例如 LightCycler 3.5 实时 PCR 系统，采用 32 毛细管转盘格式。</li>
 <li>运行 PCR 扩增程序如下： 
 为激活 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 中的 HotStarTaq 聚合酶，在 95 °C 预孵育 15 分钟。 
 随后进行 50 个循环： 
 变性：94 °C，15 秒； 
 退火：55 °C，30 秒； 
 延伸：70 °C，30 秒。</li>
 <li>选择一个样本作为校准样本，并将其归一化后的目标量设为 1。将其他所有样本中 miRNA 的相对表达量与该校准样本进行比较。</li>
 </ol>
 注意：在一项研究中，应使用相同的校准样品以保持结果的一致性。
6. 数据分析
<ol>
 <li>PCR 反应的扩增曲线由罗氏公司的 Molecular Biochemicals LightCycler 软件版本 3.5 以图形和数值形式显示。在“定量”选项卡中对反应进行定量分析，并将数据导出为文本文件。</li>
 <li>将数据导入罗氏公司的 RelQuant 分析软件以生成定量结果。分别导入目标基因、参考基因和标准曲线数据的文件。</li>
 <li>指定目标基因和参考基因的校准样本位置，同时指定各待测样本的位置。数据表示为不同样本的目标基因与参考基因比值除以校准样本的目标基因与参考基因比值。此前针对特定 miRNA 和看家基因建立的标准曲线将作为参考标准，用于推算未知浓度 miRNA 目标物的定量数据。</li>
 <li>将同一样本的三个重复作为一组进行分析，计算其平均浓度和标准差。如果三个重复中有一个与其他两个结果不一致，程序将自动将其排除。</li>
</ol>
7. 典型结果
前列腺样本的qPCR分析示例如图3所示。结果以数值和图形两种形式呈现。显示参考基因U6表达水平的图表中，其扩增曲线大约在第20个循环开始进入指数扩增期，而目标基因miR-98的表达则在约第25个循环才开始出现扩增延迟。本实验的数据以文本文件形式导出，并使用RelQuant分析软件进行分析。图中标明了含有校准品和各待测样本的毛细管位置。图4展示了如何将校准品的表达量设定为1，并计算其他样本相对于校准品的相对表达量。
<img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig1.jpg" alt="总RNA制备过程；Poly-A尾、逆转录、cDNA合成、实时PCR示意图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. miScript逆转录与实时PCR的各个步骤。
<img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig2.jpg" alt="miR-98 和 RNU6B 基因表达分析的标准曲线图，浓度与 CP 值的关系。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过将原始 cDNA 样本进行 2 倍、10 倍、50 倍、250 倍和 1250 倍的一系列稀释，绘制出标准曲线。
<img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig3.jpg" alt="实时荧光定量PCR，荧光值与循环数关系图，DNA定量结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. Roche Molecular Biochemicals LightCycler 软件以图形和文本形式显示实验的全部信息。实时荧光定量PCR扩增曲线显示了不同样本荧光信号的增加情况。
<img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig4.jpg" alt="显示扩增阈值循环数及浓度比值数据分析的定量PCR结果表格。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 使用 RelQuant LightCycler 分析软件对数据进行定量。通常将样本的三个重复作为一组进行分析，剔除结果明显不一致的样本，并计算三个重复样本的平均浓度及其标准偏差。

<ol><li>Reinhart, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).</li>
<li>Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+microRNA+Mir-14+suppresses+cell+death+and+is+required+for+normal+fat+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.</a> Curr. Biol. 13, 790(2003).</li>
<li>Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+proliferation+pathways+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Control of cell proliferation pathways by microRNAs.</a> Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).</li>
<li>Friedman, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92(2009).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-281 (2004).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 704(2009).</li>
<li>Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Relat.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).</li>
<li>Gordanpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-221+Is+down-regulated+in+TMPRSS2%3AERG+fusion-positive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer.</a> Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).</li>
<li>Nam, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+TMPRSS2%3AERG+fusion+gene+predicts+cancer+recurrence+after+surgery+for+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer.</a> Br. J. Cancer. 97, 1690(2007).</li>
<li>Ambs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 6162(2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-34a+inhibits+prostate+cancer+stem+cells+and+metastasis+by+directly+repressing+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44.</a> Nat. Med. 17, 211(2011).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

与正常组织相比，某些miRNA在前列腺肿瘤中的异常表达 consistently 被发现10，其中一些miRNA已被命名为针对前列腺癌的潜在新型治疗剂11。因此，miRNA的异常表达水平可作为有用的诊断和/或预后生物标志物。本文介绍的实时qPCR方法可实现对前列腺肿瘤组织中miRNA水平的精确定量。所使用的miScript PCR系统能够检测成熟miRNA之间的单核苷酸差异。然而，miScript miRNA qPCR检测法不适用于检测茎环前体miRNA，对于此类前体miRNA，可使用不同的miScript前体检测法。
该技术的可靠性取决于输入RNA的质量，因此在进行实时PCR之前，应检测RNA的浓度、完整性和纯度。此外，核糖核酸酶非常稳定，容易降解RNA，因此在处理RNA时需格外小心。所有反应均应在冰上进行，以尽量减少RNA降解。逆转录前也可在反应体系中加入RNase抑制剂。操作过程中应频繁更换手套，并且整个实验过程必须使用无菌、一次性塑料耗材。
如果在实时荧光定量PCR中未扩增出...

<table><tbody><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596</td><td></td></tr><tr><td>miScript 反转录试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>218061</td><td></td></tr><tr><td>miScript 引物检测试剂</td><td>Qiagen</td><td>实验特异性</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 3.5 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Roche 集团</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler 毛细管</td><td>Roche 集团</td><td>04929292001</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2538</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>G2943CA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qpcr）检测前列腺肿瘤中的微小rna

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

microRNA（miRNA）是单链、长度为18–24个核苷酸的非编码RNA分子。它们几乎参与了包括发育1、凋亡2和细胞周期调控3在内的所有细胞过程。据估计，miRNA通过与靶标信使RNA（mRNA）结合5，可调控30%至90%人类基因的表达4。在多种疾病及癌症亚型中，已报道存在miRNA的广泛失调6。由于其普遍存在性及独特结构，这些小分子有望成为下一代生物标志物、治疗药物和/或治疗靶点。
用于检测miRNA表达的方法包括基于SYBR Green I染料以及基于TaqMan探针的qPCR。若要将miRNA有效应用于临床环境，必须确保其在新鲜和/或存档的临床样本中的检测具有准确性、可重复性和特异性。qPCR已广泛用于验证全基因组分析（如微阵列研究）中miRNA的表达7。本方案所用样本来自接受根治性前列腺切除术的临床局限性前列腺癌患者；但也可替换为其他组织或细胞系。前列腺标本在切除后立即在液氮中速冻。同时收集每位患者的临床变量及随访信息，以供后续分析8。
前列腺肿瘤样本中miRNA水平的定量。肿瘤qPCR分析的主要步骤包括：总RNA提取、cDNA合成以及使用miRNA特异性引物检测qPCR产物。使用TRIzol试剂从样本中提取包含mRNA、miRNA及其他小RNA在内的总RNA。采用Qiagen的miScript系统进行cDNA合成和qPCR（图1）。内源性miRNA不含poly(A)尾，因此在逆转录过程中，通过poly(A)聚合酶对miRNA进行poly(A)修饰。随后以miRNA为模板，在寡核苷酸oligo-dT和逆转录酶的作用下合成cDNA。oligo-dT引物5'端带有一段通用标签序列，可在PCR步骤中促进cDNA的扩增。PCR产物的扩增通过SYBR Green染料发出的荧光水平进行检测，该染料可嵌入双链DNA中。特异性miRNA引物与可结合通用标签序列的通用引物共同作用，可扩增特定的miRNA序列。
miScript引物检测试剂盒可用于检测一千多种人源特异性miRNA以及数百种小鼠源特异性miRNA。本实验采用相对定量法对miRNA的表达水平进行定量。为校正不同样本之间的差异，需将目标miRNA的表达水平归一化至参考基因的表达水平。在相对定量分析方法中，参考基因的选择至关重要。常用的参考基因包括小分子RNA RNU6B、RNU44和RNU48，因为它们在大多数样本中表达稳定。本实验方案中选用RNU6B作为参考基因。

定量实时聚合酶链式反应（qPCR）是一种快速且灵敏的方法，用于检测肿瘤样本中多种微小RNA（miRNA）分子的表达水平。利用该方法，可从同一cDNA模板扩增、定量并分析数百种不同miRNA分子的表达。

通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测前列腺肿瘤中的微小RNA

微小RNA（miRNAs）是单链、长度为18–24个核苷酸的非编码RNA分子。它们几乎参与了所有细胞过程……

以下实验的总体目标是利用实时定量 PCR 技术，定量分析前列腺癌组织与正常前列腺组织中 micro RNA 分子的表达水平。该目标首先通过从前列腺组织中提取总 RNA 来实现，其中包括 mRNA、micro RNA 以及其他小 RNA。接下来，将RNA逆转录生成cDNA。然后以cDNA为模板，采用基于SYBR Green的实时PCR技术，对microRNA的表达进行实时扩增与定量。通过定量实时PCR获得结果，显示不同前列腺样本中microRNA的相对表达水平。该技术相较于其他方法的主要优势在于具有高灵敏度、高准确性、良好的重复性，且快速、成本低。该方法可用于解答癌症生物学领域的关键问题，因为microRNA的表达通常与深度参与癌症进程的基因密切相关。因此，我们可通过qPCR评估microRNA的表达水平，并分析其与临床变量之间的相关性。这些生物标志物有可能被用作诊断和预后工具。它们不仅有助于我们诊断前列腺癌，还能帮助我们判断哪些前列腺癌具有侵袭性。此外，这些生物标志物还可能具备成为治疗剂的潜力。该方法不仅能为前列腺肿瘤的发生机制提供见解，还可应用于其他癌症和疾病的研究。在切除术时采集前列腺样本，并利用解剖学标志对样本进行定位。按如下方式对前列腺和精囊进行染色：右侧染成绿色，左侧染成蓝色。取与直肠表面垂直的组织随机横切中段，将样本冷冻并储存在负80摄氏度。复印切片图像，定位标本切片并将其均分为四个相等部分。咨询病理科医生，根据相应图像确定肿瘤区与正常区。使用标记区域作为指导，识别用于提取RNA的肿瘤组织。开始操作前，将冷冻的前列腺样本置于干冰上，并参考已划定边界的复印件。切取一小部分前列腺肿瘤组织。将前列腺肿瘤组织在1毫升三试剂中匀浆。将匀浆后的样品孵育5分钟。在室温下，向样品中加入0.2毫升氯仿，剧烈振荡15秒。将样品在室温下孵育3分钟，然后在4°C条件下以12,000 × g离心15分钟。将无色的上层水相转移至新的离心管中，并加入0.5毫升异丙醇。室温孵育10分钟后，在4°C条件下以12,000 × g离心10分钟。小心吸除上清液，避免扰动含有 RNA 的沉淀。向 RNA 沉淀中加入 1 毫升 75% 乙醇，涡旋混匀样品后，在 4°C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟以沉淀 RNA。再次吸除上清液，并将 RNA 沉淀干燥 5 至 10 分钟，注意确保沉淀不完全干燥。红色，将沉淀物溶解于无核酸酶的水中，并使用分光光度计测定RNA的浓度。使用生物分析仪检测RNA样品的质量和完整性。根据制造商说明书，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。为生成标准曲线，准备一系列已知目的基因表达量较高的样本中原始CD NA的稀释液。根据20 µL反应体积，配制包含两倍浓度Quant Detect cyber green PCR预混液、10倍浓度Microscript通用引物、10倍浓度Microscript引物探针以及无RN a酶水的主混合液，进行实时PCR扩增。包含两对引物，一对用于目的基因，另一对用于本实验中的参考基因RNU6B。将每种cDNA稀释液各2微升加入单独的LightCycler毛细管中，并加入18微升的预混液。使用毛细管适配器进行离心。将毛细管放入基于毛细管的实时定量PCR仪中，运行以下PCR程序：95°C预变性15分钟，随后进行50个循环，每个循环为94°C变性15秒。55摄氏度30秒，以及70摄氏度30秒。选择一个样本作为校准品，并将其归一化目标量设定为1。将所有其他样本中微小RNA的相对表达量与校准品进行比较，以生成扩增曲线。进行PCR反应时，在定量选项卡中使用分子生化Light Cycler软件3.5版本。对反应进行定量，并将数据导出为文本文件。将数据导入REL Quant分析软件以生成定量结果。分别导入目标基因、参考基因和标准曲线数据的文件。指定目标基因和参考基因的校准样本位置，以及各待测样本的位置。数据以不同样本的目标基因与参考基因比值除以校准样本的目标基因与参考基因比值来表示。使用先前为特定微小RNA（micro RNA）和看家基因生成的标准曲线作为参考标准，对外推未知浓度的微小RNA定量数据进行分析。将三个样本作为一组进行分析，并计算三个重复样本的平均浓度和标准偏差。如果三个重复样本中有一个与其余样本不一致，程序将排除该样本。此处显示的是前列腺样本的A-Q-P-C-R分析示例。图中显示，参考基因U six的表达水平在约第20个循环开始进入指数扩增，而目标基因MIR 98的表达则在约第25个循环才出现扩增延迟。本实验的数据以文本文件形式导出，并使用 requ 分析软件进行分析，毛细管中校准品和样本的位置已指定。一旦掌握，该技术在操作正确的情况下可在一天内完成。该技术的可靠性取决于 RNA 的质量。因此，在处理RNA时需要格外小心，因为它非常容易降解。

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