通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测前列腺肿瘤中的微小RNA
2012年5月16日
定量实时聚合酶链式反应（qPCR）是一种快速且灵敏的方法，用于检测肿瘤样本中多种微小RNA（miRNA）分子的表达水平。利用该方法，可从同一cDNA模板扩增、定量并分析数百种不同miRNA分子的表达。
以下实验的总体目标是利用实时定量 PCR 技术，定量分析前列腺癌组织与正常前列腺组织中 micro RNA 分子的表达水平。该目标首先通过从前列腺组织中提取总 RNA 来实现，其中包括 mRNA、micro RNA 以及其他小 RNA。
接下来，将RNA逆转录生成cDNA。然后以cDNA为模板，采用基于SYBR Green的实时PCR技术，对microRNA的表达进行实时扩增与定量。通过定量实时PCR获得结果，显示不同前列腺样本中microRNA的相对表达水平。
该技术相较于其他方法的主要优势在于具有高灵敏度、高准确性、良好的重复性，且快速、成本低。该方法可用于解答癌症生物学领域的关键问题，因为microRNA的表达通常与深度参与癌症进程的基因密切相关。因此，我们可通过qPCR评估microRNA的表达水平，并分析其与临床变量之间的相关性。
这些生物标志物有可能被用作诊断和预后工具。它们不仅有助于我们诊断前列腺癌，还能帮助我们判断哪些前列腺癌具有侵袭性。此外，这些生物标志物还可能具备成为治疗剂的潜力。
该方法不仅能为前列腺肿瘤的发生机制提供见解，还可应用于其他癌症和疾病的研究。在切除术时采集前列腺样本，并利用解剖学标志对样本进行定位。按如下方式对前列腺和精囊进行染色：右侧染成绿色，左侧染成蓝色。
取与直肠表面垂直的组织随机横切中段，将样本冷冻并储存在负80摄氏度。复印切片图像，定位标本切片并将其均分为四个相等部分。咨询病理科医生，根据相应图像确定肿瘤区与正常区。
使用标记区域作为指导，识别用于提取RNA的肿瘤组织。开始操作前，将冷冻的前列腺样本置于干冰上，并参考已划定边界的复印件。切取一小部分前列腺肿瘤组织。
将前列腺肿瘤组织在1毫升三试剂中匀浆。将匀浆后的样品孵育5分钟。在室温下，向样品中加入0.2毫升氯仿，剧烈振荡15秒。
将样品在室温下孵育3分钟，然后在4°C条件下以12,000 × g离心15分钟。将无色的上层水相转移至新的离心管中，并加入0.5毫升异丙醇。室温孵育10分钟后，在4°C条件下以12,000 × g离心10分钟。
小心吸除上清液，避免扰动含有 RNA 的沉淀。向 RNA 沉淀中加入 1 毫升 75% 乙醇，涡旋混匀样品后，在 4°C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟以沉淀 RNA。再次吸除上清液，并将 RNA 沉淀干燥 5 至 10 分钟，注意确保沉淀不完全干燥。
红色，将沉淀物溶解于无核酸酶的水中，并使用分光光度计测定RNA的浓度。使用生物分析仪检测RNA样品的质量和完整性。根据制造商说明书，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。
为生成标准曲线，准备一系列已知目的基因表达量较高的样本中原始CD NA的稀释液。根据20 µL反应体积，配制包含两倍浓度Quant Detect cyber green PCR预混液、10倍浓度Microscript通用引物、10倍浓度Microscript引物探针以及无RN a酶水的主混合液，进行实时PCR扩增。
包含两对引物，一对用于目的基因，另一对用于本实验中的参考基因RNU6B。将每种cDNA稀释液各2微升加入单独的LightCycler毛细管中，并加入18微升的预混液。使用毛细管适配器进行离心。将毛细管放入基于毛细管的实时定量PCR仪中，运行以下PCR程序：95°C预变性15分钟，随后进行50个循环，每个循环为94°C变性15秒。
55摄氏度30秒，以及70摄氏度30秒。选择一个样本作为校准品，并将其归一化目标量设定为1。将所有其他样本中微小RNA的相对表达量与校准品进行比较，以生成扩增曲线。
进行PCR反应时，在定量选项卡中使用分子生化Light Cycler软件3.5版本。对反应进行定量，并将数据导出为文本文件。将数据导入REL Quant分析软件以生成定量结果。
分别导入目标基因、参考基因和标准曲线数据的文件。指定目标基因和参考基因的校准样本位置，以及各待测样本的位置。数据以不同样本的目标基因与参考基因比值除以校准样本的目标基因与参考基因比值来表示。
使用先前为特定微小RNA（micro RNA）和看家基因生成的标准曲线作为参考标准，对外推未知浓度的微小RNA定量数据进行分析。将三个样本作为一组进行分析，并计算三个重复样本的平均浓度和标准偏差。
如果三个重复样本中有一个与其余样本不一致，程序将排除该样本。此处显示的是前列腺样本的A-Q-P-C-R分析示例。图中显示，参考基因U six的表达水平在约第20个循环开始进入指数扩增，而目标基因MIR 98的表达则在约第25个循环才出现扩增延迟。
本实验的数据以文本文件形式导出，并使用 requ 分析软件进行分析，毛细管中校准品和样本的位置已指定。一旦掌握，该技术在操作正确的情况下可在一天内完成。该技术的可靠性取决于 RNA 的质量。
因此，在处理RNA时需要格外小心，因为它非常容易降解。
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概述
本研究采用定量实时聚合酶链式反应（qPCR）检测前列腺癌及正常前列腺组织中微小RNA（miRNA）的表达水平。该方法能够利用同一cDNA模板扩增并定量多种miRNA分子。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 分子生物学
背景
- microRNA 在基因调控中起着至关重要的作用。
- 前列腺癌是一个重要的健康问题。
- 了解 miRNA 的表达可为癌症生物学提供深入见解。
- qPCR 是分析基因表达的常用技术。
研究目的
- 定量分析前列腺癌组织中微小RNA的表达水平。
- 比较癌变与正常前列腺组织之间的miRNA水平。
- 利用qPCR对miRNA进行高灵敏度和快速分析。
使用的方法
- 从前列腺组织中提取总RNA。
- 逆转录生成cDNA。
- 基于Cyber Green的实时PCR扩增。
- 实时定量microRNA表达水平。
主要结果
- 测定了多种microRNA的相对表达水平。
- 观察到癌症组织与正常组织之间miRNA表达的差异。
- 结果表明miRNA作为前列腺癌生物标志物具有潜在应用价值。
- qPCR在同时分析多种miRNA方面表现出有效性。
结论
- qPCR 是研究癌症中 microRNA 表达的有力工具。
- 研究结果可能有助于加深对前列腺癌生物学的理解。
- 需要进一步研究以探索已鉴定出的 miRNA 的功能作用。
常见问题
行业重要性概述
用于前列腺肿瘤中微小RNA检测的定量实时PCR（qPCR）可实现对miRNA表达的高灵敏度、可重复的定量，有助于早期生物标志物的发现和靶点验证。该工作流程满足了肿瘤学研发中对稳健、定量分子读出的需求，促进在发现与转化研究交叉阶段进行基于风险评估的决策。可靠的miRNA定量是癌症研究流程中项目筛选和机制性风险评估的重要依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可对 miRNA 在致癌通路中的作用进行定量研究。
- 通过将 miRNA 表达水平与临床变量相关联，支持功能靶点的验证。
- 通过精确测量调控性 RNA 种类，促进机制层面的风险评估。
- 为早期肿瘤学项目中候选生物标志物的优先排序提供数据支持。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的定量检测方法，用于临床和临床前样本中的miRNA检测。
- 采用参考基因进行标准化归一化处理，确保不同实验间的可重复性。
- 支持miRNA表达谱的可扩展性高通量筛选。
- 支持检测方法向其他组织类型和疾病模型的转移应用。
转化与临床前研究
- 将miRNA定量分析与临床样本分析相结合，推动转化生物标志物的开发。
- 利用存档样本和新鲜样本，确保从发现到临床前验证的连续性。
- 提供定量终点，用于评估候选miRNA与疾病的相关性。
- 通过实现可靠的跨样本比较，降低转化研究风险。
流程与工作流整合
这种基于qPCR的miRNA定量方法贯穿早期发现到转化研究，支持肿瘤学研究流程中的先导物识别和临床前验证。
- Discovery Biology: 定量miRNA分析可阐明调控机制，并支持基于假设的靶点筛选。
- Screening: 标准化的qPCR检测可为化合物或生物标志物筛选提供可重复、定量的检测结果。
- Analytics: 相对定量与标准化处理可提供可用于比较肿瘤与正常样本的有效数据。
- Translational Research: 该方法适用于新鲜及存档的临床样本，支持生物标志物的连续性研究。
- Enterprise Reuse: 检测设计与标准化策略可在不同组织类型和疾病领域间灵活应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高基于miRNA的靶点验证和生物标志物发现的预测可信度。
- 操作价值：提供标准化、可重复且可扩展的分子定量工作流程。
- 战略价值：优化肿瘤学项目中“推进/终止”决策，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：实现对候选生物标志物和治疗靶点的风险调整优先排序。
实施注意事项
- 需要具备RNA操作和qPCR实验设计的专业知识。
- 需要高质量的仪器设备用于RNA提取、cDNA合成和实时PCR。
- 为实现样本间的可比性，必须进行严格的归一化处理并谨慎选择参考基因。
- 经过适当验证后，可适用于多种组织类型及存档的临床样本。
- RNA完整性及样本处理对数据的可靠性和可重复性至关重要。
