Name: 光谱核型多囊肾病的研究在人类和小鼠的染色体异常 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 学习光谱核型分析技术用于研究人类和小鼠多囊肾病中的染色体异常。该方法通过荧光探针标记染色体，可识别数目和结构异常，为理解囊肿形成机制提供关键信息。

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作者感谢Brian Muntean、Shao Lo、Maki Takahashi和Blair Mell提供的技术支持。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号DK080640）以及托莱多大学与ProMedica转化研究激励奖对Surya Nauli博士的资助。

1. 细胞预处理与中期相制备
<ol>
	<li>细胞在含10-15%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37°C、5% CO2培养箱中培养，直至细胞融合度达到70-80%。</li>
	<li>用终浓度为0.05 μg/ml的秋水仙胺溶液处理细胞，作用30-60分钟。</li>
	<li>收集含有悬浮细胞的培养基至50 ml无菌Falcon离心管中。用无菌1×PBS冲洗培养板上的贴壁细胞，加入无菌胰蛋白酶孵育1-2分钟后，将剩余细胞收集至同一离心管中。</li>
	<li>以1000 r.p.m.离心5分钟，吸除上清液，保留约0.5 ml液体，仅通过手指轻弹管底使沉淀松散。</li>
	<li>根据沉淀体积，加入5-10 ml由dH2O配制的0.56% KCl低渗溶液，于37°C孵育30-45分钟。</li>
	<li>每毫升低渗细胞悬液中加入一滴甲醇/冰醋酸（3:1，体积比）固定液，轻轻颠倒混匀。</li>
	<li>以1200 r.p.m.离心5分钟，收集沉淀（参照步骤1.4），在持续轻弹沉淀的同时，逐滴加入5 ml新鲜的甲醇/冰醋酸（3:1，体积比）固定液。此步骤至关重要，可防止中期染色体被包裹在细胞团块中，从而避免影响实验结果。</li>
	<li>再次以1200 r.p.m.离心5分钟，沿管壁加入5-10 ml预冷的甲醇/冰醋酸固定液。此时，如需保存，可将细胞置于密封良好的离心管中，短期保存于-20°C，长期保存（数年）则置于-80°C，以备后续使用。</li>
	<li>用无水乙醇清洗载玻片，然后将载玻片浸入dH2O中约10次，以在玻片表面形成一层水膜。将玻片置于玻璃板上，从距玻片约10英寸高处滴加15-20 μl细胞悬液（来自步骤1.8）。将玻片置于65-70°C水浴中1-2分钟，随后自然干燥。</li>
	<li>在光学显微镜下使用10X和40X干镜观察玻片，确认是否存在中期染色体以及染色体展布是否均匀。检查染色体周围是否存在细胞质残留。若存在细胞质，则需进行玻片预处理（胃蛋白酶消化）；若无细胞质残留且染色体形态良好，则无需预处理。</li>
</ol>
2. 载玻片预处理（胃蛋白酶处理）
<ol>
	<li>在24 mm × 60 mm的显微镜盖玻片上加入120 μl 1:200的RNase溶液（20 mg/ml，溶于2X-SSC），将中期分裂相玻片倒扣于盖玻片上，然后轻轻翻转使玻片正面朝上，在37°C下孵育45分钟。</li>
	<li>小心取下盖玻片，避免划伤玻片，随后在盛有2X-SSC缓冲液的考普林瓶中洗涤，室温下轻轻振荡，每5分钟更换一次缓冲液，共洗涤15分钟。</li>
	<li>将5–15 μl胃蛋白酶储备液（100 mg/ml，溶于dH2O）加入洁净烧杯中，再加入100 ml预热至37°C的0.01M HCl。必须先将胃蛋白酶加入洁净烧杯中，再加入HCl溶液，不可直接将胃蛋白酶加入HCl溶液中，否则无法充分溶解。 将玻片置于含有HCl/胃蛋白酶溶液的考普林瓶中，在37°C下孵育3–5分钟。此步骤极为关键：消化过度会导致染色体结构破坏，消化不足则会残留细胞质，可能导致探针非特异性结合，干扰杂交信号。</li>
	<li>在盛有100 ml 1X-PBS的考普林瓶中室温洗涤玻片，每次5分钟，重复两次。</li>
	<li>在盛有100 ml 1X-PBS/MgCl2的考普林瓶中室温洗涤玻片5分钟（配制方法：将50 ml 1M MgCl2加入950 ml 1X-PBS中）。</li>
	<li>将玻片置于盛有100 ml 1%甲醛的考普林瓶中，室温固定10分钟（配制方法：将1.7 ml 37%甲醛加入100 ml 1X-PBS/MgCl2中）。</li>
	<li>在盛有100 ml 1X-PBS的考普林瓶中洗涤玻片5分钟。</li>
	<li>在光学显微镜下使用40X干镜观察玻片，确认消化程度适当，无细胞质残留，且染色体形态保持良好。使用金刚石笔标记用于杂交的区域。</li>
</ol>
3. 染色体和探针变性与杂交
<ol>
	<li>配制新鲜的变性液（70% 甲酰胺/2X SSC，pH 7.0），置于水浴中的染色缸内预热至 70–80°C。将载玻片放入盛有变性液的染色缸中，在水浴中于 70°C（小鼠染色体）或 80°C（人类染色体）下处理 30 秒至 1.5 分钟。</li>
	<li>立即把载玻片依次浸入冰浴的 70% 乙醇中 3 分钟，随后分别在 80% 和 100% 乙醇中各浸泡 3 分钟，然后空气干燥。检查载玻片上的染色体形态，良好的染色体形态表现为染色深，而非“相位发亮”或晕轮状染色体。</li>
	<li>将 SkyPaint 探针（SKY paint 试剂盒；小瓶#1）在 37°C 下振荡加热 20 分钟，涡旋混匀后短暂以 1000 r.p.m. 离心数秒。</li>
	<li>将探针置于热循环仪中进行两步变性程序：85°C 变性 5 分钟，随后 37°C 保持 60 分钟，以实现标记探针 DNA 的预杂交退火。</li>
	<li>取 10 μL 变性后的探针滴加至杂交区域，覆盖 22 mm × 40 mm 的盖玻片，注意避免产生气泡。用橡胶胶水密封盖玻片边缘，置于湿化孵育盒中 37°C 孵育 48–72 小时。</li>
</ol>
4. 荧光探针检测
<ol>
	<li>小心取下盖玻片，将载玻片放入盛有预热（45°C）洗涤液 I（新配制的含 50% 甲酰胺的 2X SSC 溶液）的考普林瓶中，在 45 r.p.m. 摇动水浴中 45°C 洗涤 5 分钟，重复三次。</li>
	<li>在 45°C 条件下，用洗涤液 II（1X SSC）振荡洗涤载玻片，每次 5 分钟，重复两次。</li>
	<li>在 45°C 条件下，用洗涤液 III（4X SSC/0.1% Tween 20）振荡洗涤载玻片 5 分钟，重复三次。</li>
	<li>加入 80 μl 封闭试剂（SKY paint 试剂盒；瓶号#2），加盖盖玻片，37°C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>取出载玻片，使液体自然沥干。加入 80 μl Cy5 染色试剂（浓缩抗体检测试剂盒 CAD；瓶号#3），加盖盖玻片，37°C 孵育 40 分钟。</li>
	<li>用洗涤液 III 在 45°C 振荡洗涤载玻片，每次 5 分钟，重复三次。</li>
	<li>加入 80 μl Cy5.5 染色试剂（浓缩抗体检测试剂盒 CAD；瓶号#4），加盖盖玻片，37°C 孵育 40 分钟。</li>
	<li>用洗涤液 III 在 45°C 振荡洗涤载玻片，每次 5 分钟，重复三次。</li>
	<li>倾斜载玻片，使液体沥干。加入 20 μl 抗荧光淬灭 DAPI 试剂（SKY paint 试剂盒；瓶号#5），加盖 24 mm × 60 mm 显微镜盖玻片，小心去除可能形成的气泡。载玻片可立即进行成像，或在 4°C 避光保存不超过 1 周后成像。</li>
</ol>
5. 图像采集与分析
<ol>
	<li>通过使用配备60倍油镜、光谱立方体（定制设计的三通带滤光片）、DAPI滤光片以及带有CCD相机的萨尼亚克干涉仪模块的奥林巴斯显微镜观察中期玻片，完成图像采集。</li>
	<li>根据用户手册，使用应用光谱成像公司SKY View软件（版本1.62）进行光谱核型分析。</li>
	<li>图像分析完成后，染色体可呈现为彩色图像（具有特定荧光颜色）、伪彩图像（以颜色进行分类）和倒置DAPI图像（显示特异性条带模式）。</li>
</ol>
6. 典型结果
完整的SKY实验流程通常需要约一周时间（图1），前提是能够提供足够数量的中期细胞用于图像采集与分析。核型分析显示，来自野生型小鼠的细胞具有正常的小鼠核型（40,XY）（图2a）。相比之下，来自Pkd1-/-小鼠（常染色体显性多囊肾病小鼠模型）的细胞则表现出染色体数目显著增加以及明显的结构异常，例如染色体缺失（染色体#8）和易位（染色体#11和19）（图2b）。我们还分析了来自ADPKD患者的血管组织样本。通过简单的染色体计数研究发现，非ADPKD样本及部分ADPKD血管样本具有正常的23对染色体（图2c）。然而总体而言，我们观察到ADPKD样本中存在染色体分离失败现象，导致染色体数目为46对而非正常的23对（图2d）。
<img alt="原位荧光杂交示意图；染色体变性、探针杂交过程。" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. SKY 实验流程图。 SKY 实验流程图展示了从细胞预处理和中期制备到图像采集与分析的完整实验步骤。左侧列出了大致为期一周的时间安排，并逐日列出了每一步的操作流程。
<img alt="染色体比较图谱；野生型、Pkd1-突变型小鼠；非ADPKD、ADPKD人类患者的核型。" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 对永生化小鼠细胞系及新鲜分离的人原代细胞进行光谱核型分析。 在染色体分选前，显示了各条染色体的颜色和倒置DAPI图像。分选后，染色体呈现在“分类”表格中。a) 来自野生型小鼠的中期分裂相SKY图像显示正常核型（40, XY）。b) 来自Pkd1-/-小鼠的中期分裂相SKY图像显示染色体数目异常（68条而非40条），并存在染色体缺失（染色体#8）和染色体易位（染色体#11和#19）等染色体异常。c) 来自非ADPKD患者血管组织的中期分裂相SKY图像显示正常核型（46, XX）。d) 来自ADPKD患者血管组织的中期分裂相SKY图像显示异常核型（92, XXXX）。部分数据此前已有报道，经许可重复使用14。

<ol><li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li>
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<li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li>
<li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

光谱核型分析（Spectral Karyotyping, SKY）是一种用于研究基因组和染色体组成的细胞遗传学技术。该技术利用染色体涂染探针，并通过萨尼亚克干涉仪检测这些探针。完整的SKY过程通常需要约一周时间，涉及多个关键步骤（图1）。SKY采用一种标准操作流程，最初由Padilla-Nash 等3描述。此后，该流程已被包括我们实验室在内的多个细胞遗传学实验室所改进和应用。
在该实验方案的关键步骤中，获得高质量的中期相制备样本对于成功进行光谱核型分析（SKY）极为重要。例如，如果染色体附着过多细胞质，或载玻片存放时间过久，都可能影响图像质量。如我们在视频片段中所见，使用高分辨率的微分干涉差显微技术可轻松识别细胞质残留情况。此外，进行SKY分析的前提是必须存在处于活跃分裂状态的细胞；这一问题可通过延长秋水仙胺处理时间或向细胞中添加其他生长因子来解决。SKY分析的整体成功率在很大程度上取决于操作人员的技术水平和实践经验。
SKY 提供了一种强大且可靠的...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30088-03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>秋水仙胺（Colcemid）</td><td>Roche Group</td><td>10 295 892 001</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S77375-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30256-01</td><td></td></tr><tr><td>SKY 荧光探针试剂盒（人源）</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>SKY000028</td><td></td></tr><tr><td>SKY 荧光探针试剂盒（小鼠源）</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>SKY000030</td><td></td></tr><tr><td>浓缩型抗体检测试剂盒</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>SKY000033</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Roche Group</td><td>10 109 169 001</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>63069-500ML</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>2106-02</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Promega Corp.</td><td>V4261</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Fluka</td><td>47671</td><td>使用前新鲜配制</td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549</td><td></td></tr><tr><td>24×60 mm 盖玻片</td><td>VWR international</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>橡胶胶水</td><td>Elmer&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>杂交/湿化室/托盘</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>底部放置湿润的纸巾</td></tr><tr><td>PCR仪（热循环仪）</td><td>Eppendorf</td><td>Epgradient S</td><td></td></tr><tr><td>摇床/轨道式摇床</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振荡/水浴锅</td><td>Precision Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SKY滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraCube</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置细胞培养显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX70</td><td>60X油镜</td></tr></tbody></table>

多囊肾病患者及小鼠染色体异常研究的光谱核型分析

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

传统方法通过分析特定物种每条染色体独特的带型模式来识别和分类单个染色体1, 2。然而，这种经典的带型技术在识别复杂的染色体畸变（如与癌症相关的畸变）时并不可靠。为了克服带型技术的局限性，引入了光谱核型分析（Spectral Karyotyping, SKY），以提供更为可靠的染色体异常信息。
SKY 是一种多色荧光技术 原位 荧光原位杂交（FISH）技术结合光谱显微镜检测中期染色体 3, 4SKY 已被证实是分析多种遗传病和恶性肿瘤相关染色体异常的有力工具 5, 6SKY 技术利用通过 PCR 从简并寡核苷酸引物制备的多色荧光标记 DNA 探针，从而使每条染色体呈现出独特的光谱颜色 原位 使用不同荧光染料（罗丹明、德克萨斯红、Cy5、FITC 和 Cy5.5）标记的探针进行杂交。SKY 所用的探针包含多达 55 种染色体特异性探针 7-10.
SKY 技术的操作流程包括多个步骤（图1）。SKY 需要获取来自正常或病变组织或血液中具有高有丝分裂指数的细胞。将从新鲜分离的原代细胞或细胞系中获得的单个细胞的染色体铺展在玻璃载玻片上。该染色体铺展使用针对每条染色体特异的荧光染料组合进行标记。为了探针检测和图像采集，光谱成像系统由萨尼亚克干涉仪和 CCD 相机组成。该系统可测量样本发出的可见光光谱，并获取单个染色体的光谱图像。用于分析所捕获图像结果的软件 HiSKY，能够便捷地识别染色体异常。最终结果是一幅中期分裂相图像和核型分类图像，其中每对染色体均呈现独特的颜色（图2）。这使得染色体身份鉴定和易位检测变得简便直观。欲了解更多信息，请访问 Applied Spectral Imaging 官方网站（<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>）。
最近，SKY技术被用于鉴定常染色体显性多囊肾病（ADPKD）患者及小鼠模型中的染色体分离缺陷和染色体异常。ADPKD是一种由初级纤毛功能障碍引起的遗传性疾病11-13。利用该技术，我们证实了ADPKD患者和小鼠模型中存在染色体异常分离及染色体缺陷14。进一步使用SKY进行的分析不仅使我们能够确定染色体的数量和身份，还能准确检测极为复杂的染色体畸变，例如染色体缺失和易位（图2）。

光谱核型分析（SKY）是一种先进的细胞遗传学技术，用于鉴定基因组和染色体异常。该技术利用染色体涂染探针，能够对所有染色体进行分类。SKY 还可用于识别多种疾病（包括多囊肾病）的小鼠和人类模型中的复杂染色体异常及分离缺陷。

识别和分类单条染色体的传统方法依赖于特定物种每条染色体所具有的独特带型……

本实验的目的是利用染色探针标记染色体，以鉴定多囊肾病小鼠和人类样本中的染色体异常及分离缺陷。首先从人或小鼠体内获取细胞，并用smid处理，随后固定细胞并在载玻片上制备中期染色体展片。接着对载玻片进行预处理，以去除可能干扰杂交反应的多余RNA和细胞质成分。这分别通过RNAs和胃蛋白酶消化来完成。然后进行染色体和探针的变性，接着通过杂交标记染色体。最后一步是使用荧光染料检测探针。最终，可通过荧光、显微镜观察以及Skyview软件的图像采集与分析，获得显示染色体数目和结构异常的结果。该技术相较于传统的G显带弯曲技术等现有方法的主要优势在于，能够提供有关复杂染色体畸变的额外信息，例如染色体易位和经典弯曲技术无法鉴定的复杂染色体重排。该方法有助于解答多囊肾病领域中的关键科学问题，例如囊性肾脏形成的机制。演示该实验操作的是 Wiam Abu 博士，她将指导我们实验室一位优秀的高级博士后。首先，在含 10% 至 15% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中，于 37°C 及 5% 二氧化碳条件下培养内皮细胞，直至细胞融合度达到 70% 至 80%。随后，用 Cole 溶液在 37°C 下处理细胞 30 至 60 分钟，终浓度为 0.05 毫克/毫升。收集细胞前，先将含有任何悬浮细胞的培养基收集至 50 毫升无菌离心管中。在培养皿中的细胞与无菌胰蛋白酶孵育1至2分钟后，用无菌的1倍PBS冲洗细胞，收集并收获剩余细胞至同一离心管中。在1000转/分钟条件下离心5分钟使细胞沉淀后，吸除管中大部分上清液，保留约0.5毫升液体于沉淀上方。通过轻弹离心管使细胞沉淀松散。 接下来，根据沉淀物的大小，加入5至10毫升由0.56%氯化钾溶于蒸馏水配制的高渗溶液，并将悬浮液在37摄氏度下孵育30至45分钟。孵育结束后，使用小型1毫升移液器，每1毫升高渗细胞悬浮液中加入一滴冰冻固定液。然后轻轻倒置离心管以混匀，再将细胞在1,200转/分钟的转速下离心5分钟。同前吸除上清液。接着，在轻轻敲击管底沉淀的同时，缓慢加入一毫升新鲜固定液。然后，沿管壁轻轻加入另外四毫升固定液。此步骤对于确保中期展片不会被困在细胞团块中至关重要。重复离心步骤并吸除上清液后，沿管壁缓慢用移液管加入5至10毫升固定剂。在此阶段，细胞可在密封且盖紧的管中于-20摄氏度短期保存，或于-80摄氏度长期保存，直至准备继续后续操作。当准备就绪后，检查细胞制备中处于中期分裂相的染色体数目。用无水乙醇清洗载玻片，然后将载玻片在蒸馏水中浸入约10次，以在载玻片表面形成一层水膜。将载玻片置于玻璃板上，从距载玻片约10英寸的高度滴加15至20微升的细胞悬液。将载玻片置于65至70摄氏度的水浴中1至2分钟，随后取出晾干。使用10倍和40倍干镜在光学显微镜下检查载玻片，确保存在中期染色体，并且染色体分散均匀。检查染色体周围的细胞质。若存在细胞质（如此处所示），则进行载玻片预处理。若无细胞质且染色体形态良好，则无需进行载玻片预处理，直接使用新配制的、体积为120 µL的200倍稀释液（浓度为20 mg/mL）RNA溶液，溶于两倍SSC溶液中，并覆盖24 mm × 60 mm的盖玻片。将中期玻片倒扣在盖玻片上，然后轻柔地将中期玻片翻转至正面朝上。将玻片置于湿化 chamber 中，在37摄氏度下孵育45分钟。孵育时间结束后，小心取下盖玻片，避免刮伤载玻片，并在耦合罐中用 SSC 缓冲液洗涤两次，每次五分钟，共洗涤三次，期间持续振荡。与此同时，将 5 至 15 微升浓度为 100 毫克/毫升的 pepin 溶于蒸馏水中，加入洁净的烧杯中，然后加入 100 毫升预热至 37 摄氏度的 0.01 摩尔盐酸。重要的是必须先将 pepin 加入洁净的烧杯中，否则无法溶解。将该溶液转移至考普兰罐中。消化后，在37摄氏度下将玻片放入偶联罐中孵育，时间不得超过三到五分钟。随后在含有1倍XPBS的考平罐中洗涤玻片两次，每次五分钟，期间持续振荡。随后在含有氯化镁的 PBS 中，于 Copin 瓶中洗涤 5 分钟。然后在含有 1% 甲醛的 Copin 瓶中孵育 10 分钟，再于含有 1×PBS 的 Cochim 瓶中进行最后一步洗涤，持续 5 分钟。接着将装有切片的 Cochim 瓶依次置于 70%、80% 和 100% 的乙醇系列中脱水，每一步 2 分钟，然后空气干燥。使用40倍干镜在光学显微镜下观察玻片，确保玻片消化充分、无细胞质残留，并且染色体形态保存良好。最后，使用金刚石笔选择杂交区域。新鲜配制变性溶液后，将其放入染色缸中，并在水浴中预热至70摄氏度。然后将载玻片放入盛有预热变性液的科钦瓶中，置于70摄氏度水浴中处理30秒至1分钟。孵育后立即将载玻片转移至冰冻的70%乙醇中浸泡3分钟，随后依次在80%和100%乙醇中各浸泡3分钟，然后空气干燥。观察载玻片上的染色体形态，应呈现深色染色体，无透光或发亮现象。表示染色体或形态良好。用暖色调描绘天空。在37摄氏度下振荡孵育20分钟。然后涡旋混匀，并在1000转/分钟下短暂离心数秒。将探针在85摄氏度下变性5分钟，随后在37摄氏度下孵育数秒。将10 µL变性后的探针加至杂交区域，用22毫米×40毫米的盖玻片覆盖，孵育1小时。确保不产生气泡，用橡胶胶水密封盖玻片边缘，然后在37摄氏度的湿化孵育盒中孵育48至72小时。小心移除盖玻片，将载玻片放入盛有新鲜配制且预热至45摄氏度洗涤液的连接罐中。在45摄氏度、每分钟45转的振荡水浴中洗涤5分钟，重复三次。然后在45°C下，用洗涤液二振荡洗涤载玻片两次，每次5分钟，接着在45°C的洗涤液三中振荡洗涤5分钟。随后，加入80 µL封闭试剂。然后盖上盖玻片，并在37°C孵育30分钟。移除盖玻片，让液体自然流尽。加入80 µL的sci-fi染色试剂。盖上盖玻片，在37°C孵育40分钟。孵育结束后，用45°C的洗涤液振荡洗涤玻片三次，每次5分钟。接下来，加入 80 µL PS 5.5 染色试剂。盖上盖玻片，置于 37 °C 培养箱中孵育 40 分钟。孵育结束后，用洗涤液三如前所述清洗三次。最后，倾斜载玻片，使液体流出。 加入20微升Antifa dappy试剂，放置24毫米×60毫米的显微镜盖玻片，小心去除可能形成的气泡。制备好的载玻片可立即进行成像，或在4°C避光条件下保存不超过一周。此图为使用配备60倍油镜的Olympus显微镜拍摄的野生型小鼠正常中期分裂相的荧光图像。一种定制设计的三通道带通滤光片，称为光谱立方体、dappy滤光片，以及带有CCD相机的sac干涉仪模块。光谱核型分析使用SkyView软件进行。左上方面板显示标记的中期分裂相，右上方面板显示该分裂相的明场图像。下方面板显示了使用 skyview 软件按升序排列的染色体。这张来自 pkd1 纯合敲除小鼠有丝分裂中期展片的天空图显示了异常的染色体数目，存在 68 条染色体而非正常的 40 条。此外还可观察到染色体异常，例如第八号染色体的缺失，以及染色体易位，如第五号与第十六号染色体之间的易位，以及第十一号与第十九号染色体之间的易位。这幅来自非ADPKD患者血管组织的人类染色体中期分裂相的图像显示了正常的女性核型，包含44条常染色体和两条XXX染色体。这幅最终的图像显示了来自ADPKD患者血管组织的中期分裂相，其核型异常，包含88条常染色体和四条XXXX性染色体。一位主控者。如果操作得当，该技术可在五天内完成。

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