逆行荧光染料标记允许有针对性的外单细胞记录技术鉴定神经元在体内
June 26th, 2013
逆行运输的荧光染料标记的基于解剖突起的神经元的一个子种群。可以在视觉对象标记的轴突在体内，允许确定的轴突外记录。这种技术有利于记录神经元不能被标记通过遗传操作或难以分离使用'盲人'在体内办法。
该程序的总体目标是记录非遗传模型系统中已识别的神经元群的体内单单位反应。这是通过首先进行开颅手术以暴露感兴趣的大脑区域来实现的。第二步是使用钨丝将荧光染料放置在目标神经元投射的区域。
接下来，染料逆行转运，导致投射神经元的选择性标记。最后一步是从单个投射神经元的标记轴突记录。最终，单个单位细胞外记录用于显示完整回路中的中枢感觉神经元如何响应 evo 中的感觉刺激。
这种方法可以帮助回答有关神经回路如何检测突触输入时间的亚毫秒级差异的关键问题。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够靶向单个神经元甚至轴突和不可遗传可及的系统。每周的电鱼都使用电信号进行交流和导航。
他们使用突触输入时间的亚毫秒级差异来区分来自不同鱼的信号。我们询问了其电感应回路中假定的时间比较神经元如何能够检测到如此小的时间差异。但这种技术也可以应用于其他系统，例如视觉和听觉感觉通路。
由于周围组织中的小尺寸、致密的 miring 和覆盖大部分细胞腹部的突触前末梢，在全细胞记录期间细胞内染料注射，因此特别难以从该细胞中流出。体外标记单个细胞以引导来自该轴突的靶向记录。同样，细胞外染料注射后的逆行转运提供了一种选择性标记浅表脑区投射神经元的方法。
这可用于为体内单单元记录提供视觉指导。为了制备 D 编码针，首先电解研磨直径为 160 微米的钨丝，最终针尖直径为 5 至 50 微米。然后在实验前一天晚上，用 10， 000 分子量葡聚糖共轭 Alexa 地板染料的两毫摩尔溶液对针尖进行编码，以诱导全身麻醉。
将鱼放入含有每升 300 毫克 MS 2 22 溶液的水箱水中，以每毫升 3 毫克的剂量将 100 微升连枷注射到身体背侧肌肉组织中，使鱼固定并电静音。接下来，用水箱水填充记录室，并将鱼腹侧朝下放在记录室中央的平台上。然后将移液器吸头放入口中，以每分钟 1 至 2 mL 的浓度以 100 毫克/升的浓度输送充气 MS 2 22 溶液。
然后，用固定杆稳定鱼，并在身体两侧打蜡。通过检查眼血管中的连续血流和正常的体色来监测鱼的健康状况。然后沿垂直轴旋转平台。
调整平台的一端，使鱼头背表面的一侧露出水面，而鱼身体的其余部分保持浸没在水中。将一小块 Kim 湿巾放在皮肤的任何非浸没部分以防止干燥。在此过程中，使用棉签将 0.4% 利多卡因涂抹在头部的裸露表面。
然后用手术刀刀片切下一块大约 3 毫米 x 5 毫米的矩形皮肤组织，以获得一条 6.2 厘米的鱼。矩形的外侧边缘应与眼睛的中心对齐。矩形的前边缘应位于眼睛的后方，矩形的内侧边缘应位于中线的外侧。
随后，使用一对镊子去除矩形。向前再切一个 2.5 毫米见方的头骨，露出头骨。使用手术刀刀片刮掉任何多余的组织，完全清除颅骨的暴露表面。
然后用 Kim 湿巾和强制通风完全擦干表面。接下来，用强力胶将金属柱粘到前内侧暴露的颅骨区域。等到胶水完全干燥。
使用直径为 0.5 毫米的球磨机硬质合金尖端的牙钻在 6.2 厘米长的鱼的头骨上画一个大约 2 毫米 x 4 毫米的矩形。之后，用手术刀和镊子切开矩形的周边。然后剥掉头骨。
要暴露大脑，请用弹簧剪刀或针剪掉有色素的硬脑膜和透明的软脑膜。然后用一对镊子去除切割部分，露出前外侧核和后外侧核。现在，将带有先前制备的 D 涂层针的纵器放置在包含目标轴突的目标区域上方。
在我们的例子中，后外侧核将针头迅速插入组织约 25 微米。染料扩散 15 到 30 秒后，缩回针头。根据需要使用额外的新鲜针头重复。
将每个染料放置在不同的位置，以便染料分布在整个目标区域。然后用 Hickman 林格溶液冲洗空腔中多余的染料，并等待至少两个小时进行染料吸收和运输。为了可视化感兴趣的轴突，将带有鱼的记录室放在正置固定载物台落射荧光显微镜的物镜下方。
将呼吸溶液切换到新鲜的罐水中并保持相同的流速。然后将地线的一端放入裸露的脑腔中，将另一端连接到记录头载物台的地面。接下来，在尾巴底部旁边放置一对记录电极。
然后将电极连接到差分放大器和记录设备。为了监测器官放电命令或 EODC，准备一张以低倍率观察的大脑区域的缩放草图，包括主要血管作为标志，以确定标记轴突的确切位置。要首先确认 D 的位置，请使用明场照明查看整个组织以进行定位。
然后用荧光照明观察它。后外侧核应显示弥漫性标记。之后，在高倍率下，定位前外侧核，以血管为标志。
用荧光灯照亮它，同时使用 1 毫米外径 0.58 毫米内径在表面附近寻找标记的轴突。Bo 硅酸盐毛细管玻璃带细丝。拉动一个 5 毫米长的窄柄，尖端直径约为 1 至 2.4 微米的记录电极。
用过滤后的 Hickman 林格溶液填充电极。最终尖端电阻应在 16 到 155 兆欧姆的范围内。将电极放在带有压力端口的电极支架中。
将其连接到安装在机械手上的头部平台。然后将头级连接到放大器。未显示的模数采集设备将放大器连接到计算机。
之后，对电极线施加 30 毫巴的正压。将电极从组织表面缓慢推进到轴突。由于电极靠近轴突，当电极靠近轴突时，正压应引起轴突轻微但明显的移动。
记录测试刺激呈现期间的活动。尽管电伪影确认了正确的记录和刺激，但不应有动作电位。释放电极中的向外压力并重复刺激和记录。
然后轻轻抽吸，使轴突移动到电极中。重复刺激并再次记录。现在您应该看到一些响应刺激的动作电位。
一旦动作电位可见，就关闭压力线。完成所有所需的记录后，将水箱水以 100 毫克/升的 MS 2 22 切换回呼吸溶液，以确保鱼被完全麻醉。在对鱼实施安乐死前至少 10 分钟内不应检测到 EODC。
这里有五个样本轨迹显示了 0.1 毫秒 6 毫伏/厘米、单相对侧正横向方脉冲刺激引起的动作电位，这里有一个栅格图显示了同一单元在 0 次刺激和每厘米 6 毫伏刺激的 75 毫秒记录窗口的 20 次重复期间的峰值时间。持续时间范围列在右侧。这里显示的是刺激持续时间调整曲线，该曲线将响应量化为每次刺激重复的峰值。
一旦掌握，如果作得当，该技术中显示的手术和染料注射可以在一小时内完成，并且可以在染料注射后两到三个小时开始记录。在尝试此程序时，重要的是要记住仔细监测实验动物的健康状况 遵循此程序。可以执行其他方法，如双光子成像，以便从更深的大脑结构中的神经元进行记录。
观看此视频后，您应该对如何标记和记录来自已识别神经元群的单个单元响应有很好的了解。
概述
本文介绍了一种使用荧光染料逆行运输记录体内已识别神经元的单个单元响应的方法。这种技术允许选择性地标记投射神经元，从而在非遗传模型系统中进行针对性的细胞外记录。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 神经回路
背景
- 从特定神经元记录对理解神经回路至关重要。
- 传统方法可能无法有效地在非遗传系统中标记神经元。
- 荧光染料可用于基于解剖投射来标记神经元。
- 这种方法对研究电鱼中的感觉神经元特别有用。
研究目的
- 开发一种用于体内记录已识别神经元的技术。
- 研究感觉神经元如何响应刺激。
- 增强在复杂组织中针对单个神经元的能力。
使用的方法
- 开颅以暴露感兴趣的脑区域。
- 向目标区域注射荧光染料以标记投射神经元。
- 使用钨丝进行精确的染料放置。
- 从标记的轴突进行细胞外记录以评估神经元响应。
主要结果
- 成功使用染料逆行运输标记投射神经元。
- 能够从已识别的神经元记录单个单元响应。
- 展示了该技术在研究感觉回路中的时序差异方面的适用性。
- 为体内针对性记录提供了视觉指导。
结论
- 该方法允许在非遗传系统中对特定神经元进行针对性记录。
- 这种方法可以应用于电鱼之外的各种感觉通路。
- 在复杂的组织环境中，它相对于传统方法具有显著优势。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables targeted single-unit recordings from identified neurons in non-genetic model systems, addressing a key challenge in neuroscience research where genetic tools are unavailable. By using retrograde fluorescent labeling based on axonal projections, researchers can pre-visualize and selectively record from specific neuronal populations, improving the reliability and interpretability of electrophysiological data. This capability supports mechanistic de-risking in target validation by linking neuronal identity to function in intact circuits, which is valuable for preclinical neuroscience and translational biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking neuronal identity to electrophysiological function in vivo.
- Operational Value: Provides a visual cue for targeted recordings, reducing blind sampling and increasing data quality in heterogeneous tissues.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking by confirming that recorded signals originate from anatomically defined projection neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates a standardized, reproducible system for preparing labeled neurons for downstream electrophysiological assessment.
- Quantitative Output: Enables measurement of single-unit responses to sensory stimuli, providing actionable data for compound screening.
- Platform Reuse: The retrograde labeling approach can be adapted across brain regions and model systems, supporting scalable use in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to sensory processing circuits, offering insight into neural mechanisms of stimulus detection and timing discrimination.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling consistent identification of neuronal targets across experimental sessions.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces false positives in target validation by ensuring recordings are obtained from the intended neuronal population.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven interrogation of neural circuits before moving to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing researchers to record from neurons defined by their projection patterns, clarifying functional roles in sensory processing.
- Screening: Generates reproducible, quantifiable electrophysiological readouts that can be used to assess neuronal responses under controlled conditions.
- Analytics: Produces spike timing and duration tuning curves that enable quantitative comparison of neuronal responses across stimuli or conditions.
- Translational Research: Supports continuity from circuit-level discovery to preclinical models by providing a reliable method to identify and re-target specific neurons.
- Enterprise Reuse: The core technique of retrograde dye labeling is adaptable to various brain regions and species, making it a reusable capability across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through anatomically precise targeting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of single-unit recordings via pre-visualization of target neurons.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in early discovery by increasing the likelihood that observed phenotypes are linked to the intended neuronal target.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated neuronal identity and function in intact circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, microsurgery, and in vivo electrophysiology.
- Depends on access to fluorescence microscopy, micromanipulators, and extracellular recording equipment.
- Necessitates standardization of dye injection parameters and transport times across users and labs.
- Must account for variability in axonal projection patterns when applying the method to new model systems or brain regions.
- Practical limitations include dependence on successful retrograde transport, which may vary by tissue health and dye properties.
