Name: 逆行荧光染料标记允许有针对性的外单细胞记录技术鉴定神经元在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 学习利用逆行荧光染料标记技术对非遗传模型系统中的特定神经元进行单细胞外记录。该方法通过荧光染料的逆行运输选择性标记投射神经元，实现体内靶向记录，适用于研究电鱼感觉神经元及视觉、听觉等感觉通路。

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本研究由美国国家科学基金会（NSF IOS-1050701 至 B.A.C.）、美国国立卫生研究院（NIH NS54174 至 S.M.，F30DC0111907 至 A.M.L-W.）、上山纪念基金会以及日本促进科学协会（G2205 至 T.K.）提供资金支持。我们感谢 Julian Meeks 在细胞外轴突记录研究方面提供的支持与指导。我们感谢 Carl Hopkins 提供的记录室原型装置。

<ol><li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control%3A+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li>
<li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li>
<li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099(2009).</li>
<li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li>
<li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li>
<li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dogged+pursuit+of+coincidence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li>
<li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish%3A+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li>
<li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+European+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li>
<li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li>
<li>Hitschfeld, ÉM., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR.+J%22%5BJournal%5D)">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li>
<li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li>
<li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%3A+Neuroethol+Sens+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li>
<li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li>
<li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain%3A+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li>
<li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li>
<li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li>
<li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li>
<li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li>
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<li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
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<li>Gahtan, E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+lesioning+of+large+numbers+of+identified+vertebrate+neurons%3A+applications+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).</li>
<li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na%2B+current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li>
<li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li>
<li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li>
<li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

一旦掌握，该技术可实现对多种模式系统中已鉴定的神经元（包括单个轴突）进行体内记录。此外，该技术还能可靠地记录那些因具有独特解剖特征而难以采用传统体内记录方法的神经元的放电输出。我们已利用该技术对骨舌鱼目弱电鱼ELa区的“小细胞”进行了记录。此前，由于记录条件困难，研究“小细胞”调谐特性的尝试均未成功11, 14。类似的解剖特征也阻碍了从多种脊椎动物听觉和电感受神经元中获取单细胞单位记录8-10。为克服本系统中的这些挑战，我们利用了“小细胞”是ELa中唯一投射至ELp的细胞这一特性。因此，在ELp中施加染料后通过逆行运输，可使ELa中仅“小细胞”的胞体和轴突被标记。轴突的荧光标记使得电极能够精确定位于标记的轴突附近，从而在胞体难以接近的情况下仍可实现对已鉴定细胞的单细胞单位记录。我们曾尝试进行胞体记录，但未获成功，可能是因为胞体周围存在大量包裹性突触11,17。然而，胞体的标记清晰可见，提示该技术有望用于其他细胞类型和其他神经环路中的胞体记录。通过体内逆行运输对神经元进行荧光标记，此前已被用于指导体外靶向记录19-21。类似技术也曾用于斑马鱼脊髓运动神经元的靶向体内记录22。我们的工作代表了该方法的创新性拓展，即标记与记录均在脑内体内完成。本方法表明，利用逆行示踪剂对中枢神经系统区域进行体内标记，可进一步推广至其他具有类似选择性投射神经元的完整神经环路研究。例如，在哺乳动物听觉处理过程中，下丘（IC）是来自多个菱脑结构输入的重要中继中心23。向IC注射染料可选择性地标记这些核团中的投射神经元。上丘（SC）在视觉处理中具有类似功能24。脊髓制备特别适合该技术，因为脊髓易于接近，染料注射部位可远离记录位点，并且该方法可与细胞内记录及特定神经元的染料填充相结合，以获取更详细的解剖学信息25。最后，通路示踪是中枢神经系统中广泛使用的一种成熟技术，用于绘制复杂的神经环路26。我们的方法可用于为这类研究增加功能信息，正如钙敏感指示剂在猫视觉皮层研究中的应用所示27。
该手术技术成熟、可靠，常用于盲法体内记录16，必须在尽量减少出血且不损伤脑表面的前提下完成，以确保动物和组织的存活。经过练习，手术和染料应用可在30至45分钟内完成。我们在67%的样本中成功标记了“小细胞”轴突。大多数样本中仅可见1至2条标记轴突，但部分样本中多达8条。在119次尝试标记的神经元中，我们从分布在12个样本中的26个神经元获得了单神经元记录（表2）。因此，在含有标记轴突的样本中，有41%获得了数据，总体成功率为28%。
染料应用的关键在于标记深度。若钨丝插入过浅，染料会被冲洗掉；但若穿透过深，则标记的轴突将无法被观察到，从而难以进行靶向定位。此外，细胞必须受到一定程度的机械损伤，染料才能被充分摄取25, 28。然而，损伤过大会导致细胞死亡。我们曾尝试使用其他染料和其他方法进行标记（表2），包括通过向ELa注射染料进行顺行标记，并在ELp记录标记轴突的活动（表3）。我们推测顺行标记未能成功的原因在于，只有胞体受损的细胞才能被标记，而这些细胞已失去反应能力。此外，突触前终末可能也受到了干扰。相比之下，逆行标记可最大限度地减少上述两个问题。染料的应用量和位置可根据所研究的具体神经环路进行调整。当染料浓度最高时，标记效果最佳，我们通过使用包被钨丝实现了这一浓度。然而，在标记具有深部投射的轴突时，随着钨针的推进，染料可能会脱落。在这种情况下，压力注射更为合适。染料的摄取和运输速度较快，在本实验体系中，注射后2小时即可观察到标记的轴突，部分轴突甚至在注射后6小时才显现。因此，标记与记录可在同一天内完成，避免了与存活手术相关的技术难题。具体所需时间将根据染料运输的距离因实验而异。
另一个关键方面是电极的放置。必须在标记的轴突附近进入组织，以防止电极尖端堵塞。对于ELa等致密组织，记录电极应具有细长的探针，以最大限度减少周围组织的额外移动。如果首次尝试未能成功记录，应更换新的电极重复操作，直至获得记录或组织受损导致轴突不再可见为止。然而，也必须尽快将电极放置到轴突附近，以尽量减少荧光暴露时间，因为长时间暴露可能引起光毒性、荧光淬灭，并可能影响细胞的生理特性29-31。
一旦轴突的一段成功吸入记录电极，即可持续记录数小时。如果记录单位在不到1小时内频繁丢失，可考虑制作更小的电极尖端，以防止轴突滑出。另一方面，电极尖端过小可能导致堵塞、信噪比降低或对轴突造成损伤。若动作电位幅度持续下降，且通过进一步施加负压后信号重新出现，则提示电极尖端可能过大。过大的负压可能对轴突造成不可逆的损伤。一种解决方案是允许气路存在轻微泄漏，使压力缓慢恢复至零。快速平衡压力会导致短暂的相对向外“推力”，可能将轴突推出电极。
尽管该技术在获取特定投射神经元的靶向记录方面具有显著优势，但其无法用于区分局部中间神经元，因为染料会在注射部位被所有类型的细胞摄取。理论上，使用多种荧光染料并结合不同的注射位点，可能使该方法得到扩展。例如，通过比较单标记与双标记结果，可在对神经回路中两个位点进行双重注射后，区分中间神经元与投射神经元。32同样，逆行示踪剂可与其他先进成像技术结合使用，例如双光子成像，近期在斑胸草雀的高级发声中枢（HVc）研究中已实现这一应用。32此外，使用落射荧光显微镜时，记录区域仅限于组织表层附近，因为我们在组织前30 μm范围内仅能分辨出1 μm的结构。然而，通过采用其他显微技术（如双光子显微镜），可进一步扩展成像深度。33 或物镜耦合平面照明显微镜34总体而言，该技术代表了神经环路研究领域的一项重要进展 体内 因为它可用于在多种模式系统中记录单个神经元的活动，包括那些相对难以接近的神经回路。

<table><tbody><tr><td>三卡因甲磺酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>加拉明三碘化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8134</td><td>Flaxedil</td></tr><tr><td>盐酸利多卡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hickman&amp;rsquo;s Ringer 溶液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 (0.29 g/l), MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0.12 g/l), NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (0.084 g/l), NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0.06 g/l)</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson 或 Rainin</td><td>Minipulse 3 型号 312；RP-1</td><td>10.0 &amp;plusmn; 1.0 rpm，或使用带流量计的重力供液系统</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Super Glue Corporation</td><td>SGH2</td><td>2g 管装</td></tr><tr><td>Omni Drill 35</td><td>World Precision Instruments</td><td>503-598</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>球磨碳化钻头 #1/4</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860</td><td>0.19 直径（钻头直径 = 0.48 mm）</td></tr><tr><td>低温电凝套件</td><td>World Precision Instruments</td><td>500391</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手动显微操作器</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡聚糖偶联 Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>D-22912</td><td>2 mM 浓度；10,000 MW。染料波长的选择应与显微镜滤光片设置相匹配</td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>E600 FN</td><td>配备远程调焦附件有助于精细对焦；TRITC 滤光片，或选择合适的滤光片以匹配不同染料波长的焦平面</td></tr><tr><td>低倍物镜</td><td>Nikon</td><td>93182</td><td>CFI Plan Achromat 系列，4X N.A. 0.1，工作距离 30 mm</td></tr><tr><td>高倍物镜</td><td>Nikon</td><td>93148</td><td>CFI Fluor 系列，40X WI N.A. 0.8，工作距离 2.0 mm</td></tr><tr><td>白光光源</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Model 190</td><td>光纤照明器</td></tr><tr><td>荧光光源</td><td>Lumen Dynamics</td><td>X-Cite 120Q</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>低照度相机</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap ES</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>数字压力计</td><td>Omega Engineering</td><td>HHP-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电动显微操作器</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>数据采集系统</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>隔离式脉冲刺激器</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>本应用的程序设置：加热：斜坡 +1，拉力：&amp;rsquo;0&amp;rsquo;，速度：60，时间：90，盒式灯丝</td></tr><tr><td>移液管玻璃管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>含灯丝的硼硅酸盐毛细玻璃管（外径 1 mm，内径 0.58 mm）</td></tr></tbody></table>

逆行荧光标记可实现对已鉴定神经元的靶向细胞外单单位记录 体内

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

本方法的总体目标是从已确定的神经元群体中记录单个神经元的电生理反应。体内单个神经元的电生理记录对于理解神经回路在自然条件下的功能至关重要。传统上，这些记录是“盲法”进行的，即在记录开始时无法确定所记录细胞的身份。细胞身份后续可通过细胞内1、紧贴细胞2或松散膜片3电泳注入染料来确定，但这些方法无法在功能异质性细胞类型共存的脑区中预先靶向特定神经元。荧光蛋白可被特异性地表达于特定类型的细胞中，从而实现视觉引导下的单细胞电生理记录4-6。然而，许多模型系统尚不具备可用的遗传工具。即使在遗传操作可行的模型系统中，所需的启动子可能未知，或基因上均一的神经元可能具有不同的投射模式。类似地，病毒载体已被用于标记特定的投射神经元亚群7，但该方法的应用受限于毒性以及缺乏跨突触特异性。因此，亟需开发其他技术，以实现对已识别单个神经元进行体内电生理记录前的特异性可视化。在记录条件具有挑战性的情况下，目标神经元的预先可视化尤为有用，因为在这些情况下，传统的单细胞记录往往难以实施8-11。本文所描述的新技术利用钨针将荧光染料施加于神经通路下游区域，通过逆行运输快速且选择性地标记特定脑区内具有独特轴突投射的神经元亚群，从而提供视觉线索，实现在完整的脊椎动物中枢神经系统回路中对已识别神经元进行靶向电生理记录。
本方法最显著的创新之处在于利用荧光标记技术，在非遗传可及的模式系统中靶向特定细胞类型。弱电鱼是研究清醒且行为活跃动物神经回路的优良模型系统12。我们利用该技术研究弱电鱼类小鳍电鱼前外侧核（ELa）中“小细胞”的感觉信息处理。“小细胞”被认为是一类时间比较神经元，在检测突触前动作电位到达时间的亚毫秒级差异中起重要作用13。然而，由于其解剖学特征，如密集的髓鞘、被包裹的突触以及微小的胞体，使得传统方法极难对此类细胞进行记录11, 14。本文中，我们证明了该新方法可在28%的样本制备中实现对这些细胞的选择性标记，从而能够稳定、可靠地记录其对电感觉刺激的反应并进行特征表征。

荧光染料的逆行运输可根据解剖投射标记特定神经元亚群。标记的轴突可进行可视化靶向 体内，允许对已识别的轴突进行细胞外记录。当神经元无法通过基因操作进行标记或难以使用“盲法”分离时，该技术有助于实现记录 体内 方法

本方法的总体目标是从已确定的神经元群体中记录单个神经元的电活动反应。体内电生理记录从……

本实验的总体目标是记录非遗传模型系统中特定神经元群体的在体单细胞反应。首先通过开颅手术暴露目标脑区，实现这一目标。第二步是使用钨丝将荧光染料注入目标神经元投射的脑区。随后，染料发生逆向运输，从而实现对投射神经元的选择性标记。最后一步是记录单个投射神经元中标记的轴突。最终，通过单细胞胞外记录技术，揭示在完整神经回路中，中枢感觉神经元对感觉刺激在进化过程中的响应方式。该方法有助于解答关于神经回路如何检测突触输入时间上亚毫秒级差异的关键问题。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够靶向单个神经元甚至轴突，以及非遗传可及的系统。弱电鱼类利用电信号进行交流和导航。它们利用突触输入时间上亚毫秒级的差异来区分不同鱼类的信号。我们探究了其电感受回路中假定的时间比较神经元如何能够检测到如此微小的时间差异。但该技术也可应用于其他系统，例如视觉和听觉感觉通路。由于细胞体积微小，周围组织致密，且突触前末梢覆盖了大部分胞体，因此从这些细胞中获取液体尤为困难。在全细胞记录过程中进行细胞内染料注射，可在体外标记单个细胞，以指导对该轴突的靶向记录。类似地，细胞外注射染料后通过逆行运输，可选择性地标记浅层脑区的投射神经元。这可用于为活体单细胞记录提供视觉引导。制备D编码针时，首先将直径为160微米的钨丝通过电解法打磨至最终针尖直径为5至50微米。然后在实验前一晚，用2毫摩尔浓度、分子量为10,000的Alexa Fluor染料标记的葡聚糖溶液对针尖进行编码，以诱导全身麻醉。将鱼置于含有 MS-222 溶液（300 毫克/升）的养殖水体中，通过向背部躯干肌注射 100 微升浓度为 3 毫克/毫升的三卡因（flail），使鱼体固定并实现电沉默。接着，用养殖水填充记录室，并将鱼腹侧朝下放置于记录室中央的平台上。然后，将一根移液枪头插入鱼口中，以每分钟 1 至 2 毫升的速度灌注含氧的 MS-222 溶液（100 毫克/升）。随后，用固定杆和蜡将鱼体两侧固定以保持稳定。通过观察眼血管中持续的血流以及体色是否正常，监测鱼的健康状况。然后绕垂直轴旋转平台。调整平台的一端，使鱼头部背侧的一面露出水面，而鱼体的其余部分仍浸没在水中。在皮肤任何未浸没的区域放置一小块Kimwipe，以防止干燥。在此步骤中，使用棉签将0.4%利多卡因涂抹于暴露的头部表面。然后使用手术刀片为一条6.2厘米长的鱼切割一块大小约为3毫米×5毫米的矩形皮肤组织。该矩形的侧缘应与眼睛中心对齐，前缘应位于眼睛后方紧邻处，内侧缘应位于中线外侧紧邻处。随后，使用镊子移除矩形组织。再向前方额外切割一个 2.5 毫米的方形区域以暴露颅骨。用手术刀片刮除多余组织，彻底清理暴露的颅骨表面。然后用无尘纸和强制气流将表面彻底干燥。接着，使用速干胶将金属柱粘附至前内侧暴露的颅骨区域。等待胶水完全干燥。使用直径为0.5毫米的球形碳化钨钻头，在6.2厘米长的鱼颅骨上绘制一个约2毫米×4毫米的矩形。随后，用手术刀和镊子切割该矩形的周边，然后将颅骨剥离。 为了暴露脑组织，使用一对弹簧剪刀或针头切开色素化的硬脑膜和透明的软脑膜。然后用一对镊子移除已切开的部分，以暴露前外侧核和后外侧核。现在将之前准备好的带D涂层的针头安装在操纵器上，并将其置于包含目标轴突的靶区上方。本案例中，后外侧核迅速将针头插入组织约25微米。染料扩散15至30秒后，撤回针头。根据需要，使用新的针头重复操作。将每个染料放置在不同位置，使染料分布于目标区域。随后用Hickman's Ringer溶液冲洗腔体以去除多余的染料，并等待至少两小时，以确保染料被充分摄取和运输。为观察目标轴突，将装有鱼的记录腔置于直立式固定载物台倒置荧光显微镜的物镜下方。将呼吸液更换为新鲜的水箱水，并保持相同的流速。然后将接地线的一端放入暴露的脑腔中，另一端连接到记录头架的接地端。接着，将一对记录电极放置在尾部基部附近。然后将电极连接至差分放大器和记录装置。为了监测电器官放电指令（EODC），需在低倍镜下绘制脑区的按比例示意图，包括主要血管作为定位标记，以确定标记轴突的精确位置。为首先确认D电极的放置位置，应使用明场照明观察整个组织以进行定位。然后使用荧光照明观察。后外侧核应显示弥散性标记。接着，在高倍镜下，以血管作为解剖标志，定位前外侧核。使用外径为1毫米、内径为0.58毫米的含细丝硼硅酸盐毛细管玻璃，在荧光灯照射下寻找靠近表面的标记轴突。拉制一根 Recording 电极，其杆部长度为5毫米，尖端直径约为1至2.4微米。用过滤的Hickman任氏液填充电极。最终尖端电阻应在16至155兆欧范围内。将电极放入带有压力接口的电极架中。将其连接到安装在操纵器上的探头支架上，然后将探头支架连接至放大器。一个未显示的模数采集设备将放大器与计算机相连。随后，向电极导管施加 30 毫巴的正压。从组织表面缓慢推进电极，使其接近轴突。当电极接近轴突时，施加的正压应导致轴突产生轻微但可察觉的移动，此时电极位于轴突旁边。在呈现测试刺激期间记录活动。尽管电伪迹可证实记录和刺激正常，但不应出现动作电位。释放电极的外向压力，重复刺激和记录。然后施加轻微负压，使轴突进入电极。再次重复刺激与记录。此时，你应该能够看到一些对刺激产生反应的动作电位。一旦观察到动作电位，关闭压力管路。当所有预期的记录完成后，将水箱中的水换回含有 MS 222（浓度为 100 毫克/升）的呼吸溶液，以确保鱼类完全麻醉。在处死鱼类前，应至少连续 10 分钟未检测到放电活动（EODC）。以下是五个样本轨迹，显示了由持续时间为0.1毫秒、强度为每厘米6毫伏的单相同侧正向横向方波刺激所诱发的动作电位；此外，此处还展示了一个点阵图，显示了同一神经元在零时刻受到每厘米6毫伏刺激后，20次重复中75毫秒记录窗口内的放电时间。右侧列出了持续时间的范围。图中所示为刺激持续时间调谐曲线，该曲线以每次刺激重复的放电次数来量化神经元反应。一旦熟练掌握，若操作得当，本技术所示的手术及染料注射可在一小时内完成，染料注射后两至三小时即可开始记录。在尝试本操作时，务必牢记需在术后仔细监测实验动物的健康状况。此外，还可采用其他方法（如双光子成像）来记录更深层脑区中的神经元活动。观看本视频后，您应能充分理解如何对已确定的神经元群体进行单细胞反应的标记与记录。

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逆行荧光染料标记允许有针对性的外单细胞记录技术鉴定神经元<em&gt;在体内</em

我们展示了一种 体内 电穿孔转染方案，用于在多种出生后年龄段的小鼠中转染单个或少量成簇的视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜细胞类型。该方法实现了对出生后RGCs的标记与遗传操作 体内...

小鼠视网膜神经节细胞的转染 体内 电穿孔

本文描述了从小鼠完整视网膜中荧光标记的神经元群体记录单个细胞的方法。通过使用双光子红外激发，对转基因标记的细胞进行膜片钳记录，以研究其光反应、感受野特性及形态学特征。...

完整视网膜中表达GFP的细胞群体的电生理特征分析

我们介绍一种简单且低成本的技术，利用聚乙烯吸液移液管将高浓度的荧光染料和钙敏感染料引入神经元或任何神经纤维束中。...

逆行性荧光染料标记神经、传导束和脊神经根

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使用荧光脂溶性染料对 Drosophila 运动神经元进行逆行标记

本文描述了一种在新皮层预定义的功能微区中用荧光染料标记神经元的方法。首先，利用内在信号光学成像获取功能图谱；然后，采用双光子显微镜对图谱中特定微区内的神经元进行标记和成像。...

结合内在信号成像与双光子成像技术实现新皮层特定功能微区神经元的靶向标记

本方案描述了一种用于在清醒大鼠中监测皮层下脑区神经元活动的头部固定装置的设计与外科植入方法。该方案详细说明了通过邻细胞记录配置分离单个神经元并有效确定其解剖位置的操作步骤。...

清醒且头部固定的雄性大鼠皮层下脑区单个神经元的紧密细胞外记录与定位

关键词：紧密细胞外记录，单神经元记录，皮层下脑结构，清醒动物，头部固定，大鼠

我们介绍一种通过向脑核团注射顺行或逆行示踪剂来标记神经元及其突起的技术，该技术使用一种 体外 制备。我们改进了一种现有的i体外...

脑组织离体标本中的激光引导神经元示踪

本视频展示了开颅手术操作，该手术可实现对小鼠压后皮层神经元的长期成像 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠中进行双光子显微成像，并结合向背侧海马注射表达 mCherry...

双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

我们描述了一种逆行示踪的方法 果蝇...

逆行示踪 果蝇 使用亲脂性荧光染料标记胚胎运动神经元

本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜研究出生后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种稀疏标记和获取视网膜细胞类型及其细微突起的技术，该技术采用表达膜定位荧光蛋白的重组腺相关病毒载体，并以Cre依赖的方式实现特异性标记。...

利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向的视网膜细胞群体进行神经元分支的延时成像

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

学习利用逆行荧光染料标记技术对非遗传模型系统中的特定神经元进行单细胞外记录。该方法通过荧光染料的逆行运输选择性标记投射神经元，实现体内靶向记录，适用于研究电鱼感觉神经元及视觉、听觉等感觉通路。

逆行荧光标记可实现对已鉴定神经元的靶向细胞外单单位记录体内

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