逆行荧光标记可实现对已鉴定神经元的靶向细胞外单单位记录 体内

本实验的总体目标是记录非遗传模型系统中特定神经元群体的在体单细胞反应。首先通过开颅手术暴露目标脑区，实现这一目标。第二步是使用钨丝将荧光染料注入目标神经元投射的脑区。

随后，染料发生逆向运输，从而实现对投射神经元的选择性标记。最后一步是记录单个投射神经元中标记的轴突。最终，通过单细胞胞外记录技术，揭示在完整神经回路中，中枢感觉神经元对感觉刺激在进化过程中的响应方式。

该方法有助于解答关于神经回路如何检测突触输入时间上亚毫秒级差异的关键问题。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够靶向单个神经元甚至轴突，以及非遗传可及的系统。弱电鱼类利用电信号进行交流和导航。

它们利用突触输入时间上亚毫秒级的差异来区分不同鱼类的信号。我们探究了其电感受回路中假定的时间比较神经元如何能够检测到如此微小的时间差异。但该技术也可应用于其他系统，例如视觉和听觉感觉通路。

由于细胞体积微小，周围组织致密，且突触前末梢覆盖了大部分胞体，因此从这些细胞中获取液体尤为困难。在全细胞记录过程中进行细胞内染料注射，可在体外标记单个细胞，以指导对该轴突的靶向记录。类似地，细胞外注射染料后通过逆行运输，可选择性地标记浅层脑区的投射神经元。

这可用于为活体单细胞记录提供视觉引导。制备D编码针时，首先将直径为160微米的钨丝通过电解法打磨至最终针尖直径为5至50微米。然后在实验前一晚，用2毫摩尔浓度、分子量为10,000的Alexa Fluor染料标记的葡聚糖溶液对针尖进行编码，以诱导全身麻醉。

将鱼置于含有 MS-222 溶液（300 毫克/升）的养殖水体中，通过向背部躯干肌注射 100 微升浓度为 3 毫克/毫升的三卡因（flail），使鱼体固定并实现电沉默。接着，用养殖水填充记录室，并将鱼腹侧朝下放置于记录室中央的平台上。然后，将一根移液枪头插入鱼口中，以每分钟 1 至 2 毫升的速度灌注含氧的 MS-222 溶液（100 毫克/升）。

随后，用固定杆和蜡将鱼体两侧固定以保持稳定。通过观察眼血管中持续的血流以及体色是否正常，监测鱼的健康状况。然后绕垂直轴旋转平台。

调整平台的一端，使鱼头部背侧的一面露出水面，而鱼体的其余部分仍浸没在水中。在皮肤任何未浸没的区域放置一小块Kimwipe，以防止干燥。在此步骤中，使用棉签将0.4%利多卡因涂抹于暴露的头部表面。

然后使用手术刀片为一条6.2厘米长的鱼切割一块大小约为3毫米×5毫米的矩形皮肤组织。该矩形的侧缘应与眼睛中心对齐，前缘应位于眼睛后方紧邻处，内侧缘应位于中线外侧紧邻处。

随后，使用镊子移除矩形组织。再向前方额外切割一个 2.5 毫米的方形区域以暴露颅骨。用手术刀片刮除多余组织，彻底清理暴露的颅骨表面。

然后用无尘纸和强制气流将表面彻底干燥。接着，使用速干胶将金属柱粘附至前内侧暴露的颅骨区域。等待胶水完全干燥。

使用直径为0.5毫米的球形碳化钨钻头，在6.2厘米长的鱼颅骨上绘制一个约2毫米×4毫米的矩形。随后，用手术刀和镊子切割该矩形的周边，然后将颅骨剥离。

为了暴露脑组织，使用一对弹簧剪刀或针头切开色素化的硬脑膜和透明的软脑膜。然后用一对镊子移除已切开的部分，以暴露前外侧核和后外侧核。现在将之前准备好的带D涂层的针头安装在操纵器上，并将其置于包含目标轴突的靶区上方。

本案例中，后外侧核迅速将针头插入组织约25微米。染料扩散15至30秒后，撤回针头。根据需要，使用新的针头重复操作。

将每个染料放置在不同位置，使染料分布于目标区域。随后用Hickman's Ringer溶液冲洗腔体以去除多余的染料，并等待至少两小时，以确保染料被充分摄取和运输。为观察目标轴突，将装有鱼的记录腔置于直立式固定载物台倒置荧光显微镜的物镜下方。

将呼吸液更换为新鲜的水箱水，并保持相同的流速。然后将接地线的一端放入暴露的脑腔中，另一端连接到记录头架的接地端。接着，将一对记录电极放置在尾部基部附近。

然后将电极连接至差分放大器和记录装置。为了监测电器官放电指令（EODC），需在低倍镜下绘制脑区的按比例示意图，包括主要血管作为定位标记，以确定标记轴突的精确位置。为首先确认D电极的放置位置，应使用明场照明观察整个组织以进行定位。

然后使用荧光照明观察。后外侧核应显示弥散性标记。接着，在高倍镜下，以血管作为解剖标志，定位前外侧核。

使用外径为1毫米、内径为0.58毫米的含细丝硼硅酸盐毛细管玻璃，在荧光灯照射下寻找靠近表面的标记轴突。拉制一根 Recording 电极，其杆部长度为5毫米，尖端直径约为1至2.4微米。

用过滤的Hickman任氏液填充电极。最终尖端电阻应在16至155兆欧范围内。将电极放入带有压力接口的电极架中。

将其连接到安装在操纵器上的探头支架上，然后将探头支架连接至放大器。一个未显示的模数采集设备将放大器与计算机相连。

随后，向电极导管施加 30 毫巴的正压。从组织表面缓慢推进电极，使其接近轴突。当电极接近轴突时，施加的正压应导致轴突产生轻微但可察觉的移动，此时电极位于轴突旁边。

在呈现测试刺激期间记录活动。尽管电伪迹可证实记录和刺激正常，但不应出现动作电位。释放电极的外向压力，重复刺激和记录。

然后施加轻微负压，使轴突进入电极。再次重复刺激与记录。此时，你应该能够看到一些对刺激产生反应的动作电位。

一旦观察到动作电位，关闭压力管路。当所有预期的记录完成后，将水箱中的水换回含有 MS 222（浓度为 100 毫克/升）的呼吸溶液，以确保鱼类完全麻醉。在处死鱼类前，应至少连续 10 分钟未检测到放电活动（EODC）。

以下是五个样本轨迹，显示了由持续时间为0.1毫秒、强度为每厘米6毫伏的单相同侧正向横向方波刺激所诱发的动作电位；此外，此处还展示了一个点阵图，显示了同一神经元在零时刻受到每厘米6毫伏刺激后，20次重复中75毫秒记录窗口内的放电时间。右侧列出了持续时间的范围。图中所示为刺激持续时间调谐曲线，该曲线以每次刺激重复的放电次数来量化神经元反应。

一旦熟练掌握，若操作得当，本技术所示的手术及染料注射可在一小时内完成，染料注射后两至三小时即可开始记录。在尝试本操作时，务必牢记需在术后仔细监测实验动物的健康状况。此外，还可采用其他方法（如双光子成像）来记录更深层脑区中的神经元活动。

观看本视频后，您应能充分理解如何对已确定的神经元群体进行单细胞反应的标记与记录。