利用荧光生成型DNA酶检测细菌

以下实验的总体目标是利用新型荧光DNA酶探针快速检测特定细菌（如大肠杆菌）的存在。首先，通过连接反应生成完全基因的DNA酶探针。随后对细菌进行培养，以富集目标分子，并从上清液中制备积累的胞外混合物。

随后将粗制的胞外混合物与DNA酶探针结合，当DNA酶探针与靶分子相互作用时，探针被切割并产生荧光信号。通过荧光计检测探针与靶标之间的相互作用，表现为相对荧光强度的增加。随后采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析验证结果。

与PCR或基于抗体的方法相比，该技术的主要优势在于操作更简单、更易于实施。尽管该方法是针对模式细菌大肠杆菌（e coli）开发的，但也可应用于其他任何食源性或医院内细菌病原体的检测。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为他们可能不熟悉合成DNA探针和细菌的操作。本方案的实验操作由本实验室研究助理Sergio Aguire和博士后研究员Monso Ali演示。

R-F-D-E-C 1 是一种特征性 DNA 酶。它包含由黑色下划线标出的催化序列 EC 1，以及由绿色下划线标出的底物序列 FS 1；在底物内部，由蓝色“r”表示的 RNA 连接两侧分别连接了一个带有荧光标记的脱氧胸苷（DT），以“F”表示，以及一个带有淬灭剂标记的脱氧胸苷（DT），以“Q”表示。RF SS 1 是 R-F-D-E-C 1 的一种打乱序列变体，其中催化序列 EC 1 被部分重排为 SS 1，但 FS 1 区段保持不变。RF DEC 1 和 RF SS 1 是通过模板介导的酶促连接反应制备的，即将寡核苷酸 FS 1 与寡核苷酸 EC 1 或 SS 1 在 LT 1 作为连接模板的存在下进行连接，从而制得粗制胞外混合物（CEMs），该混合物将作为 R-F-D-E-C 1 的靶标。实验开始时，使用移液枪将 2 毫升 LB 培养基分装至无菌的 14 毫升培养管中。

接下来，使用无菌的移液枪头从琼脂平板上挑取单个大肠杆菌菌落，并将其放入含有LB培养基的培养管中。将培养管置于37摄氏度的摇床中，以250 RPM的转速振荡培养14小时。为制备1%的转接培养物，向14毫升的培养管中加入2毫升新鲜LB培养基，并加入20微升上一步骤中的细菌培养物。

将试管在37摄氏度、250 RPM振荡条件下孵育，直至各细菌溶液的OD 600达到约1。取各培养物1毫升至新的1.5毫升微量离心管中，于11,000 G离心5分钟，使细胞沉淀。离心后，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。

将上清液在 -20 摄氏度保存。如果不能立即用于检测 DNA 酶与粗细胞提取物相互作用时是否产生荧光信号，则通过光谱光度法对样品进行检测。开启荧光分光光度计，并设置数据采集参数，激发波长为 488 纳米，发射波长为 520 纳米。

同时设置仪器每分钟读数一次，持续一小时。先用去离子蒸馏水清洗三支石英比色皿，再用100%乙醇清洗。用氮气吹干比色皿。

将比色皿标记为C1（对照1）、C2（对照2）和T（测试）。随后，向C1中加入24 µL去离子蒸馏水，向C2和T中各加入24 µL制备好的大肠杆菌粗提胞外混合液。向每个比色皿中加入25 µL 2×RB缓冲液，并将其放入荧光分光光度计中。五分钟后开始采集荧光数据，向C2中加入1 µL 5 µM RFS S1，向T和C1中加入1 µL 5 µM RFD eec1，注意确保荧光读数不被中断。用移液器吹打混匀各溶液，然后继续反应直至数据采集结束。

将数据保存为 Excel 文件格式。然后将数据传输到个人计算机，并使用 Excel 创建图形图像。所用的反应混合物与光谱分析时相同。

分光光度法可用于凝胶电泳分析。采集一小时后，从分光光度计中取出比色皿，并将溶液转移至新的微量离心管中。

加入5微升3摩尔的醋酸钠和125微升100%乙醇以终止反应。通过涡旋振荡混匀各溶液，孵育后将离心管置于-20摄氏度冰箱中冷冻1小时。在4摄氏度、11,000 G条件下离心反应混合物20分钟，然后小心用移液器吸除上清液。

使用DNA浓缩仪将沉淀干燥10分钟。加入20 µL上样缓冲液，短暂涡旋混匀。用台式离心机短暂离心沉淀。

运行结束后，每孔加入10 µL反应样品至10% Dage凝胶中。取下玻璃板，用自来水彻底清洗。若存在凝胶碎片，可用Kim擦拭纸擦拭玻璃板以去除。

使用Typhoon扫描仪对凝胶板进行荧光扫描。利用图像定量软件分析所得图像，以评估系统的灵敏度。将系列稀释的培养物进行不同时间的培养。

为确定检测单个细菌所需的最短孵育时间，准备10个含有2毫升LB培养基的培养管，每管接种100微升浓度为每毫升2个菌落形成单位（CFU）的大肠杆菌甘油保存菌液，并在37摄氏度、250 RPM振荡条件下分别孵育4、8、12、16和24小时。从每个接种后的培养管中收集300微升样品，因为在4、8、12小时时间点采集的样品中可能无法检测到细菌。

将剩余培养物继续培养24小时，以鉴定含有细菌的培养物。测定OD 600，并在11,000 G离心5分钟以沉淀细胞。将含有CEMS的上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，并于-20摄氏度保存，直至次日使用。

检查培养物的生长情况。接种后，10个培养物中可能仅有一到两个含有大肠杆菌，其余试管中将不含任何细胞。利用在指定时间点从阳性培养物中回收的CEMS，与RFD EEC one进行切割反应的制备，随后按照前述方法，使用DAGE凝胶电泳分析反应混合物。RFD EEC one和RF SS one探针均通过DNA酶部分与底物的酶促连接制备而成。

随后通过光谱法评估了CEM EEC与RFD EEC1或RF SS1之间的相互作用。如图所示，加入CEM ec后，R-F-D-E-C1产生了较强的荧光信号。

相比之下，R FS S 一并未产生强烈的荧光信号。因此，RFD EEC 一具有产生荧光的功能。在接触 CEM EC 后进行测序。

特异性验证观察到的荧光增强是由于RNA连接被切割所致。通过dage分析反应混合物，RFD eec的切割中，0.25摩尔氢氧化钠预期会产生2D NA片段，其中5'端片段保留荧光基团（Fluor），3'端片段保留淬灭基团（quencher）。如图所示。

RFD EEC CEM EEC 反应混合物确实产生了预期的切割产物。此外，只有 UNC 能够切割 R-F-D-E-C 一位点，并且只能通过荧光成像检测到其5'片段。为了检验 RFD EEC 一位点的特异性，仅使用从其他几种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中收集的 CEM 进行了荧光检测实验。

含有大肠杆菌 CEM 的样本产生了荧光增强。与其他细菌产生的 CEMS 无交叉反应性表明，R-F-D-E-C 1 对大肠杆菌具有高度选择性。为确定检测单个大肠杆菌细胞所需的最短培养时间，将大肠杆菌稀释至每毫升含一个 CFU，在 100 微升培养基中分别培养 4–8、12–16 和 24 小时。将所得的 CEMS 与 R-F-D-E-C 1 混合，并通过 dage 检测其切割情况，结果如图所示。

Dage检测的图像显示，R-F-D-E-C未产生预期的切割产物。当与CEM反应时，在培养4小时和8小时后收集的ECS表明，需要12小时的培养时间才能获得理想结果。一旦掌握该方法，即可稳定操作。

该技术的关键在于，若操作得当，基于DNA酶的检测可在60分钟内完成。这一进展为生物分析领域的研究人员探索异源性DNA酶用于检测多种细菌病原体提供了途径。