Name: 检测使用荧光脱氧核酶的细菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 学习使用荧光脱氧核酶探针检测大肠杆菌的快速方法。该技术通过荧光信号变化实现细菌检测，比传统PCR和抗体方法更简便高效，适用于食品安全和临床诊断领域。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作的资助由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）以及哨兵生物活性纸张网络提供。

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Bacterial+Detection%3A+Biosensors%2C+Recognition+Receptors+and+Microsystems%22">Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems</a>. Zourob, M., Elwary, S., Truner, A. , Springer. New York. (2008).</li>
<li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+Opportunities+for+Pathogen+Detection+Using+DNA+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays.</a> Crit. Rev. Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li>
<li>Lazcka, O., Campo, D. el, J, F., Muñoz, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+detection%3A+A+perspective+of+traditional+methods+and+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 1205-1217 (2007).</li>
<li>Velusamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+foodborne+pathogen+detection%3A+In+the+perspective+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors.</a> Biotechnol. Adv. 28, 232-254 (2010).</li>
<li>Ali, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+Probes+as+Bacterial+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Nucleic+Acid+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional Nucleic Acid Sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li>
<li>Li, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Y+%22Functional+Nucleic+Acids+for+Analytical+Applications%22">Functional Nucleic Acids for Analytical Applications</a>. , Springer. New York. (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+Years+of+In+Vitro+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Forty Years of In Vitro Evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6420-6436 (2007).</li>
<li>Breaker, R. R., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+enzyme+that+cleaves+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A DNA enzyme that cleaves RNA.</a> Chem. Biol. 1, 223-229 (1994).</li>
<li>Cuenoud, B., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+metalloenzyme+with+DNA+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity.</a> Nature. 375, 611-614 (1995).</li>
<li>Chinnapen, D. J., Sen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deoxyribozyme+that+harnesses+light+to+repair+thymine+dimers+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 65-69 (2004).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Silverman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+as+a+versatile+chemical+component+for+catalysis%2C+encoding%2C+and+stereocontrol%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 7180-7201 (2010).</li>
<li>Mei, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+RNA-cleaving+DNA+enzyme+that+synchronizes+catalysis+with+fluorescence+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 412-420 (2003).</li>
<li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal-ion+specificities+and+pH+dependences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Kandadai, S. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+catalytically+efficient+acidic+RNA-cleaving+deoxyribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme.</a> Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).</li>
<li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quenching+of+fluorophore-labeled+DNA+oligonucleotides+by+divalent+metal+ions%3A+implications+for+selection%2C+design%2C+and+applications+of+signaling+aptamers+and+signaling+deoxyribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 780-790 (2005).</li>
<li>Shen, Y., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+secondary+structure+and+identifying+functionally+essential+nucleotides+of+pH6DZ1%2C+a+fluorescence-signaling+and+RNA-cleaving+deoxyribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme.</a> Biochemistry. 44, 12066-12076 (2005).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revitalization+of+six+abandoned+catalytic+DNA+species+reveals+a+common+three-way+junction+framework+and+diverse+catalytic+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores.</a> J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+high-branching+deoxyribozymes+from+a+catalytic+DNA+with+a+three-way+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction.</a> Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+and+rational+engineering+of+trans-acting+pH6DZ1%2C+an+RNA-cleaving+and+fluorescence-signaling+deoxyribozyme+with+a+four-way+junction+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+BioChem%22%5BJournal%5D)">Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure.</a> Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).</li>
<li>Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pH3DZ1+-+An+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+3%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3.</a> Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+signaling+platforms+built+from+a+small+catalytic+DNA+and+doubly+labeled+fluorogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates.</a> Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+MgZ+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS ONE. 2, e1224(2007).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+fluorescence+signaling+DNA+enzymes+in+sol+gel-derived+materials+for+metal+ion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing.</a> Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).</li>
<li>Kandadai, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5.</a> Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).</li>
<li>Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+assembly+of+nanospecies+on+repetitive+DNA+sequences+generated+on+gold+nanoparticles+by+rolling+circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification.</a> Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).</li>
<li>Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+protein-binding+DNA+aptamers+as+ligands+for+biosensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.</a> Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).</li>
<li>Ali, M. M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+sensing+by+using+allosteric-DNAzyme-coupled+rolling+circle+amplification+and+a+peptide+nucleic+acid-organic+dye+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

目前大多数常见的细菌检测方法要么速度较慢（传统微生物学方法），要么技术要求较高（抗体法、PCR法）。因此，我们认为下一代检测工具应朝着更快、更简便的方向发展。为此，我们开发了一种可切割RNA并产生荧光信号的脱氧核酶（DNAzyme），可用于构建简单的检测体系，通过产生荧光信号来报告细菌的存在。本研究中所展示的DNAzyme探针RFD-EC1可被大肠杆菌（E. coli）在培养基中生长时产生的CEM所激活。由于本方法直接使用细菌的粗提胞外混合物作为检测靶标，无需繁琐的靶标提取与扩增步骤，因此可用于建立极为简便的“混合即读”型细菌检测方法。我们开发的DNAzyme不仅限于荧光检测。例如，可结合之前报道的滚环扩增技术与有机染料，设计基于同一DNAzyme系统的比色检测方法32。我们预计，将DNAzyme用于细菌检测是一条极具吸引力的途径，有望开发出操作更为简便的新型细菌生物传感器。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>BioShop Canada</td><td>AMP001</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺（40%，29:1）</td><td>BioShop Canada</td><td>ACR004</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>BioShop Canada</td><td>BOR001</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>EXO539-1</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38281</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop Canada</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore</td><td>B10149-34</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>EMD Millipore</td><td>SXO255-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD Millipore</td><td>SXO590-1</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioShop Canada</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioShop Canada</td><td>TEM001</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>BioShop Canada</td><td>BST666</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>BioShop Canada</td><td>URE001</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>DNA浓缩仪</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant DNA SpeedVac 120</td><td></td></tr><tr><td>Millipore滤器单元</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>加样枪头</td><td>Diamed</td><td>TEC200EX-K</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant软件</td><td>Molecular Dynamics</td><td>Version 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes纸巾</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34705</td><td></td></tr><tr><td>微型涡旋振荡器</td><td>VWR international</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand 08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>移液枪（Stripettor Plus）</td><td>Corning</td><td>07764714</td><td></td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>66-100216-00</td><td></td></tr><tr><td>摇床/培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Classic Series C24</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon扫描仪</td><td>GE Healthcare</td><td>9200 Variable mode</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allegra X22-R</td><td></td></tr><tr><td>紫外分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>GenesysUV 10</td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>Cary Eclipse</td><td></td></tr></tbody></table>

利用荧光生成型dna酶检测细菌

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

与食源性和医院获得性病原体相关的疫情每年导致数百万人死亡和住院，并造成巨大的经济损失。预防此类疫情暴发以及最大限度地减轻正在进行的流行病的影响，使得人们对能够在最早阶段准确识别致病病原体的分析方法的需求日益增长。尽管目前已有大量有效的病原体检测方法，但尚无任何一种方法能够同时满足理想检测方法所应具备的以下五项首要要求：高特异性（仅检测目标细菌）、高灵敏度（能够检测到低至单个活菌细胞）、快速出结果（数分钟至数小时）、操作简便（无需复杂的采样程序和专用设备）以及成本效益高。例如，传统的微生物学方法虽然特异性高，但获得明确结果需要较长时间（数天至数周）1。基于PCR和抗体的技术虽然等待时间较短（数小时至数天），但需要使用昂贵的试剂和/或复杂的仪器2-4。因此，科学界仍迫切需要开展研究，开发在上述一项或多项要求中性能更优的新型细菌检测方法。本实验室致力于探索DNAzyme作为一类新型分子探针在生物传感应用（包括细菌检测）中的潜力5。
脱氧核酶（也称为脱氧核糖酶或DNA酶）是人工合成的单链DNA分子，具有催化化学反应的能力。6-8 这些分子可以从一个庞大的随机序列DNA库（其中包含多达10^15个序列）中分离出来。16 个体序列）通过一种称为“体外 筛选或指数富集配体系统进化（SELEX）9-16 近年来，这些特殊的DNA分子已被广泛研究，作为生物传感应用的分子工具。6-8
我们实验室已建立 体外 分离RNA切割型荧光DNA酶（RFDs； 图 1并探讨了将RFD用作分析工具的方法。17-29 RFDs 在荧光基团（F）和淬灭基团（Q）之间的单个核糖核苷酸连接位点（R）处催化 DNA-RNA 杂合底物的切割。由于 F 与 Q 彼此靠近，未切割的底物荧光信号极弱。然而，切割反应导致 F 与 Q 分离，伴随荧光强度显著增强。
最近，我们开发了一种用于细菌检测的RFD分离方法5。这些特殊的RFD被分离出来，可在特定类型细菌在其环境或培养基中留下的粗提胞外混合物（CEM）存在时“发光”（图1）。使用粗提混合物可避免耗时的微生物目标物纯化与鉴定过程（该过程可能需要数月甚至数年才能完成），从而简化生物传感器的开发流程。采用胞外靶标意味着检测程序更为简便，无需进行获取胞内靶标的额外步骤。
采用上述方法，我们获得了一种能够切割其底物（FS1）的RFD； 图 2A仅在由CEM产生的条件下 E. coli (CEM-EC)5 这 大肠杆菌-感应型RFD，命名为RFD-EC1（图 2A），被发现仅对CEM-EC有严格响应，而对来自其他多种细菌的CEM均无响应（图 3).
本文介绍了建立实验体系的关键实验步骤 E. coli 使用 RFD-EC1 的检测实验及代表性结果

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）。

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

与食源性和医院获得性病原体相关的疫情已导致数百万人死亡和住院，并造成巨大的经济损失……

以下实验的总体目标是利用新型荧光DNA适体酶探针，快速检测特定细菌（如大肠杆菌）的存在。首先，通过连接反应生成完全基因的DNA适体酶探针。随后培养细菌以富集目标分子，并从上清液中制备积累的胞外混合物。随后将粗制的胞外混合物与DNA酶探针结合，当DNA酶探针与靶分子相互作用时，探针被切割并产生荧光信号。通过荧光分光光度计检测探针与靶分子的相互作用，表现为相对荧光强度的增加。随后采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析验证结果。与PCR或基于抗体的方法相比，该技术的主要优势在于操作更简单、更易于实施。尽管该方法是以大肠杆菌（e coli）这一模式细菌开发的，但也可应用于其他任何食源性或医院内感染细菌病原体的检测。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为他们可能不熟悉合成DNA探针和细菌的操作。本方案的实验操作由本实验室研究助理Sergio Aguire和博士后研究员Monso Ali演示。R-F-D-E-C 1 是一种特征性 DNA 酶，包含由黑色下划线标出的催化序列 EC 1，以及由绿色下划线标出的底物序列 FS 1。在底物内部，由蓝色“r”表示一个 RNA 连接键，其两侧分别为带有荧光标记的脱氧胸苷（DT，以 F 表示）和带有淬灭基团标记的脱氧胸苷（DT，以 Q 表示）。RF SS 1 是 R-F-D-E-C 1 的一种打乱序列版本，其中催化序列 EC 1 被部分重排为 SS 1，但 FS 1 区段保持不变。RF DEC 1 和 RF SS 1 是通过在连接模板 LT 1 存在下，以模板介导的酶促连接方式将寡核苷酸 FS 1 与寡核苷酸 EC 1 或 SS 1 连接而成，用于制备粗制胞外混合物（CEMs），这些混合物将作为 R-F-D-E-C 1 的靶标。实验开始时，使用移液枪将 2 毫升 LB 培养基分装至无菌的 14 毫升培养管中。接下来，使用无菌的移液器吸头从琼脂平板上挑取单个大肠杆菌菌落，并将其放入含有LB培养基的培养管中。将培养管置于37摄氏度的摇床中，以250 RPM的转速振荡培养14小时。为制备1%的转接培养液，向每支14毫升的培养管中加入2毫升新鲜LB培养基，并加入20微升上一步骤中的细菌培养液。将试管置于37摄氏度、250 RPM振荡条件下孵育，直至各细菌溶液的OD 600达到约1个转接量。取每种培养物1毫升至新的1.5毫升微量离心管中，于11,000 G离心5分钟，使细胞沉淀。离心后，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。将上清液在 -20 摄氏度保存。如果不能立即用于检测 DNA 酶与粗细胞提取物相互作用时是否产生荧光信号，则通过光谱光度法对样品进行检测。开启荧光分光光度计，并设置数据采集参数，激发波长为 488 纳米，发射波长为 520 纳米。同时设置仪器每分钟读数一次，持续一小时。先用去离子蒸馏水清洗三只石英比色皿，再用100%乙醇清洗。用氮气吹干比色皿。将比色皿标记为C1（对照1）、C2（对照2）和T（测试）。随后，向C1中加入24 µL去离子蒸馏水，向C2和T中各加入24 µL已制备的大肠杆菌粗提胞外混合液。向每个比色皿中加入25 µL 2×RB溶液，并将其放入荧光分光光度计中。五分钟后开始采集荧光数据，向C2中加入1 µL 5 µM RFS S1，向T和C1中加入1 µL 5 µM RFD eec1，注意确保荧光读数不被中断。用移液器吹打混匀各溶液，然后继续反应直至数据采集结束。将数据保存为 Excel 文件格式，然后将数据传输到个人计算机，并使用 Excel 创建图形图像。所用的反应混合物与光谱分析时相同。分光光度法可用于凝胶电泳分析。采集一小时后，从分光光度计中取出比色皿，并将溶液转移至新的微量离心管中。加入5微升3摩尔的醋酸钠和125微升100%乙醇以终止反应。通过涡旋振荡混匀各溶液，将离心管置于-20摄氏度冰箱中冷冻1小时，随后在4摄氏度下以11,000 G离心20分钟，小心用移液器吸除上清液。使用DNA浓缩仪将沉淀干燥10分钟。加入20微升上样缓冲液，短暂涡旋混匀。用台式离心机短暂离心沉淀。随后，将反应样品每孔10 µL上样至10% Dage凝胶的每个加样孔中。电泳结束后，取下玻璃板，并用自来水彻底冲洗。为去除残留的胶块，用无尘纸擦拭玻璃板。使用Typhoon扫描仪对凝胶板进行荧光扫描。利用图像定量软件分析所得图像，以评估系统的灵敏度。将系列稀释的培养物进行不同时间的培养。为确定检测单个细菌所需的最短孵育时间，准备10个含有2毫升LB培养基的培养管，每管接种100微升浓度为每毫升2个菌落形成单位（CFU）的大肠杆菌甘油保存菌液，并在37摄氏度、250 RPM振荡条件下分别孵育4、8、12、16和24小时。从每个接种后的培养管中收集300微升样品，因为在4、8、12小时时间点采集的样品中可能无法检测到细菌。将剩余的培养物继续培养24小时，以鉴定含有细菌的培养物。测定OD 600，并在11,000 G条件下离心5分钟以沉淀细胞。将含有CEMS的上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，并于-20摄氏度保存，直至次日使用。检查培养物的生长情况。接种后，10个培养物中可能仅有一至两个含有大肠杆菌，其余试管中将不含任何细胞。在指定时间点，使用来自阳性培养物的CEMS进行裂解反应制备，反应体系中包含RFD EEC one，随后按照前述方法通过DAGE凝胶电泳分析反应混合物。RFD EEC one和RF SS one探针均通过将DNA酶部分与底物进行酶促连接而制备。随后通过光谱法评估了CEM EEC与RFD EEC1或RF SS1之间的相互作用。如图所示，加入CEM ec后，R-F-D-E-C1产生了较强的荧光信号。相比之下，R FS S one 未产生强烈的荧光信号。因此，RFD EEC one 具有产生荧光的功能。在接触 CEM EC 后进行测序。特异性验证观察到的荧光增强是由于RNA连接被切割所致。通过dage分析反应混合物，RFD eec的切割中，0.25摩尔氢氧化钠预期将产生2D NA片段，其中5'端片段保留荧光基团（Fluor），3'端片段保留淬灭基团（quencher）。如下所示。RFD EEC CEM EEC 反应混合物确实产生了预期的切割产物。此外，只有 UNC 能够切割 R-F-D-E-C，且仅能通过荧光成像检测到其5'片段。为了考察 RFD EEC 一的特异性，使用仅从其他几种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中收集的 CEMS 进行了荧光检测实验。含有大肠杆菌CEM的样品产生了荧光增强。与其他细菌来源的CEM无交叉反应，表明R-F-D-E-C一对于大肠杆菌具有高度选择性。为确定检测单个大肠杆菌细胞所需的最短培养时间，将大肠杆菌稀释至每毫升1个CFU，在100微升培养基中分别培养4、8、12、16和24小时。将所得的CEM与R-F-D-E-C一混合，并通过dage分析裂解情况，结果如图所示。Dage检测的图像显示，R-F-D-E-C未产生预期的切割产物。当与CEM反应时，在培养4小时和8小时后收集的ECS表明，需要12小时的培养时间才能获得理想结果。一旦掌握该方法，即可稳定操作。该技术的关键在于，只要操作得当，基于DNA酶的检测可在60分钟内完成。这一进展为生物分析领域的研究人员探索异源性DNA酶用于检测多种细菌病原体铺平了道路。

detection-of-bacteria-using-fluorogenic-dnazymes

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

检测使用荧光脱氧核酶的细菌

来源：Kim, H. et. al., 利用高通量遗传酶筛选系统进行多酶筛选。J. Vis. Exp.

检测转基因细菌细胞中靶酶的表达

本视频展示了一种利用纳米传感器检测食品和水样中细菌污染物的技术。该方法通过磁弛豫和荧光发射两种模式相结合，实现对目标致病菌的检测。...

利用磁荧光纳米传感器检测细菌污染

细菌致病性研究的核心在于确定微生物在接触真核细胞后是否能够存活以及其存活机制。本文概述了使用荧光染料检测单个细菌在宿主细胞内及与宿主细胞相关时活力状态的实验方案。...

用于测定与哺乳动物细胞相关的细菌活力的荧光显微镜方法

本文描述了一种利用地高辛标记的靶向16S...

原位检测石蜡包埋组织中的细菌：使用地高辛标记的靶向16S rRNA的DNA探针

我们描述了一种利用改良石蕊试验比色检测大肠杆菌（E.

使用石蕊试验比色法检测细菌

了解细菌中必需过程的功能具有挑战性。利用靶向特异性染料进行荧光显微镜观察，可为微生物细胞生长和细胞周期进程提供关键见解。本文以Agrobacterium...

活细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的关键过程

目前用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒的多重诊断方法需要复杂的样品制备过程和昂贵的仪器设备，难以在资源有限的环境中应用。我们展示了一种基于等温扩增技术并结合靶标特异性链置换探针的诊断方法，可高灵敏度、高特异性地检测并区分这些病毒。...

基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

本文介绍了一种改良的荧光肽底物酶谱法的详细实验方案，该方法采用荧光标记的肽段作为可降解底物，取代传统的天然蛋白质。通过在荧光肽酶谱中对生物样品进行电泳，能够检测到比以往酶谱技术更广泛种类的蛋白酶。...

荧光肽底物酶谱法检测蛋白酶活性

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。...

利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

基于脱氧核酶的纳米机器可用于核酸的高选择性和高灵敏度检测。本文以EB病毒片段的检测为例，详细描述了利用免费软件设计含有10-23核心的脱氧核酶纳米机器的实验方案及其应用。...

基于DNAzyme 10-23的核酸识别纳米机器

学习使用荧光脱氧核酶探针检测大肠杆菌的快速方法。该技术通过荧光信号变化实现细菌检测，比传统PCR和抗体方法更简便高效，适用于食品安全和临床诊断领域。

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

探索更多视频