检测使用荧光脱氧核酶的细菌

以下实验的总体目标是使用新型流感原菌、DNA、Zyme 探针快速检测特定细菌（如大肠杆菌）的存在 首先，完整的基因 DNA。Zyme 探针是通过连接产生的。然后培养细菌以富集靶分子的数量，并从上清液制备积累的细胞外混合物。

然后将粗的细胞外混合物与 DNA 酶探针结合，DNA 酶探针和靶分子之间的相互作用导致探针切割，然后 fluoresces 正在使用探针。探针和靶标之间的荧光计相互作用被视为相对荧光的增加。然后使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析验证结果。

与基于 PCR 或抗体的方法相比，该技术的主要优点是程序更简单、更易于执行。虽然这种方法是用模型细菌开发的 e 大肠杆菌，但它可以应用于检测任何其他食源性或院内细菌病原体。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为他们可能不习惯处理合成 DNA 探针和细菌 演示该程序的是我实验室的研究助理 Sergio Aguire 和博士后研究员 Monso Ali 该协议。

R-F-D-E-C 一种是特色 DNA 酶。它由催化序列 EC one 组成，底物序列 FS one 以绿色下划线表示，包含在底物内，是蓝色 r 表示的 RNA 键，两侧是 F 表示的 Fluor 标记的 DT 和队列 RF SS 表示的淬灭标记的 DT SS one 是 RFD EEC one 的加扰版本，其中催化序列 EEC 1 部分改组为 SS 1， 但 FS 一部分保持不变。RF DEC one 和 RF SS one 是通过寡核苷酸 FS one 与寡核苷酸 EC one 或 SS one 在LT one存在下作为连接模板的模板介导的酶连接制成的，以制备粗的细胞外混合物或 CEM，这些混合物将用作 R-F-D-E-C 的靶标，首先使用移液枪将 2 毫升 LB 分配到无菌的 14 毫升培养管中。

接下来，使用无菌移液器吸头，从螺旋板中挑选单个大肠杆菌菌落，并将其放入含有 lb 的培养管中。将试管放入 37 摄氏度的培养箱中，并在孵育后以 250 RPM 摇动 14 小时。为了产生 1%再接种培养物，将 2 毫升新鲜 LB 分配到 14 毫升培养管中，并添加 20 微升上一步的细菌培养物。

在 37 摄氏度下孵育试管，并以 250 RPM 摇动，直到每种细菌溶液达到大约 1 次转移的 OD 600。将每种培养物 1 mL加入新的 1.5 mL微量离心管中，并以 11， 000 G 离心 5 分钟，使细胞沉淀。离心后，将澄清的上清液转移到新鲜的 1.5 mL 微量离心管中。

将上清液储存在零下 20 摄氏度。如果它不会立即用于确定 DNA 酶与粗细胞提取物的相互作用是否会产生荧光信号，则通过光谱光度法测定样品。打开荧光分光光度计并设置数据采集参数，激发波长为 488 纳米，发射波长为 520 纳米。

还要将仪器设置为每分钟读取一次读数，持续一小时。先用蒸馏去离子水洗涤三个石英晶体比色皿，然后用 100% 乙醇洗涤。通过闪蒸氮气干燥比色皿。

将比色皿标记为 C，对照 1，对照 2 为 C，2 为对照 2，T，接下来，将 24 微升蒸馏去离子水转移到 C 1 中，将 24 微升制备的大肠杆菌粗细胞外混合物转移到 C 2 和 T.向每个 Q vet 中加入 25 微升 2 个 X RB，并将它们放入荧光分光光度计中。五分钟后开始收集荧光数据，加入 1 微升 5 微摩尔 RFS S 1 至 C 2 和 1 微升 5 微摩尔、RFD eec 1 至 T 和 C 1，确保荧光读数不会中断。通过移液混合每种溶液，然后让反应在采集期的剩余时间内继续进行。

以 Excel 文件格式保存数据。然后将数据传输到个人计算机并使用 Excel 创建图形图像。用于 Spectra 分析的反应混合物相同。

光度法可用于凝胶电泳分析。采集 1 小时后。从分光光度计中取出比色皿，并将溶液转移到新的微量离心管中。

通过加入 5 微升 3 摩尔乙酸钠和 125 微升 100% 乙醇来淬灭反应。通过涡旋混合每种溶液，并在孵育离心机后将试管放入零下 20 摄氏度的冰箱中 1 小时。将反应物在 4 °C 下以 11， 000 G 混合 20 分钟，然后通过移液小心地去除上清液。

使用 DNA 浓缩仪干燥沉淀 10 分钟。加入 20 μL 凝胶上样缓冲液并短暂涡旋。用台式离心机短暂离心。

接下来，运行后每孔加载 10 微升 10% Dage 凝胶的反应样品。取下玻璃板并用自来水彻底清洗。要去除任何凝胶碎片，请用 Kim 抹布擦拭板。

使用台风扫描仪扫描凝胶板的荧光。使用 Image quant 软件分析生成的图像，以评估系统的灵敏度。连续稀释的培养物生长的时间越来越长。

为了确定检测单个细菌所需的最短潜伏期，准备 10 个含有 2 毫升 lb 的培养管，每个培养管接种每毫升 100 微升 2 CFU 的大肠杆菌甘油原液，并在 37 摄氏度下以 250 RPM 振荡孵育 4、8、12、16 和 24 小时。从每个接种的培养管中收获 300 微升，因为当时收获的样品可能没有可检测的细菌。要点 4 8 12.

让剩余的培养物生长 24 小时，以鉴定含有细菌的培养物。测量 OD 600 并通过 11， 000 G 离心 5 分钟来沉淀细胞。将含有 CEMS 的上清液转移到新鲜的 1.5 毫升微量离心管中，并在零下 20 摄氏度下储存直至第二天使用。

检查培养物的生长情况。接种后，10 种培养物中只有 1 种或 2 种可能含有大肠杆菌，其余试管中不含任何细胞。在指定时间点使用从阳性培养物中回收的 CEMS 为了用 RFD EEC one 制备切割反应，如前所述使用 DAGE 凝胶电泳分析反应混合物，RFD EEC one 和 RF SS one 探针都是通过将 DNA 酶部分酶连接到底物上来制备的。

然后通过光谱法评估 CEM EEC 和 RFD EEC one 或 RF SS one 的 FS one 相互作用。从这里可以看出。R-F-D-E-C one 在添加 CEM ec 后产生高水平的荧光信号。

与此形成鲜明对比的是，R FS S one 没有产生强烈的荧光信号。因此 RFD EEC 的荧光产生功能 1.接触 CEM 后，对 EC 进行排序。

特异性验证观察到的荧光增加是由于 RNA 键的切割造成的。通过 RFD eec 的 dage 裂解分析反应混合物，预计 0.25 摩尔氢氧化钠会生成 2D NA 片段，一个保留 Fluor 的 5 个引物片段和一个保留淬灭剂的 3 个引物片段。从这里可以看出。

RFD EEC CEM EEC 反应混合物确实产生了预期的切割产物。此外，只有 UNC 裂解的 R-F-D-E-C one，荧光成像可以检测到五质片段。为了检查 RFD EEC 的特异性，使用仅从其他几种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌收集的 CEMS 进行一次荧光测定。

含有 CEM EC 的样品产生荧光增加。与其他细菌的 CEMS 缺乏交叉反应性表明 R-F-D-E-C one 对大肠杆菌具有高度选择性，以确定检测稀释成每毫升 1 CFU 的单个大肠杆菌细胞大肠杆菌所需的最短培养时间，在 100 微升中用生长培养基培养 4、8、12、16 和 24 小时。所得 CEMS 与 R-F-D-E-C 1 混合并切割通过 dage 进行评估，如下所示。

Dage 测定的图像表明 R-F-D-E-C 1 未产生预期的切割产物。当与 CEM 反应时。在生长 4 小时和 8 小时时收集 ECS，表明一旦掌握，需要 12 小时的培养时间。

该技术的关键组成部分是，如果执行得当，基于 DA 酶的测定可以在 60 分钟内完成 在此发展之后。该程序为生物分析领域的研究人员探索用于检测多种细菌病原体的同种异体 DNA 酶铺平了道路。