Name: 大鼠胚胎神经细胞的分离和培养:一个快速议定书 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学习从大鼠胚胎中快速分离和培养海马及皮层神经细胞的无血清培养方法。该技术可获得高纯度神经元单细胞悬液，适用于神经科学研究中的免疫化学、核酸制备和电生理实验。

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感谢Jonna Ellis提供的编辑协助。本项目由美国国家心理健康研究所资助，资助编号为R01MH079751（项目负责人：F. Peruzzi）。本内容仅由作者负责，不代表美国国家心理健康研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 多聚-D-赖氨酸（PDL）：制备
<ol>
	<li>向5 mg聚-D-赖氨酸（PDL）中加入5 ml无菌去离子水（ddH2O），配制成1 mg/ml的储备液。</li>
	<li>通过移液枪反复吹打混匀储备液。</li>
	<li>立即使用，或将聚-D-赖氨酸溶液储存于2–8 °C。</li>
</ol>
2. 多聚-D-赖氨酸（PDL）：包被塑料细胞培养皿
<ol>
	<li>用无菌 ddH2O 将 PDL 储存液稀释至终浓度为 10 μg/ml。</li>
	<li>取足量溶液加入 60 mm 培养皿中，以覆盖整个培养表面（60 mm 培养皿加 3 ml）。</li>
	<li>轻轻摇动，确保培养表面均匀包被。</li>
	<li>将包被好的培养板在室温（RT）孵育过夜。</li>
	<li>次日（通常为解剖当天），用移液器吸除聚-D-赖氨酸溶液，并用 3 ml 无菌 ddH2O 快速洗涤一次，重复该步骤一次。第二次洗涤后，彻底吸除残留液体。</li>
	<li>培养板可在 4 °C 保存长达三周。</li>
</ol>
3. 聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白：玻璃双室载玻片的制备与包被
<ol>
	<li>将 PDL（1 mg/ml）和层粘连蛋白（laminin，1 mg/ml）的储存液用无菌 ddH2O 稀释，分别配制成终浓度为 10 和 5 μg/ml 的混合溶液。</li>
	<li>取足量溶液加入玻璃双孔培养板的孔中，确保完全覆盖培养表面（每孔加入 1 ml，适用于双孔玻璃培养板）。</li>
	<li>轻轻摇动，确保培养表面均匀包被。</li>
	<li>将包被好的培养板在室温下孵育过夜。</li>
	<li>次日，用移液器吸除 Poly-D-Lysine-Laminin 包被液，并用 1 ml 无菌 ddH2O 快速洗涤两次；第二次洗涤后，彻底吸除残留液体。</li>
	<li>包被后的培养板可在 4 °C 保存最多三周。</li>
</ol>
注意：任何玻璃培养皿载玻片均可按照本方案进行包被。我们通常使用双孔载玻片，因为每张载玻片可同时提供对照和实验组的实验设置（例如，未处理 versus 处理、未转染 versus 转染）。
4. 神经元分离与培养
<ol>
	<li>将以下试剂在37°C水浴中预热 37 °C 水浴锅：
	<ul type="disc">
		<li>TrypLE Express，原装100 ml瓶装。</li>
		<li>Neurobasal/B27 完全培养基（参见 表 I). 加热的体积取决于需要铺板的培养皿数量（例如，10个60 mm的培养皿需要30 ml）。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>向四个60 mm培养皿中各加入3 ml冷的Hibernate E溶液，并向一个15 ml BD Falcon高透明度聚丙烯锥形管中加入13 ml。</li>
	<li>加入25–30 ml冷的解剖液（参见 表 II，Olimpia Meucci 博士，个人通讯）加入三个 100 mm 培养皿中。这些含有大量培养基的培养皿将用于胚胎从羊膜囊中取出后立即进行清洗（步骤 4.7 和 4.8）。</li>
	<li>通过 CO 对妊娠 17 天的孕鼠实施安乐死2 根据《公共卫生服务政策》关于实验动物的人道护理与使用的规定，并在机构批准的动物护理与使用方案下进行。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒下腹部，用剪刀沿中线剪开皮肤和肌肉，暴露子宫和胚胎。</li>
	<li>取出所有胚胎，置于含有过量冷解剖液（25–30 ml，见步骤4.3）的无菌100 mm培养皿中。</li>
	<li>用小型剪刀从羊膜囊中剪取胚胎，并将其置于第二个含有冷解剖液的100 mm培养皿中。</li>
	<li>在室温下轻轻倾斜100 mm培养皿，洗涤胚胎5–10秒。随后，将洗涤后的胚胎转移至第三个含有解剖液的100 mm培养皿中。通常用过量的解剖液洗涤两次即可完全去除血液残留。如有必要，可使用一个新的含有25–30 ml冷解剖液的100 mm培养皿再洗涤一次。</li>
	<li>使用体视显微镜和弯头镊子，通过拉开皮肤和颅骨取出每只大鼠胚胎的脑组织。将完整脑组织置于盛有冷Hibernate E培养基的60 mm培养皿中（通常每皿不超过5个脑组织）。将这些培养皿置于冰上保存。</li>
	<li>一次取一个培养皿，在解剖显微镜下分离半球，并分离大脑皮层，去除中脑和脑膜。</li>
	<li>可选：沿中线切开脑组织，取出海马体，并按照以下步骤分离海马神经元。</li>
	<li>将所有解剖得到的皮层组织收集到一个含有13 ml冷Hibernate E培养基的15 ml透明锥形管中。将大脑皮层组织置于冰上，直至所有解剖操作完成。由于海马体积较小，解剖所得的海马可收集于1.5 ml离心管中，而非15 ml管。如有需要，此时可将皮层或海马组织转移至含有1 ml Hibernate E + 2% B27 + 庆大霉素的冻存管中50 μg/ml) + 两性霉素B（250 ng/ml），每瓶加入2-4个大脑皮层或2-4个海马组织。脑组织可保存于 4 °C 在避光条件下最多可保存一周（更长时间尚未测试）。必要时，使用精细镊子将脑组织转移至含有 Hibernate E 的 15 ml 管中，随后按照以下方案分离神经元。</li>
	<li>将试管转移至组织培养罩中。让皮质组织沉降到试管底部，然后小心移除上清液。</li>
	<li>向15 ml锥形管中加入13 ml新鲜的Hibernate E培养基，静置使皮质组织沉降至管底，小心吸除上清液。重复此步骤2次，最后一次洗涤后，小心彻底移除所有培养基。</li>
	<li>通过向脑皮层中加入1-2 ml温热的TrypLE Express（根据皮层数量调整用量；若用于海马体分离，则使用较少体积）进行酶消化。用Parafilm密封离心管管口，并将离心管漂浮于水浴中 37 °C 水浴10分钟。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒管子后打开管盖，加入10 ml Hibernate E溶液。让皮层组织沉降至管底，吸去上清液。重复此步骤三次，以彻底清除TrypLE Express。最后一次步骤中，小心吸除所有培养基。</li>
	<li>用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管（直径约1 mm），在2 ml Neurobasal/B27完全培养基中轻轻吹打匀浆4–5次。注意避免产生气泡。</li>
	<li>用直径更小的无菌玻璃巴斯德移液管（即直径约为1/2-3/4 mm的移液管）重复吹打4-5次。切勿使用比此更细的巴斯德移液管，否则会破坏细胞。</li>
	<li>让残留的组织碎片（通常极少或没有）自然沉降。</li>
	<li>将上层单细胞悬液转移至新的15 ml离心管中，留下已沉淀的组织碎片。用Neurobasal/B27完全培养基将细胞悬液进一步稀释至10–12 ml。</li>
	<li>充分混匀，并通过加入适当溶液稀释细胞以进行计数 10 μl 细胞悬液的量至 490 μl 50倍计数溶液（见 表 III在1.5 ml Eppendorf离心管中。</li>
	<li>将细胞以 5.0 × 10⁵ 个/孔的密度接种于 PDL 包被的培养板中4/cm2. 如果要进行核转染，我们建议以较高浓度接种细胞（8-10 × 104/cm2).</li>
	<li>通常情况下，每次实验解剖9-10只胎鼠，因为大约13 x 106 每个E17胎鼠可获得神经元。若需要更多胚胎，需确保整个操作过程不超过两小时。</li>
	<li>如需要，分离后24小时 10 μM 可向每孔中加入阿糖胞苷（cytosine-β-D-arabinofuranoside, AraC），以抑制胶质细胞增殖。然而，此步骤并非必需，因为根据制造商说明（Invitrogen/Gibco），Neurobasal/B27 培养基本身即可抑制胶质细胞增殖。</li>
	<li>神经元在培养4-5天后可用于实验 体外，尽管具体时间取决于所需的分化阶段。我们已将神经元培养长达4周，未观察到存活率显著下降（图1).</li>
	<li>长期培养时，每周更换一次培养基，使用新配制的Neurobasal/B27完全培养基。</li>
</ol>
5. 代表性结果
培养在玻璃腔室载玻片上的神经元可进行免疫细胞化学染色。图1展示了一张典型的图像，皮层神经元在培养五天后固定，并用抗MAP-2抗体进行免疫标记，以显示神经元的突起结构。
图2展示了大鼠海马神经元在培养3周后的代表性图像。通过MAP-2免疫标记（MAP-2神经元标志物，小鼠单克隆抗体克隆AP-20，Gene Tex，Irvine，CA）突出显示完全分化细胞的神经元形态，标记步骤遵循此前所述的标准操作流程1。图像使用配备EXI aqua相机（Qimaging）、电动Z轴和SlideBook5采集/去卷积软件（Intelligent Imaging Innovations, Inc.，Denver，CO）的Nikon Eclipse E400正置荧光显微镜进行观察。每幅图像的三维图像序列经去卷积处理合并为一幅二维图像，并通过将信号截断值调节至接近最大强度以提高分辨率。
图3显示了神经元培养物的纯度。蛋白裂解物来源于DIV7大鼠神经元培养物（ctx）和一例人脑胶质母细胞瘤（GBM）样本。如预期所示，神经元裂解物对神经元蛋白MAP-2呈强阳性，对星形胶质细胞标志物GFAP呈阴性；而GBM蛋白裂解物对MAP-2呈阴性，对GFAP呈阳性。
尽管在我们的实验方案中，我们已使用Hibernate E作为解离和冲洗介质多年，但最近我们探索了其另一种非常实用的用途，即用于保存脑组织以供后续使用。 图4 说明若干天 体外 5（DIV5）培养的皮层神经元，源自于皮层组织分离的大鼠皮层神经元 4 °C 在从胚胎中初次分离后，于 Hibernate E + B27 培养基中培养一周。神经元接种于经多聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白（laminin）包被的双室玻璃载片上，具体方法如前所述。所获图像使用 SlideBook5 采集/去卷积软件进行去卷积处理，方法如上所述（图2).
<img alt="显示神经元结构和树突荧光分析的神经细胞荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 皮层神经元转染 pmaxGFP（Amaxa, Lonza, Walkersville, MD）并用红色标记的 MAP-2 抗体进行免疫染色的代表性图像。原始放大倍数为 100×。
<img alt="神经元结构，荧光显微镜图像，展示神经元连接和突触网络。" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 培养 3 周后海马神经元的 MAP-2 免疫标记代表性图像，红色显示。DAPI 染色（蓝色）显示细胞核。原始放大倍数为 40×。
<img alt="大脑皮层和胶质母细胞瘤样本中MAP2、GFAP和GRB2蛋白分析的Western印迹示意图。" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. Western印迹显示神经元细胞培养物的纯度。将30 μg大鼠神经元和人胶质母细胞瘤（GBM）蛋白裂解液进行电泳分离，并按标准流程1进行Western印迹分析。抗MAP-2抗体为Cell Signaling（美国马萨诸塞州丹弗斯）提供的兔多克隆抗体，抗GFAP抗体为Chemicon（Millipore，美国马萨诸塞州比勒里卡）提供的鼠单克隆抗体，抗GRB2鼠单克隆抗体购自BD Transduction Laboratories（美国马里兰州斯帕克斯）。GRB2用作上样对照。
<img alt="Neural cell cultures; fluorescence microscopy; cell morphology; neuron imaging analysis; panel comparison." src="/files/ftp_upload/3965/3965fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 代表性图片（各时间点） 体外 5（DIV5）日龄大鼠皮层神经元，来源于置于Hibernate E + B27中的皮层组织 4 °C 解剖后一周。A) 在玻璃双室载玻片上培养的神经元的相差显微图像，原始放大倍数20倍。B) 免疫荧光显示神经元突起中MAP-2的表达（绿色）；该培养物对星形胶质细胞标志物GFAP呈阴性。DAPI染色（蓝色）显示细胞核。原始放大倍数40倍。

<ol><li>Aprea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-mediated+binding+of+human+immunodeficiency+virus-1+Tat+to+the+cytoskeleton+causes+proteasomal-dependent+degradation+of+microtubule-associated+protein+2+and+neuronal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage.</a> J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).</li>
<li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+rat+post-natal+and+fetal+brainstem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).</li>
<li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+serum-free+culture+of+late+fetal+and+early+postnatal+rat+brainstem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+B27%2Fneurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum%2C+substantia+nigra%2C+septum%2C+cerebral+cortex%2C+cerebellum%2C+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).</li>
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<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+differentiation+of+adult+neuronal+progenitor+cells+transplanted+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).</li>
<li>Keyser, D. O., Pellmar, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+in+the+hippocampus%3A+critical+role+for+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells.</a> Glia. 10, 237-243 (1994).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 (1997).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述的大鼠海马和皮层神经元的分离与培养方法，可实现在化学成分明确的培养基中进行近乎纯化的神经元培养实验（图3）。尽管已有文献报道过在无血清培养基中培养近乎纯化神经元的方案2,3,4，但我们的方法进行了若干重要改进。与传统方案（如Banker等）5不同，我们使用TrypLE Express替代胰蛋白酶，这是一种更为温和的细胞解离酶。此外，我们省略了两个可能影响神经元完整性的步骤：在酶消化前对皮层或海马组织进行机械切碎，以及使用DNase。同时，在Hibernate E培养基中进行胚胎组织解剖（步骤4.2）有助于维持细胞的活性与健康状态。Hibernate E是一种可在常氧二氧化碳水平下维持神经组织或细胞活性的营养培养基（Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY）。该培养基最初用于运输分离的脑区组织（如海马、纹状体和皮层），也可在神经组织分离过程中维持脑组织活性，或在显微观察、电生理记录及流式细胞术期间保持神经元的健康状态。事实上，图4展示了大鼠皮层神经元在玻璃双室载玻片上...

<table><tbody><tr><td>Neurobasal</td><td>98%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>2%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>0.5 mM</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 I. Neurobasal/B27 完全培养基&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>16 mM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>22 mM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>10 mM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>160 mM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>5 mM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>1 mM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>0.22 mM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>50 &amp;#956;g/ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>250 ng/ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH</td><td>7.4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>渗透压</td><td>320–330 mOsm</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 II. 解剖用培养基&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>Neurobasal/B27 完全培养基</td><td>240</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染液</td><td>250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>总量</td><td>490</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 III. 50 倍计数溶液&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>Hibernate E</td><td>Brainbits</td><td>767171</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>200 mM Glutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的 TrypLE Express</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>盐酸阿糖胞苷（Cytosine-&amp;#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白 1 mg/ml</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染液</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 IV. 特定试剂&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>大号镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>尖头镊</td><td>Moria</td><td>MC40B</td><td></td></tr><tr><td>微型尖头镊</td><td>Moria</td><td>MC31</td><td></td></tr><tr><td>锋利剪刀</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6820</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖弯头剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14067-11</td><td></td></tr><tr><td>双室玻璃培养皿</td><td>Lab-Tek</td><td>154461</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 冻存管</td><td>Nalge Nunc international</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 V. 特定设备&lt;/strong&gt;.</td></tr></tbody></table>

大鼠胚胎神经细胞的分离与培养：一种快速方案

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

我们介绍一种快速分离和培养E15-17大鼠胚胎海马或皮层神经元的方法。该方法也可成功用于小鼠和人原代神经元及神经前体细胞的分离。分离得到的神经元可在无血清培养基中维持数周。这些培养物可用于核转染、免疫细胞化学、核酸制备以及电生理学实验。较成熟的神经元培养物也可通过慢病毒转导实现高效转染，而使用磷酸钙法或脂质体（如Lipofectamine）等脂质介导方法的转染效率则较低。

我们介绍一种从啮齿类动物胚胎中快速分离和培养海马及皮层神经元的方法。该方案使我们能够开展需要近乎纯化神经元培养的实验。

我们介绍一种快速分离和培养E15-17大鼠胚胎海马或皮层神经元的方法。该操作步骤可应用于……

本实验的总体目标是在无血清条件下分离并培养皮层或海马神经元。首先通过解剖大鼠胚胎获取皮层或海马组织，这是实现该目标的第一步。第二步是将脑组织与三重酶（triple express）共同孵育，以进行温和的酶消化。接下来，将使用Hibernate E缓冲液冲洗组织，并进行机械性吹打，加入完全培养基。为了获得单细胞悬液，最后一步是计数并接种解离的神经元至多聚赖氨酸包被的培养皿，或多聚赖氨酸与层粘连蛋白共同包被的玻璃载片上。最终，该方法可在无血清且无胶质细胞支持的条件下实现神经元的分离与培养。神经元培养可用于免疫化学、核酸制备以及电生理学研究。与现有方法相比，该技术的主要优势在于我们用一种更温和的酶替代了胰蛋白酶。此外，在酶消化前省略了组织的机械分离步骤，同时不再使用DNA酶处理。此外，解剖得到的皮层或海马组织可在4°C的休眠培养基中保存长达一周，之后再进行解离。配制PDL溶液时，首先将5毫升无菌双蒸水加入5毫克PDL中，配制成1毫克/毫升的储存液。通过移液器反复吹打混匀储存液，然后立即使用，或将其保存在2至8°C条件下。为了包被培养皿，将PDL储存液用无菌双蒸水稀释至终浓度为每毫升10微克。随后，用移液器将3毫升溶液加入60毫米的培养皿中，以覆盖整个培养表面。之后，轻轻晃动培养皿以确保培养表面均匀覆盖。然后在室温下孵育过夜。第二天，通过抽吸去除多聚赖氨酸（PDL）溶液。简而言之，用三毫升无菌双蒸水将培养皿清洗两次。第二次清洗后，通过抽吸完全去除水分。在此步骤中，将聚-D-赖氨酸（PDL）储存液（1 毫克/毫升）和层粘连蛋白储存液（1 毫克/毫升）用无菌双蒸水混合，分别稀释至终浓度为 10 微克/毫升和 5 微克/毫升。接下来，将足量溶液加入玻璃双室载玻片的孔中，以覆盖培养表面。然后轻轻摇动腔室，确保涂层均匀。之后，将包被好的培养皿在室温下孵育过夜。第二天，用抽吸法去除PDL层压包被溶液。简要地，用一毫升无菌双蒸水洗涤培养皿两次。第二次洗涤后，通过抽吸完全去除水分，在此步骤中，将Trip LE Express和Neurobasal B27完全培养基在37摄氏度水浴中预热。然后向四个60毫米培养皿中的每一个加入3毫升冷的Hibernate E溶液，并向一个15毫升BD Falcon高透明度聚丙烯锥形管中加入13毫升。随后，向三个100毫米培养皿中的每一个加入25至30毫升冷的解剖液，用于在胚胎从羊膜囊取出后立即进行洗涤。接下来，处死一只E17期的妊娠大鼠，并用70%乙醇喷洒其下腹部。然后用剪刀沿中线切开皮肤和肌肉。为暴露子宫和胚胎，取出所有胎鼠并置于无菌的100毫米培养皿中，培养皿内盛有过量预先准备的冷解剖液。随后，使用一把小剪刀将胚胎从羊膜囊中剪下。然后将其放入第二个含有冷解剖液的100毫米培养皿中。在室温下轻轻倾斜培养皿，清洗胚胎5到10秒。随后，将清洗后的胚胎转

isolation-and-culture-of-rat-embryonic-neural-cells-a-quick-protocol

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大鼠胚胎神经细胞的分离和培养：一个快速议定书“

本文介绍了一种从脊髓中分离小鼠胚胎运动神经元的替代方法。该方法基于以下原理：凝集素能够与低亲和力神经生长因子受体p75NTR结合。这种基于凝集素的预铺板技术可实现与针对p75NTR的特异性抗体相似的纯化效果。...

基于凝集素的小鼠胚胎运动神经元的分离与培养

从神经管中分离胚胎神经嵴有助于利用 体外...

从小鼠胚胎神经管中分离和培养神经嵴细胞

本视频介绍了一种从成年大鼠脊髓室管膜下组织中分离神经干细胞/前体细胞的方法。该技术包括将组织碎片置于含有蛋白水解酶的溶液中孵育，以破坏细胞外基质并释放细胞。随后，将释放的细胞接种于含有特定生长因子的培养基中，以促进神经干细胞/前体细胞的增殖，并诱导其聚集成三维神经球。...

从成年大鼠脊髓室管膜下区分离神经干细胞前体细胞

该视频展示了从小鼠胚胎中脑分离和培养多巴胺能神经元的过程。分离出的腹侧中脑组织通过酶消化法进行解离。获得的多巴胺能神经元被收集并转移至多孔板内的微岛结构中。细胞在多巴胺能神经元培养基中孵育，以维持其在微岛内的高密度生长状态。...

原代小鼠中脑多巴胺能神经元的分离与培养

本文描述了一种建立共培养体系的方案，该体系包含由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的神经元、原代皮层神经元以及星形胶质细胞。该共培养系统可用于检测新生成的、由iPSCs衍生的神经元与已存在的表达光敏通道蛋白-2（channelrhodopsin-2）的皮层神经元之间突触连接和神经回路的形成。...

一种用于评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法

成年哺乳动物脊髓中含有可分离并在体外扩增培养的神经干细胞/祖细胞（NSPCs）。本实验方案描述了从大鼠及人类器官移植供体的成年脊髓室管膜下区获取、分离、培养以及传代NSPCs的方法。...

从成年大鼠和人类脊髓室管膜下区分离神经干细胞/前体细胞

我们修改并实施了一项先前发表的方案，该方案描述了将人 诱导 多能干细胞（hiPSCs）快速、可重复且高效地分化为兴奋性皮层神经元的方法12。具体而言，我们的改进可实现对神经元细胞密度的控制，并可在微电极阵列上应用，以在神经网络水平上检测其电生理特性。...

利用微电极阵列测量网络活性的诱导多能干细胞快速神经元分化

本文介绍一种从E13小鼠胚胎神经节隆起中分离神经干细胞的新型显微手术技术。...

小鼠胚胎神经干细胞的分离与培养

本文介绍了一种用于神经元和胶质细胞中钙离子（Ca2+）成像的实验方案，可实现亚细胞水平上Ca2+信号的解析。该方法适用于所有能够表达基因编码Ca2+指示剂的细胞类型。...

局部钙信号的分离2+ 通过膜靶向Ca在培养细胞中的信号2+ 指示剂

本文描述了从大鼠颈上神经节中分离和培养胚胎期交感神经元的方法。同时提供了用于免疫细胞化学染色以及制备神经元提取物以进行质谱分析的详细实验方案。...

从胚胎颈上神经节培养大鼠交感神经元用于形态学与蛋白质组学分析

本文介绍一种利用特定培养基的简单方法，可从胚胎皮层高效且可重复地建立富含神经元和星形胶质细胞的培养物，或神经元-胶质细胞共培养物。...

一种用于研究缺血过程中神经元-胶质细胞相互作用的细胞培养模型

学习从大鼠胚胎中快速分离和培养海马及皮层神经细胞的无血清培养方法。该技术可获得高纯度神经元单细胞悬液，适用于神经科学研究中的免疫化学、核酸制备和电生理实验。

大鼠胚胎神经细胞的分离与培养：一种快速方案

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