大鼠胚胎神经细胞的分离和培养:一个快速议定书"
May 24th, 2012
我们描述了一个快速的方法分离和培养的海马和皮层神经细胞从老鼠胚胎。该协议允许在几乎纯神经细胞需要我们进行实验。
该程序的总体目标是在无血清条件下分离和培养皮质或海马神经元。这是通过首先解剖大鼠胚胎以获得皮层或河马 campi 来实现的。第二步是将脑组织与 trip le express 一起孵育，以进行温和的酶消化。
接下来，用冬眠 E 和机械研磨的完全培养基冲洗组织。为了获得单细胞悬液，最后一步是将解离的神经元计数并铺在poly de 赖氨酸包被的培养皿或poly de 赖氨酸、层粘连蛋白包被的载玻片上。最终，这种方法允许在无血清条件下分离和培养神经元，无需神经胶质细胞支持。
神经元培养物可用于核酸免疫化学、制备和电生理学。与现有方法相比，该技术的主要优点是我们用更温和的酶代替了胰蛋白酶。我们省略了酶消化前的组织方法，以及使用 DN a 的处理。
此外，解剖的 Cortes 或 hippo 可以在 4 度的冬眠培养基中储存长达一周，然后再解离。首先制备 PDL 溶液时，将 5 毫升无菌双蒸水加入 5 毫克 PDL 中，以获得每毫升 1 毫克的储备液。通过多次移液混合储备液，然后立即使用或储存在 2 至 8 摄氏度。
涂在培养皿上。用无菌双蒸水稀释 PDL 储备液至终浓度为 10 μg/mL。接下来，将 3 毫升溶液移液到 60 毫米的培养皿中，以覆盖培养表面积。
之后，摇动培养皿以确保培养表面均匀涂层。然后在室温下孵育过夜。第二天，通过抽吸去除 PDL 溶液。
简而言之，用 3 毫升无菌双蒸水清洗盘子两次。第二次洗涤后，通过抽吸完全去除水分。在此过程中，将 1 毫克/毫升的 PDL 储备液和 1 毫克/毫升的层压储备液在无菌双蒸水中混合至终浓度分别为 10 和 5 微克/毫升。
接下来，将足够的溶液移液到玻璃双室载玻片的孔中以覆盖培养表面。然后轻轻摇动腔室以确保涂层均匀。之后，将涂层培养皿在室温下孵育过夜。
第二天，通过抽吸去除 PDL 层压涂层溶液。简而言之，第二次洗涤后，用 1 毫升无菌双蒸水将盘子清洗两次。在此步骤中，通过抽吸完全去除水，温热旅行 LE express 和 neuro basal B 27，在 37 摄氏度的水浴中完全培养基。
然后向四个 60 毫米培养皿中的每一个中加入 3 毫升冷冬眠 E 溶液，向 15 毫升 BD Falcon 高透明度聚丙烯锥形管中加入 13 毫升。之后，向三个 100 毫米培养皿中的每一个中加入 25 至 30 毫升冷解剖培养基，以便在胚胎从羊膜萨克斯管中取出后立即清洗胚胎。接下来，处死一只 E 17 定时怀孕大鼠，并用 70% 乙醇喷洒其下腹部。
然后用剪刀在皮肤和肌肉内侧切开。要暴露子宫和胚胎，请取出所有胎儿并将它们放入含有过量冷解剖的 100 毫米无菌培养皿中。较早制备的培养基。
然后，用一把小剪刀从羊膜袋中剪下胚胎。然后将它们放入第二个装有冷解剖培养基的 100 毫米培养皿中。在室温下轻轻倾斜培养皿 5 到 10 秒，清洗胚胎。
随后，将冲洗过的胚胎转移到第三个 100 毫米的培养皿中，其中包含解剖培养基 在立体显微镜下，用一对弯曲的镊子拉出皮肤和头骨，提取每个大鼠胚胎的大脑。将大约 5 个大脑放入一个 60 毫米的培养皿中，加入冷冬眠 E，然后将培养皿放在冰上。在解剖显微镜下一次取一个盘子。
分离半球并隔离大脑皮层。然后切除中脑和脑膜。将所有解剖的皮质收集在含有 13 毫升冷冬眠物的 15 毫升透明锥形管中。
E.将大脑皮层留在冰上，直到所有解剖完成。将试管转移到组织培养罩上。然后让皮质沉淀在管底部，并小心地去除 supra natin。
接下来，将 13 毫升新鲜冬眠 E 添加到 15 毫升锥形管中。让皮质沉淀在试管底部，并小心地去除上清液。同样，再重复这些步骤两次，最后一次洗涤后，小心地去除所有培养基。
接下来，通过添加 1 到 2 毫升 WARM TRIP le express 来消化大脑皮层。用 paraform 密封管盖。然后将试管放入 37 摄氏度的水浴中 10 分钟。
之后，用 70% 乙醇喷洒试管。然后加入 10 毫升冬眠的 E.让皮质沉淀在管底并去除上清液。重复此步骤 3 次以洗掉行程 Le express。
在最后一步中，小心地删除所有媒体。在 2 毫升神经基础 B 27 完全培养基中轻轻研磨皮质约 4 至 5 次。使用火抛光玻璃牧场巴斯德，用直径较小的无菌玻璃巴斯德移液管将皮质再研磨四到五次。
然后让剩余的组织块沉淀。之后，将上层单细胞悬液转移到新的 15 毫升试管中，留下沉淀的组织块。然后用神经基础 B 27 完全培养基进一步稀释细胞悬液至 10 至 12 mL，以稀释细胞进行计数。
在 1.5 mL eend 管板中，将 10 μL 细胞悬液添加到 490 μL 50 x 计数溶液中。PDL 包被板上的细胞密度为每平方厘米 50， 000 个细胞。神经元在体外 4 到 5 天后可用于实验。
此处显示的是受 P max GFP 影响的皮质神经元核和用红色映射 2 抗体标记的免疫的代表性图像。这里显示了从皮层中分离的大鼠皮层神经元的五天体外培养，这些神经元在从胚胎中原始解剖后，在冬眠的 E 加 B 27 中在 4 摄氏度下保持了一周。如前所述，将神经元接种在涂有 PDL 和层粘连蛋白的玻璃双室载玻片上。
绿色免疫荧光表示神经元过程中 map 2 的表达，细胞核以蓝色表示。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约两个小时内完成。观看此视频后，您应该对如何在无血清、无 Anglia 的条件下分离和培养神经元有很好的了解。
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概览
本文介绍了一种从啮齿动物胚胎中分离和培养海马和皮层神经元的快速方法。该协议旨在促进需要在无血清条件下进行的几乎纯神经元培养实验。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞培养
- 神经元分离
背景
- 神经元的分离对于研究其特性至关重要。
- 无血清条件有助于避免变异性。
- 啮齿动物胚胎提供了可靠的神经元来源。
- 以往的方法可能无法获得纯净的神经元培养物。
研究目的
- 开发一种分离皮层和海马神经元的协议。
- 确保培养物几乎纯净且无血清。
- 促进神经科学领域的进一步实验应用。
使用的方法
- 解剖大鼠胚胎以获取脑区。
- 使用trip le express对脑组织进行酶解。
- 冲洗和机械分离组织。
- 计数并将分离的神经元接种到涂层皿上。
主要结果
- 在无血清条件下成功分离神经元。
- 获得适合培养的单细胞悬液。
- 证明了该协议在纯神经元培养中的可行性。
- 实现了无胶质支持的实验。
结论
- 该方法提供了一种可靠的神经元培养方式。
- 它支持神经科学研究中的各种实验需求。
- 未来的研究可以在此协议基础上进行更高级的探究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid generation of serum-free, glial-free primary neuronal cultures from rodent embryos, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. The method provides a reproducible system for assessing compound effects on neuronal function, electrophysiology, and molecular pathways without confounding glial interactions. Cultures maintained for several weeks allow longitudinal phenotypic screening and translational biomarker exploration in disease-relevant neural models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in pure neuronal populations, reducing mechanistic ambiguity in pathway analysis.
- Operational Value: Supports functional target validation through immunocytochemistry, nucleic acid preparation, and electrophysiology readouts.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by permitting nucleofection and lentiviral transduction for overexpression or knockdown studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, serum-free neuronal cultures suitable for high-content imaging and multiwell plate formats.
- Quantitative Outputs: Enables consistent cell plating at defined densities (50,000 cells/cm²) for reproducible dose-response assessments.
- Scalability: Dissected tissues can be stored in Hibernate E at 4°C for up to one week, allowing batch processing and workflow flexibility.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Cortical and hippocampal neurons provide disease-relevant systems for studying neurodevelopmental and neurodegenerative mechanisms.
- Translational Continuity: Serum-free conditions support biomarker alignment and preclinical validation of target engagement.
- Risk Mitigation: Glial-free cultures reduce biological variability, improving confidence in target-specific compound effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling hypothesis testing and biological de-risking prior to lead optimization and preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through immunolabeling of neuronal markers like MAP2 and electrophysiological profiling.
- Screening: Provides assay-ready neuronal monolayers with defined plating density for compound library screening.
- Analytics: Enables quantitative measurement of neurite outgrowth, synaptic protein expression, and neuronal viability as functional readouts.
- Translational Research: Cortical and hippocampal cultures align with brain region-specific disease models for mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Protocol standardization allows cross-project reuse in target validation and assay development pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduction of mechanistic ambiguity through glial-free, serum-defined neuronal systems.
- Operational Value: Standardized dissection, enzymatic digestion with TripLE Express, and poly-D-lysine/laminin coating ensure reproducibility.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing early functional neuronal data on target modulation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on neuronal phenotype and electrophysiological profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue dissection and sterile cell culture techniques.
- Dependent on access to Hibernate E, NeuroBasal B27, TripLE Express, and poly-D-lysine/laminin coating solutions.
- Necessitates standardized coating procedures for culture dishes and glass slides to ensure neuronal adhesion and maturation.
- Adaptation to human iPSC-derived neurons or mouse embryos may require optimization of dissociation times and plating densities.
- Limited to neuronal cultures; does not support glial-neuron co-culture studies without additional protocol modifications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:42
Poly-D-Lysine: Preparation and Coating of the Plastic Cell Culture Dishes
3:03
PDL and Laminin: Preparation and Coating of the Glass Two-chamber Slides
4:07
Neuronal Dissection and Culture
9:40
Results: Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells
10:27
Conclusion
