从化学分层的南极湖泊中建立真核微生物富集培养物并评估其碳固定潜力

本实验的总体目标是从南极邦妮湖中制备原生生物富集培养物，并通过测定碳固定来初步评估其代谢多样性。首先采集邦妮湖中已知原生生物和浮游植物丰度峰值对应的水层样本，随后将湖水样品接种至多种培养基中，在配备温度控制器和光源的培养箱内培养四至六周。

可根据需要将培养物在 4°C 下运输。下一步是从富集培养物中提取粗细胞裂解液。本实验的最后一步是使用放射性同位素测定法检测裂解液中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）活性，以评估其碳固定潜力。

最终，原绿球藻富集培养物显示出自然原生生物群落中碳固定潜力的差异。该方法有助于我们回答有关湖泊微生物生态学的关键问题，例如，微生物真核生物在南极分层湖泊不同阶段碳循环中的作用。

尽管采集水柱样品以进行后续富集培养是常用的技术，但该方法在极端寒冷环境中应用时需进行改进，因为在该环境中可能会出现意想不到的复杂情况。当我思考如何在天然湖水样品中检测Redisco分析法时，首次提出了该方法的设想。由于采样地点所处环境对许多研究人员而言较为陌生，因此该方法的可视化演示至关重要，因为采样步骤难以凭空想象。

从邦尼湖采集样品，该湖是位于南极洲麦克默多干谷地区的众多永久冰封湖泊之一。在对水柱进行采样前约一天，选择并准备采样地点，以便在钻孔和冰孔融化造成的扰动后，使水柱的分层结构得以重新形成。通过GPS确定钻孔位置，以进入水柱进行采样。

首先，使用连接了四英寸 Jiffy 延长杆和切削钻头的 Jiffy 冰钻在冰层上钻孔，以防止钻头在孔中冻结。钻孔时应避免触及下方液态水体，建议在水柱顶部上方约四至六英寸处停止钻进。为便于采样，需将钻孔直径从六英寸扩大至两英尺。

通过使用热海模型孔融器，使加热的聚乙二醇在铜管孔中循环，从而实现融孔。通常在采集水柱样本的前一天进行融孔，耗时最长可达18小时。确保在采样现场备齐所有所需设备和样品储存容器。

采样材料包括一个容量为5到10升的NICU采样瓶、一个带有深度校准缆绳的绞车、每个采样深度所需的足够数量的样品瓶、一个触发装置以及用于样品运输的冷藏箱。应在清晨约早上5:00开始采样，因为湖水过滤工作需在采样当天完成。使用连接至校准手摇绞车的采水器进行采样。

为本研究采集一至五升目标深度的水样。采样深度分别为从冰孔中PI对称水位以下六米、十五米和十八米处。将湖水样品储存于冷藏箱中，并从采样点运送至野外实验室。

使用连接至全地形车的雪橇，样品应在野外实验室进行处理或稳定化。采样后，应立即将样品运送至野外实验室，并开始富集培养物的培养。将0.5至一升湖水浓缩至47毫米、0.45微米孔径的滤膜上。

使用温和过滤法的聚醚砜滤膜进行过滤。若需保留自然群落的多样性，将第二个样品过滤至47毫米、0.45微米孔径的滤膜上。

聚醚砜滤膜在液氮中快速冷冻。将每张滤膜转移至含有约20毫升过滤湖水的50毫升无菌 Falcon 管中，湖水采集自与滤膜相同的采样深度。

将细胞悬液转移至25平方厘米的无菌细胞培养瓶中，用于在不同培养基上进行富集培养。每个采样深度设置多个重复。向每个培养瓶中添加50倍稀释的无菌溶液，培养基包括粗体罗勒培养基、Medium、BG11和F2。

若需培养混合的厌氧生物，需准备两个补充培养的 F2 培养容器，并向其中一个培养瓶中加入两到三粒无菌大米，在温度可控的培养箱中于低温和低光照条件下培养至少四周，然后再运往美国实验室。将富集培养物转移至无菌的 50 毫升 Falcon 管中。在运输申请中注明“禁止冷冻，运输过程中保持低温”。到达美国后，将每种富集培养物各 5 毫升转移至 125 毫升容量的适当生长培养基 45 毫升中。

无菌的锥形瓶，用无菌海绵封口。将富集培养物作为静置培养物，在4摄氏度、低光照的环境培养箱中维持培养，并每30天将培养物转接到新鲜培养基中。开始细胞裂解液提取操作时，使用温和的真空负压，将5升富集培养液过滤至直径25毫米的沃特曼GFF滤膜上。

接着，用无菌钢制剪刀将滤膜剪成四到五段。然后用无菌镊子将各片段转移至一个容量为2毫升的螺口管中，管内已加入约占其体积五分之一的0.1毫米直径的

氧化锆二氧化硅珠。向离心管中加入1.25毫升滤液提取缓冲液，然后使用微型珠磨机以48档速度振荡30秒以破碎细胞，随后冰浴1分钟。重复珠磨破碎两次，每次间隔冰浴1分钟，以防止样品在离心前过热。

在4°C、3000 × g条件下，将滤液离心2分钟，以形成松散的GFF滤膜纤维和细胞壁碎片沉淀。取出200 µL上清液，加入800 µL预冷的90%丙酮中。

将剩余的上清液转移至一个1.5毫升的微量离心管中。在分光光度计中于664纳米和647纳米波长处测定可提取的叶绿素A。在4°C、15,000 × g条件下离心两分钟，保留剩余的上清液。

将上清液转移至一支洁净的1.5毫升微量离心管中，注意避免转移不溶性细胞膜沉淀及残留的GFF滤膜纤维。此可溶性细胞裂解液可用于后续的RubisCO羧化酶活性测定，接下来将演示该实验步骤。开始该测定前，取125微升每种可溶性裂解液，转移至已预冷在冰上的1.5毫升螺旋盖微量离心管中。

对于阴性对照样本，向一个1.5毫升带螺口盖的微量离心管中加入125微升可溶性裂解液，但不添加底物。随后对所有样本和阴性对照均进行重复反应。新鲜配制10毫升测定缓冲液，并置于冰上预冷。

将所有样品和阴性对照所需的足够量的检测缓冲液加入一个5毫升离心管中。从这一步开始，所有操作必须在通风橱内进行。向指定的缓冲液中加入C 14标记的碳酸氢钠，并将缓冲液置于冰上保存。

取出含有 C 14 的测定缓冲液 10 微升，加入 1 毫升测定缓冲液中并颠倒混匀进行稀释。将 100 微升稀释后的混合液加入含有 3 毫升 Biosafe II 闪烁计数液的闪烁瓶中，颠倒混匀。使用 Beckman LS 6500 液闪仪测定 C 14 放射性计数，在继续进行测定前，每分钟计数应超过 18,000 次。

当向测定缓冲液中加入足量的¹⁴C标记的碳酸氢钠后，将反应管转移至预设为25°C的干浴中，孵育3至5分钟。接着，向裂解液中加入100 µL测定缓冲液，并在25°C孵育5分钟。5分钟后，向每个样品中加入核酮糖-1,5-二磷酸，并在25°C继续反应5至10分钟。

为终止反应，加入100微升100%的益生菌酸，于2000 × g条件下离心一小时，以去除未掺入的C14。最后，将样品的全部体积转移至含有3毫升生物试剂的闪烁瓶中。加入适量闪烁计数液，测定酸稳定部分的每分钟计数。

通过闪烁计数法测定终产物。采用富集培养法从南极邦尼湖三个不同深度分离出新的冷适应性光合及混合营养型原生生物。使用多种培养基类型以筛选更多样化的生物种类，包括 Bold's Basal 培养基（BBM）、BBMF2Si 培养基、海水培养基以及 BG-11 培养基。

本表中显示的营养物质浓度和光合有效辐射（PAR）代表了样品采集时的环境条件。通过光学显微镜对富集培养物进行显微观察发现，大多数细胞含有叶绿素色素，表明培养物以光能自养型原生生物为主。此外，培养物中还存在多种细胞形态，具体取决于接种物取样的深度以及培养所用的培养基类型。

通过测定富集培养物中rubis酶催化的羧化酶活性最大速率，来间接评估碳固定作用。同时监测潜在的叶绿素a丰度，以估算光合原生生物的生物量，结果如图所示。

尽管所有培养物均在相同的温度条件下培养，但不同富集培养物之间的光固定潜力和光合生物量差异显著。在BBM培养基中培养的富集培养物4和6，以及在BG11培养基中培养的富集培养物13和14，其RubisCO最大活性最高。相比之下，在F/2培养基中富集的19、21和23号培养物，其最大羧化酶活性则低了4至34倍。

这些差异并非由于F2培养物的生物量水平较低所致，因为羧化酶活性是以叶绿素a为基础表示的。此外，Pearson相关性分析显示，Rubisco活性与叶绿素a浓度之间无相关性。接种了来自6米和15米深度湖水的BBM培养物。

富集培养的五号样品中叶绿素A含量最高，而其他所有培养物的叶绿素a含量均相对较低，无论Rubis酶活性如何。一旦掌握，湖泊采样技术约需两小时即可完成。若操作得当，根据采样数量的多少，羧化酶测定同样需要约两小时。按照本实验流程，还可采用其他方法，例如异养酶活性测定，以回答诸如异养微生物出现在哪个深度等进一步的问题。好了，观看本视频后，您应已充分了解如何采集湖泊样品、对其进行富集培养，并测定Rubis羧化酶活性。