使用机器人在油脂中间相高通量膜蛋白的结晶

大家好，欢迎来到膜结构和功能生物学组。我叫 Martin Caffery。这是关于使用内消融或脂质立方相法进行结构化测定的膜蛋白结晶的系列文章中的另一篇。

在第一篇文章 JoVE 1 7 1 2 中，我们演示了如何制备载有蛋白质的立方相，以及如何将粘性和粘性 misa 相手动分配到玻璃夹心板中进行结晶试验。本视频文章将介绍使用介观结晶机器人的方法。机器人具有速度、准确性、精密小型化以及能够在黑暗或低温等不舒适的条件下长时间工作等优点。

机器人如果使用得当，可以大大提高膜蛋白结构和功能研究的生产力。在本视频文章中，我们演示了三种市售机器人的使用。第一个机器人是在膜结构和功能生物学组中开发的，并在参考文献 1 中进行了详细描述。

另外两个最近刚刚推出，为了完整起见，它们包含在此处。准备结晶板设置以自动进行结晶试验，首先要准备玻璃夹层结晶板的底板，参考底板详细描述，首先必须筒仓化，并且必须将创建孔的多孔双棒垫片施加到板上。此处显示了所需的材料。

它们包括玻璃结晶底板、多孔双棒垫片溶液、滚筒或纸巾以及 UE 水烧杯。将板放在工作台上的纸巾上。滴入几滴静置溶液，然后用纸巾均匀分布在板表面。

通过将板完全浸入烧杯中来洗去多余的izing 溶液。将板从放在干纸巾上的烧杯中取出。筒仓面朝上，用纸巾轻轻擦拭即可干燥其裸露表面。

接下来，取下多孔双棒垫片上的保护盖，将垫片贴在玻璃板的筒仓表面。重要的是，垫片必须正确放置在底板上，使左上角以及垫片和板的相邻两侧重合。滚筒或布雷器用于压平底板上的垫片，并在它们之间形成紧密的密封。

在括号中，我们注意到带有多孔垫片的筒仓板可以在市场上买到，如参考部分所述。准备好结晶底板后，我们接下来继续设置和使用 in meso 机器人。如下所述，我们演示了 3 在 meso 机器人中的使用。

在显示的所有案例中，机器人都是在 meso robot one 中设置和用于 20 摄氏度的温度受控室中，这是本视频中演示的第一个 in meso 机器人。文章是在 PI 的实验室开发的，现在已上市。完整的详细信息可以在 参考 部分找到。

此处显示了自动设置结晶试验所需的材料和设备。它们包括一本实验室笔记本、富含蛋白质的 mease，按照第 1 7 1 2 条 Jo 中的描述新鲜制备，并装在汉密尔顿注射器中。带有垫片和配套盖玻片的筒仓式底板、水瓶和纸巾，以及 MISO 机器人。

第一个视图是机器人的甲板清晰无阻。下一个视图是机器人，配有加湿器停放站、结晶底板和含有沉淀剂溶液的深孔块。我们通过将底板放在机器人的甲板上来开始设置。

它有自己的平台，清楚地标有井位置，以便对准底板。车牌应贴上清晰的标签，以便识别。含有沉淀剂溶液的 96 孔模块固定在结晶板旁边机器人甲板上自己的平台上。

小心地剥下塑料天花板盖，打开块。来自加湿器的湿气流被引导流过机器人甲板上的底板 设置机器人。按照制造商的说明初始化机器人。

我们不会在这里详细演示这一点，因为确切的协议会随着时间的推移而变化。从本质上讲，在初始化过程中发生的情况是，机器人上的分液臂在三个正交方向上具有参考位置，x、Y 和 Z.接下来，汉密尔顿注射器中带有分配针头的蛋白质 meza 相连接到机器人的一个手臂上，有关如何准备 meza 相和注射器的全部细节在文章 1 7 1 2 的 Jo 和参考文献 1 中描述， 分配注射器的针尖现在必须与结晶板左手角最上部孔的底部和中心对齐。这对应于井标识符 A 1 与井 A 的底部对齐，作为第一顺序业务。

这是通过在分配手臂后调整高度或 Z 坐标来完成的，同时观察针尖与孔底部的距离。尖端只是接触孔的底部可以通过在平台上用手左右移动板来判断，同时稍微调整分配臂的高度，尖端接触板的分配臂的 Z 坐标被编程为针尖距离该参考 Z 位置几微米， 它对应于底板的表面。接下来激活机器人以完成用户提示的一系列步骤，将针尖定位在 A 孔的中心。

吸头居中的点胶臂的参考 XY 坐标存储在控制机器人的计算机中。它用于定义板上其余孔的中心。在计算机中设置这些参考坐标后，指示 mease 分配臂返回其起始位置，启动注射器。

分配注射器现在必须灌注。这样做是为了确保新鲜的 mease 填充分配针，并且板上的第一个孔接收其完整的 mease 填充。程序中有一个启动命令，用于运行机器人激活。

它使注射器中的柱塞在用户控制下逐步前进。在此过程中，检查针尖是否出现挤出的 meza 期，用组织去除。这样就完成了运行机器人的启动过程。

机器人现在已准备好在自动模式下运行，开始运行。机器人 XAP 程序启动一轮冲洗步骤，其中机器人手臂 2 上的沉淀剂分配头被清洗，并准备从深孔块中吸出沉淀剂溶液，激活机器人上的分配功能开始运动，一次向前八个孔中加载含有蛋白质的孔， 其次是沉淀剂解决方案在交付之间。除臭剂分配臂返回停放位置，将针头末端放入湿润的海绵中，以防止尖端的除臭剂变干。

最常见的是在膜中进行的结晶试验中使用的值。结构和功能生物学组是 50 纳升的 mease 和 800 纳升的沉淀剂溶液。在本演示中运行机器人的程序已设置为两个手臂同时移动。

通过这种方式，可以在 5 分钟内完成 96 孔板的 mease 和 precipant 的加载。板立即装满，机器人手臂返回停放位置。将板从机器人的甲板上取下并放置在平坦的固体表面上。

将盖玻片轻轻地放在底板顶部，与垫片的上部粘性表面接触。重要的是要确保所有 96 个孔都被完全覆盖，盖玻片与底板对齐，并且没有一个盖玻片超出底板的占地面积。滚筒或布雷器用于在盖板玻璃和垫片之间形成紧密而均匀的密封。

在此阶段应检查板，以确保设置正常。人们正在寻找的是平底锅上的煎蛋外观。在每个井中，鸡蛋的轭对应于 meza 阶段。

蛋清是沉淀液，锅的边缘是结晶的周边。嗯，理想情况下，这三者是同心的。该板现在可以放置在温控存储区域以进行晶体生长。

如果不需要设置更多板，则应从机器人的甲板上取出沉淀物块，正确密封并放回仓库。将装有 mease 的注射器从机器人的分配臂上拆下，拆卸其各个部分，包括分配针头和 ferial。用甲醇仔细洗涤并干燥，为下一次使用 In Meso 机器人两蚊 LCP 做准备。

下一个视频剪辑展示了可用于设置中胚结晶试验的蚊式 LCP 机器人。它采用了与本文前面描述的类似的 meph 相位分配系统。然而，对于机器人 1，沉淀物是使用一次性吸头分配的。

仪器本身如下所示。它包括一个甲板，结晶板和沉淀块在其上设置了一个带窗的腔室，用于控制湿度。在此视图中，湿度室上的窗户已打开：一个带有分配头的线轴、一个 mease 分配臂、一个用于确定 meph 相分配针位置的基于激光的传感器。

结晶板位于其上的凸起平台，用于固定沉淀剂筛块的下沉平台。在这个序列中，当仪器打开时，机器人已经看到了一系列初始化动作。编程软件用于设置仪器以使用特定的结晶板和沉淀剂块，并按指定顺序分配固定体积的沉淀剂和沉淀剂。

此类详细信息由制造商提供，此处不会显示。使用机器人设置结晶板的开始如下，如上所述，在 meso robot one 和 Jo of 1 7 1 2 中制备一个带有针头并充满蛋白质的 mease 的 Hamilton 注射器。注射器被夹在机器人的分配臂下。

注射器上针头的 X 和 y 坐标是使用安装在台面上的激光传感器建立的。这是确保在结晶板上每个孔的中心准确分配酶所需的重要步骤。只需按一下控制面板上的按钮，注射器就可以从针头尖端排出 mease。

然后用纸巾去除挤出的混蛋，准备使用机器人加载孔，然后将结晶板安装在机器人的甲板上。用几滴水润湿平台表面以将板固定到位。通过毛细管，从板上取下保护盖，并将板牢固地放置在其平台上，以确保良好的粘附性。

平台上有三个基准点，三个角孔很快位于其中心位置，以确保板相对于分液针尖的正确定位，仪器现在已准备好进入设置周期。这从第二个灌注步骤开始，将 Mease 分配到一个小玻璃板上，然后继续向板中加入新的 Mease。在这个序列中，我们看到机器人首先用 mease 加载，在板上加载一个由 8 个孔组成的垂直柱，然后使用一次性吸头在 mease 推注的顶部分配沉淀剂溶液。

此过程沿板的长度重复 11 次，直到所有孔都充满。整个过程大约需要 5 分钟才能完成。在这个特定的视频中，将剪辑 50 纳升 Mease 和 800 纳升沉淀剂溶液分配到每个孔中。

从放置在工作台上的机器人平台上取下填充的板。盖玻片被应用，板子用胸罩密封，如上所述在 miso robot one 中。正确标记的板现在可以放置在温度受控的环境中，以便在 Meso 机器人 3 Griffin LCP 中进行晶体生长。

最后一段视频展示了 Griffin LCP 机器人在中观结晶试验中的应用。Griffin 采用了与上述机器人 1 类似的 meph 相位分配系统。然而，在这种情况下，所有 96 种沉淀剂溶液都是同时分配的。

仪器本身如下所示。它包括一个用于结晶板和沉淀剂模块的甲板、一个分离器分配臂和一个 Phoenix 96 喷嘴头。对于分配沉淀剂溶液，机器人的运行情况显示在最终视频序列中。

首先向 96 尖端头加载沉淀剂溶液。提供用户定义的延迟，以便于吸取粘性沉淀剂。MEA 阶段按顺序分配到 96 个孔中，该过程大约需要 1 分钟才能完成。

最后，96 吸头将所有 96 沉淀剂溶液同时分配到结晶孔中的 MEA 相推注顶部。整个板加载过程在两分钟内完成。从机器人的甲板上取下填充的板，用盖玻片密封板，并在受控温度条件下储存以进行晶体生长。

通过大分子晶体学进行结构化测定的整个过程的下一步是收获和冷冻冷却晶体，并记录和处理来自它们的 X 射线衍射。这些主题在本系列的单独工作文章中介绍。