Name: 使用机器人在油脂中间相高通量膜蛋白的结晶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 21 s
Description: 了解使用机器人进行膜蛋白油脂中间相高通量结晶的方法。本视频展示三种自动化系统，可提高结构生物学研究中结晶试验的速度、准确性和重现性，助力膜蛋白结构解析。

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许多人为本工作做出了贡献，其中大部分来自膜结构与功能生物学研究组的历任及现任成员。我们向所有参与者致以最诚挚的感谢与谢意。本工作部分得到了爱尔兰科学基金会（07/IN.1/B1836）、美国国立卫生研究院（GM75915、P50GM073210 和 U54GM094599）以及欧盟第七框架计划 COST 行动 CM0902 项目的资助。

1. 准备结晶板
使用机器人进行结晶实验的准备工作，首先需要制备玻璃三明治式结晶板的底板（图2），具体步骤详见参考文献2。底板必须先进行硅烷化处理，然后将带有穿孔的双面粘连垫片贴附到底板上，以形成反应孔。所需材料和耗材详见“材料”部分。
<ol>
 <li> 将玻片置于纸巾上，滴加数滴硅烷化溶液，并用纸巾将其均匀涂布于玻片表面。</li>
 <li> 将玻片浸入盛有水的烧杯中，以去除多余的硅烷化溶液。</li>
 <li> 从烧杯中取出玻片，将其放置在干燥的纸巾上，硅烷化面朝上，并用纸巾轻轻擦拭暴露的表面使其干燥。</li>
 <li> 撕去穿孔双面粘合垫片的保护膜，将垫片粘性面向下贴附于玻璃玻片干燥的硅烷化表面。确保垫片在底板上位置正确，其左上角及相邻两侧边与玻片的对应边缘对齐。</li>
 <li> 使用滚轮或压平辊将垫片在底板上压平，并使其之间形成紧密密封。</li>
</ol>
预组装的板可从商业途径获得（HR3-151，Hampton Research；MD11-55-100，Molecular Dimensions；以及 LCP96T-UVP70U，Swissci）。出于成本考虑，我们更倾向于按照上述方案自行组装板。
2. 原位 机器人 1
本视频文章中演示的第一台in meso机器人是目前MS&amp;FB课题组正在使用的机器人（图3）。有关该机器人的完整详细信息可参见材料部分及参考文献部分5。使用该机器人设置结晶实验所需的材料和设备已在材料部分逐项列出。
<ol>
 <li> 将第1节中准备好的带间隔垫的基板放置在机器人工作台面上。基板应放置在标有孔位的专用平台上，用于基板的对位。基板应贴上标签以便识别。</li>
 <li> 将96孔沉淀剂板固定在机器人工作台面上靠近结晶板的专用平台中。</li>
 <li> 小心地揭开塑料密封盖，打开沉淀剂板。</li>
 <li> 开启加湿器，并将湿润气流导向并横跨机器人工作台面上的基板。加湿器已被证明可减少沉淀剂溶液的蒸发，并提高结晶板上实验的重复性5。当环境相对湿度较低时，可在实验设置前开启加湿器以预先湿润区域；否则，可在开始分配中间相前开启。</li>
 <li> 根据制造商的说明初始化机器人。由于具体操作步骤会随时间变化，此处不详细描述仪器特定的操作流程。初始化过程本质上是为机器人上的中间相分配臂在三个正交方向（X、Y和Z）上设定参考位置。</li>
 <li> 将装有含蛋白中间相的Hamilton注射器（配备分配针）连接至机器人的1号臂（图3）。有关如何制备中间相以及如何将其装入注射器的详细步骤已在参考文献3,7-10中描述。</li>
 <li> 移除结晶基板间隔垫上的上层保护盖，并将板上的孔与基板平台上的对位标记对齐。注意：为便于本视频中观众观察对位步骤，保护盖在演示中保持原位。</li>
 <li> 通过肉眼调整分配臂的高度（Z坐标），使分配针尖与结晶板左上角最上方孔（A1孔）底部对齐。通过轻微调节分配臂高度并左右移动板子，可判断针尖是否刚好接触孔底。</li>
 <li> 在计算机中输入分配臂针尖接触板面时的Z坐标。程序设定分配操作时针尖位于该参考Z位置上方80微米处，此位置对应基板表面。</li>
 <li> 通过肉眼将针尖定位在A1孔中心，并在控制计算机中存储此时分配臂的X、Y坐标作为参考。该坐标将用于定义板上其余各孔的中心位置。</li>
 <li> 使用机器人计算机上的相应指令对注射器进行预灌注，确保新鲜中间相充满分配针，使第一个及后续各孔均能获得足量中间相。用纸巾擦去针尖挤出的多余中间相。</li>
 <li> 启动“运行机器人（X-AP）”程序，开始冲洗循环，清洗机器人2号臂上的沉淀剂分配针头，并准备从沉淀剂板中吸取溶液。</li>
 <li> 启用机器人的分配功能，开始按顺序向孔中加载含蛋白中间相（通常为50 nl），每次加载一列八个孔，随后加入沉淀剂溶液（通常为800 nl）。在列间加载间隙，中间相分配臂返回停放位置，针尖插入湿润海绵中，以防针尖处中间相干燥。此中间相与沉淀剂分配过程在整块板上重复11次，直至填满所有孔。完成一块96孔板的中间相和沉淀剂加载约需5分钟。</li>
 <li> 一旦板子填满且机器人臂返回停放位置，立即将板子从机器人工作台面上取下，并放置于平坦坚实的表面上。</li>
 <li> 立即用盖玻片密封板子，以尽量减少随时间变化的孔内成分改变。必须确保所有96个孔均被完全覆盖，盖玻片与基板对齐且边缘无超出基板轮廓。使用滚轮或压辊在盖玻片与间隔垫之间形成紧密且均匀的密封。</li>
 <li> 检查板子，确认设置正确。理想情况下，每个孔应呈现“平底锅上的煎蛋”状外观：蛋黄对应中间相，蛋白对应沉淀剂溶液，锅边对应结晶孔的边缘。理想状态下，三者应同心。</li>
 <li> 将板子置于温度可控的储存区域，用于晶体生长。</li>
 <li> 若不再设置其他板子，应从机器人工作台面上取下沉淀剂板，严密密封后放回储存。</li>
 <li> 从机器人分配臂上取下含有中间相的注射器，拆解并仔细用甲醇清洗包括分配针和卡套在内的各部件，干燥后以备下次使用。</li>
</ol>
3. 原位 机器人 2. 伊蚊 LCP
Mosquito LCP 机器人（图 4）采用与 Robot 1 相同类型的中间相分配装置。与 Robot 1 不同的是，它通过一次性吸头分配沉淀剂。使用编程软件可设置仪器，以适配特定的结晶板和沉淀剂块，并按指定顺序分配用户自定义体积的中间相和沉淀剂。相关具体操作由制造商提供，此处不再赘述。
<ol>
 <li> 按照上述 Robot 1 部分及 JoVE 文章 17121 中所述方法，准备一支带有针头并装有含蛋白质中相的 Hamilton 注射器。</li>
 <li> 将注射器夹紧固定在机器人分配臂的指定位置。</li>
 <li> 使用安装在工作台上的激光传感器确定分配用注射器针头的 X 和 Y 坐标。此步骤至关重要，可确保中相被准确地分配至每孔板的中心位置。</li>
 <li> 按下控制面板上的按钮，对注射器进行预润，使中相从针头排出。用纸巾清除针尖处挤出的中相，为机器人后续加样做好准备。</li>
 <li> 在将结晶板放置于机器人工作台之前，先在平台表面滴加几滴水，利用毛细作用帮助固定结晶板。</li>
 <li> 移除玻璃底板上间隔层的保护盖，将其牢固地放置在平台上，以确保良好粘附。利用平台上的三个定位标记对齐板上的三个角孔，从而确保板上各孔相对于分配针尖的正确位置。此时可指令仪器进入分配循环。</li>
 <li> 循环开始时会进行第二次预润，即在转入新鲜中相加样前，先将少量中相分配至一块小型玻璃片上。机器人首先在板上垂直方向的 8 个孔中加入中相，然后使用一次性吸头将沉淀剂溶液加至中相液滴上方。该过程沿板的长度方向重复 11 次，直至所有孔均被填满。整个过程约需 5 分钟完成。</li>
 <li> 从机器人平台上取下已加样完毕的板，并按照上述 Robot 1 部分所述方法用盖玻片密封。</li>
 <li> 将正确标记的板置于温度可控的环境中，用于晶体生长。</li>
</ol>

4. 在中胚层 机器人 3. Gryphon LCP
Gryphon LCP 机器人（图 5）采用了一种与上述机器人 1 和机器人 2 相似的介晶相分配系统。它与其他两台机器人的不同之处在于，所有 96 种沉淀剂溶液可同时分配。
<ol>
 <li> 按照上述 Robot 1 和 Robot 2 部分以及 JoVE 文章 17121 中所述方法，制备含蛋白的中间相，并将其装入分配用注射器中。</li>
 <li> 将注射器固定在机器人分配臂的指定位置。</li>
 <li> 将沉淀剂溶液板和结晶板放置在机器人的工作台面上。</li>
 <li> 使用96通道吸头将沉淀剂溶液加载至吸头中。系统提供用户自定义的延迟时间，以方便吸取黏稠的沉淀剂。</li>
 <li> 命令仪器进入分配循环。该循环首先依次将中间相分配至96个孔中，此过程约需1分钟完成；随后，96通道吸头一次性将全部96个沉淀剂溶液滴加至结晶孔中中间相液滴的上方。整个板的加样过程在2分钟内完成。</li>
 <li> 从机器人平台取下已加样完毕的板，并按照上述 Robot 1 部分所述方法用盖玻片密封。</li>
 <li> 将正确标记的板置于温度可控的环境中，以进行晶体生长。</li>
</ol>
5. 代表性结果
本视频文章的目的是演示如何在玻璃三明治式96孔结晶板中，使用高粘性且富含膜蛋白的中间相自动设置结晶实验。重点在于通过使用特殊机器人实现自动化操作，从而最大限度减少人工干预。当使用机器人时，可预期在中间相和沉淀剂的分配体积及其在孔内位置方面具有良好的重现性和精确性。这对于有效筛选支持晶体生成的条件至关重要。同时，这对于分析流程的下一步——通常借助成像设备进行的晶体生长评估——也极为关键。液滴或液柱的位置对成像过程至关重要，若液柱在孔内位置不规则或不当，通常需要用户手动校正，耗费时间。为便于说明，图6展示了正确与错误加载样品的板示例。
<img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig1.jpg" alt="Protein-lipid mesophase diagram for crystallizing proteins, detailing setup, process, and optimization." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 图1. 流程图总结了样品制备、收获及冷冻冷却过程中的各个步骤 在中间相中-生长的膜蛋白晶体。由红色虚线框包围的步骤是本 JoVE 文章的重点。在步骤 29 至 32 中使用机器人分配中间相和沉淀剂溶液。引自参考文献 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4000/4000fig1large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.
<img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig2.jpg" alt="结晶实验示意图；96孔装置，玻璃底板，125 µm 间隔层并进行立方相分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
 图2. 一个完全装载并密封的96孔玻璃夹心结晶板。每个孔包含50 nl立方相和1 μl沉淀剂溶液。为便于观察，立方相用苏丹红染色，沉淀剂溶液中添加了亚甲蓝。引自参考文献5。
<img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig3.jpg" alt="带有微量注射泵、96孔板、洗涤站的液体处理工作站；自动化装置。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
 图3. 原位 机器人（机器人1）。该机器人具有两个机械臂。机械臂1用于分配含蛋白质的脂质中间相。机械臂2用于分配沉淀剂溶液。在加样过程中，96孔板固定在机器人台面上，机器人本身保持静止。两个机械臂移动以输送中间相和沉淀剂溶液。引自参考文献3。
<img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig4.jpg" alt="用于晶体学的自动化移液系统；示意图标注了高通量操作的关键组件。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
 图 4. Mosquito LCP 机器人（机器人 2）。与机器人 1 不同，Mosquito LCP 的载台在加样过程中水平移动，96 孔板和沉淀剂溶液块放置于该载台上。
<img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig5.jpg" alt="使用Gryphon仪器进行蛋白质结晶实验设置；包括仪器台面、中间相头部和96孔板。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
 图5. Gryphon LCP机器人（机器人3）。在设置过程中，脂质立方相分配器移动，将含有蛋白质的中间相转移至96孔板上。随后，台面水平移动，使板位于沉淀剂溶液加样头下方。所有96个沉淀剂溶液同时被分配。图片来源于制造商（<a href="http://www.artrobbins.com/" target="_blank">http://www.artrobbins.com/</a>）并已标注。
<img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig6.jpg" alt="琼脂平板上的酶驱动脂质扩散实验；示意图中标注了区域 M 和 P。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
 图6. 一个完全加样并密封的96孔玻璃夹心板（A），以及使用in meso机器人（机器人1）正确（B）和不正确（C, D）加样的孔。A图中板上的条形码标签用于在板孵育器/成像设备中追踪该板。在B-D图中，沉淀剂溶液和中间相分别标记为P和M。B图中孔呈现的“平底锅上的煎蛋”外观是正确加样并密封孔的典型特征。在C图中，沉淀剂被不正确地加至偏离中心的位置，并已接触到间隔层。此外，C图中中间相的体积似乎也低于应有体积。D图显示了沉淀剂溶液加样不完全的一个示例。作为参考，所有孔的直径均为6 mm。

<ol><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (45), e1712(2010).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (49), e2501(2011).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Bio.l+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Peddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+automated+system+for+crystallizing+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Autom.+Sci.+Eng%22%5BJournal%5D)">High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases.</a> IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination%3A+use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).</li>
<li>Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+State+of+Sensory+Rhodopsin+II%3A+Structural+Determinants+for+Signal+Transfer+and+Proton+Pumping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping.</a> J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).</li>
<li>Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li>
<li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001(2012).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在本视频文章中，我们展示了如何使用机器人自动在96孔玻璃三明治板中设置含有蛋白的脂质介相的 in meso 结晶实验。本研究所用的机器人专门设计了正位移玻璃注射器，可精确且可重复地输送纳米升体积的黏稠且易粘连的介相，如先前所述7。
准确性和精确性是机器人的关键特性。然而，这些特性的优劣取决于对机器人性能进行评估和校准的频率与规律性。毋庸置疑，在设置每一块微孔板的过程中都应实时评估机器人的运行表现。不应假设机器人能够无故障运行，而将其置于无人看管的状态。操作人员应保持专注和警觉，能够通过声音或外观异常及时发现运行中的问题，并立即予以纠正。此外，每块微孔板在密封后、存入进行结晶试验前，均应立即通过肉眼仔细检查各孔内溶液分布的均匀性。该检查仅需数秒钟即可完成，可利用加载下一块板的时间同步进行。例如，若发现某些孔未被充分填充，可能提示特定的沉淀剂分配针头存在功能异常。若观察到介相（mesophase）的输送不规律，则必须立即纠正相应的故障部件。在设置过程中及时发现这些问题并进行相应调整，可节省时间和材料，包括珍贵的脂质和膜蛋白。若使用成像仪监测晶体生长，也可在成像过程中持续监控其准确性和精确性。例如，若成像仪显示液滴或液团位置存在系统性偏差，则表明实验流程中上游环节存在问题，需采取纠正措施。
因此，为了确保可靠的性能，必须按照定期计划并根据需要对机器人进行校准。校准应包括沉淀剂和中间相的输送体积，以及液滴和沉淀剂在孔板中的定位。显然，在尽可能的情况下，应使用与质量控制周期内试验所用相似的体积和材料进行校准。
校准的重要性不言而喻，同样重要的是储备充足的机器人零部件和耗材。灾难性且不可预见的故障、堵塞和碰撞确实可能发生。在这种情况下，若能及时获得替换的沉淀剂输送尖端等部件，可能就意味着极其珍贵的膜蛋白样品能够按预期使用，而不会被浪费。
机器人的一些优势在于它能够几乎持续工作，且不会因疲劳而“抱怨”或受到影响。机器人还可以在对人类不友好的条件下使用，例如在黑暗环境中、在受控的光照和环境条件下，以及在极端温度下。本文中展示的机器人均在约 20 °C 的环境条件下运行。然而，某些蛋白质和实验项目需要非环境温度、受控光照11,12以及氧化性或还原性环境13。当使用结晶机器人时，所有这些条件都可以相对容易地实现和满足。
在之前的一篇 JoVE 视频文章中，我们演示了如何手动设置in meso法的结晶实验1。人工可精确分配的介相最小体积受限于操作者视力敏锐度和手部稳定性。根据我们的经验，低至 100 nl 的介相体积即可轻松操作。我们了解到有实验室常规手动分配的体积约为 40 nl。然而，若使用机器人，则可实现更小得多的体积。另外，我们已证明可通过机器人自动分配低至 550 皮升的介相体积14。从该研究可知，机器人进一步微型化操作是可行的，一旦实现，将大幅减少进行一次结晶实验所需的珍贵膜蛋白用量。
在本视频文章中，使用了三种市售机器人来演示利用脂质介相进行高通量膜蛋白结晶。第一种机器人由MS&amp;FB课题组基于我们手动设置实验的经验开发，相关方法已在JoVE 17121中描述。这是我们最熟悉的仪器，本文的大部分内容都集中于其使用。另外两种机器人在本文撰写时正在MS&amp;FB课题组内进行展示，为完整起见，相关视频片段也包含在本文中。这三种机器人均采用非常相似的介相分配系统，其核心部件为正位移玻璃注射器5,7。它们在沉淀剂输送方式上差异最为显著。机器人1和机器人2可同时向96孔板的一列8个孔中分配沉淀剂，每次处理一列。相比之下，机器人3可在单次操作中一次性分配全部96个沉淀剂溶液。机器人2是唯一采用一次性沉淀剂分配吸头的仪器。不同仪器各有优缺点，具体取决于实际应用需求；此处不再详述。需要说明的是，这三种仪器均能正常工作，并已通过介相内结晶（in meso）方法成功获得膜蛋白晶体。
通过大分子晶体学进行结构测定的整体流程中，后续步骤包括收获本视频文章所述实验板中的晶体，将其冷冻冷却，并记录和处理其X射线衍射数据。这些主题在本系列的其他JoVE文章中已有介绍1,15。

<table><tbody><tr><td>布拉耶尔滚轴工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>50820937</td><td>工具</td></tr><tr><td>气密注射器</td><td>Hamilton</td><td>81030</td><td>工具</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Marienfeld</td><td>01029990911</td><td>一次性用品</td></tr><tr><td>玻璃板</td><td>Marienfeld</td><td>1527127092</td><td>一次性用品</td></tr><tr><td>Gryphon LCP 机器人</td><td>Art Robbins</td><td>NA</td><td>工具</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In meso&lt;/em&gt; 机器人</td><td>Anachem/Gilson</td><td>NA</td><td>工具</td></tr><tr><td>实验记录本</td><td>Various</td><td>NA</td><td>工具</td></tr><tr><td>Mosquito LCP 机器人</td><td>TTP Labtech</td><td>NA</td><td>工具</td></tr><tr><td>带孔双面胶间隔胶带</td><td>Saunders Corporation (打孔)</td><td>定制</td><td>一次性用品</td></tr><tr><td>沉淀剂溶液</td><td>Various</td><td>Various</td><td>试剂</td></tr><tr><td>纯化水</td><td>Millipore</td><td>NA</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>Shell Car Care</td><td>80199200</td><td>试剂</td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>Hamilton</td><td>7770-020 (22号规格)</td><td>工具</td></tr><tr><td>擦拭纸巾</td><td>Various</td><td>Various</td><td>一次性用品</td></tr><tr><td>水瓶</td><td>various</td><td>NA</td><td>试剂</td></tr></tbody></table>

使用机器人在脂质介相中进行膜蛋白的高通量结晶

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

膜蛋白的结构与功能研究极大地受益于高分辨率三维结构的获取，而大分子X射线晶体学（MX）正是提供此类结构的重要手段。MX实验的关键要素之一是持续获得理想状态下可用于衍射的晶体。用于膜蛋白结晶的方法有多种，其中in meso法（又称脂质立方相，LCP）利用双连续介相作为晶体生长的环境。近年来，该方法取得了若干突破性成果，受到广泛关注，越来越多的研究团队希望采用此技术。该方法面临的一个挑战在于其所使用的介相具有极高的黏度和黏附性，质地类似于浓稠的牙膏。因此，以手动方式将小体积的介相重复性地精确分配至结晶孔中，需要熟练的技术、足够的耐心和稳定的操作。膜结构与功能生物学（MS&FB）研究组已为此开发了一套标准化操作流程1-3。JoVE视频期刊中亦有描述该方法的视频文章可供参考1,4。
手工设置in meso实验在某些特殊应用中具有明显优势，例如晶体优化和衍生物制备。然而，该方法通量较低。本文中，我们展示了一种利用机器人进行in meso结晶实验的方案。机器人具有速度快、准确性高、精密度好、可实现微型化操作，并能在黑暗、还原性气氛或低温/高温等对人工而言较为严苛的条件下持续长时间工作的优势。in meso机器人若使用得当，可通过促进结晶这一整体结构解析流程中的限速步骤，显著提升膜蛋白结构与功能研究的效率。
在本视频文章中，我们展示了三种 commercially available 机器人在 in meso 结晶过程中用于分配黏稠且具有黏性的中间相的方法。第一种机器人由 MS&amp;FB Group5,6 开发。另外两种为近期上市的产品，本文将其纳入以确保内容的完整性。
本文所述实验方案的概述见图1。所有操作均在常温（约20 °C）环境条件下进行。

本文介绍了一种用于膜蛋白在脂质介相中高通量结晶的机器人方法，旨在通过大分子X射线晶体学进行结构解析。文中引入了三台能够处理该方法中关键的黏稠且易粘连的含蛋白介相的机器人。

膜蛋白的结构与功能研究极大地受益于高分辨率三维结构的获取，这类结构可通过……获得

您好，欢迎来到膜结构与功能生物学研究组。我是 Martin Caffery。这是 JoVE 关于利用介晶或脂质立方相方法对膜蛋白进行结晶以进行结构测定的系列文章之一。在第一篇文章 JoVE 1 7 1 2 中，我们展示了如何制备富含蛋白质的立方相，以及如何手动将黏稠且具有黏性的中间相分配到玻璃三明治板中进行结晶试验。本视频文章将介绍使用原位中间相结晶机器人的方法。机器人具有速度快、准确性高、精密度好、可微型化操作，并能在黑暗或低温等不适条件下长时间连续工作的优势。若使用得当，机器人可显著提升膜蛋白结构与功能研究的生产力。在本视频文章中，我们展示了三种市售机器人的使用方法。第一种机器人由膜结构与功能生物学研究组开发，其详细描述见参考文献一。另外两种最近才开始提供，此处包含它们是为了完整性。准备用于机器人进行结晶实验的结晶板时，首先需要制备玻璃三明治式结晶板的底板；关于底板的详细描述见参考文献。底板必须先进行硅烷化处理，然后将形成孔穴的带孔双面粘连垫片贴附到板上。所需的材料如下所示。它们包括一块玻璃结晶底板、一个带孔的双面胶间隔片、用于铺展溶液的滚轮或压延纸巾，以及一杯超纯水。将底板放置在实验台面上的纸巾上。滴加数滴沉默溶液，然后用纸巾将其均匀地铺展在底板表面。通过将培养板完全浸入盛有水的烧杯中，洗去多余的硅化溶液。将培养板从烧杯中取出后，置于干燥的纸巾上，硅化面朝上，用纸巾轻轻擦拭其暴露的表面以使其干燥。接着，移除穿孔双面胶间隔垫上的保护盖，并将该间隔垫贴合到玻璃板的硅化表面。必须确保间隔垫在底板上正确放置，使间隔垫的左上角及其相邻的两个边与底板的对应边完全对齐。使用滚轮或压平辊将间隔垫在底板上压平，以确保二者之间形成紧密的密封。顺便指出，如参考文献部分所述，带孔隔片的独立板可从商业途径获得。在制备完结晶基础板后，接下来我们将进行原位微晶机器人（in meso robot）的设置与使用。如下文所述，我们将展示三种原位微晶机器人的使用方法。在所有展示的情况下，机器人都设置并使用于温度受控的房间中，meso robot one（本视频中演示的第一台 meso 机器人）的温度设定为 20 摄氏度。该设备由 PI 的实验室开发，现已有商业化产品。完整详细信息可参见参考文献部分。此处展示了使用机器人设置结晶试验所需的材料和设备。它们包括实验记录本、含有蛋白质的溶液（按 JoVE 文章 1 7 1 2 中所述方法新鲜制备）并装于 Hamilton 注射器中、硅化底板及垫片、配套的盖玻片、水瓶和擦拭纸，以及 In Miso 机器人。第一个画面显示的是工作台面洁净的机器人。下一个画面显示的是配备有加湿器停靠站、结晶基础板以及含有沉淀剂溶液的深孔板的完整机器人。我们首先将基础板放置在机器人的工作台面上，开始进行设置。它拥有独立的平台，平台上有明确标记的孔位，用于底板对齐。该板应清晰标记以用于识别。含有沉淀剂溶液的96孔板固定在机器人甲板上紧邻结晶板的独立平台中。通过小心地剥离模块的塑料顶盖来打开模块。将加湿器的湿气流引导至流经机器人平台上的底板。按照制造商的说明对机器人进行初始化设置。此处不再详细演示该过程，因为具体的实验方案会随时间而变化。初始化过程的基本原理是：为机器人上的试剂分配臂提供三个正交方向（X、Y 和 Z）的参考位置。接下来，将装有含蛋白质的介相（meza phase）且配备分配针头的 Hamilton 注射器连接至机器人的 1 号机械臂。有关介相和注射器制备的完整细节，详见 JoVE 文章 1 7 1 2 及参考文献一。此时，分配注射器的针尖必须与结晶板左上角最上方的孔位底部及中心对齐，该孔位标识为 A1，首要任务是与 A1 孔的底部对齐。通过在观察针尖接近孔底部的程度的同时，调节加样臂的Z坐标高度来实现。当针尖刚好接触孔底部时，可通过手动轻轻左右移动平台上的板，同时微调加样臂的高度来判断；当针尖接触板面时的加样臂Z坐标位置将被输入计算机，加样程序将设定为在针尖距离该参考Z位置数微米处进行，该位置对应于底板表面。随后启动机器人，根据用户提示执行一系列步骤，将针尖定位至A1孔的中心位置。分配臂的参考 XY 坐标（即吸头中心位置）存储在控制机器人的计算机中，用于定义板上其余各孔的中心位置。在计算机中设置好这些参考坐标后，指令测量分配臂返回起始位置，对注射器进行预充。现在必须对分配用注射器进行预润。这是为了确保新鲜的mease充满分配针头，并使板上的第一个孔获得足量的mease。程序中设有启动机器人运行的预润指令。在用户控制下，这会驱动注射器中的活塞逐步前进。在此过程中，检查针尖是否有测量相（mease）伸出，随后用纸巾清除挤出的测量相（meza）。至此完成机器人运行前的预灌注过程。机器人现在已准备好以自动模式启动运行。机器人XAP程序将启动一轮冲洗步骤，此时机器人二号机械臂上的沉淀剂分配吸头将被清洗，并准备从深孔板中吸取沉淀剂溶液。激活机器人的分配功能后，将按顺序向孔板中依次加载含蛋白质的母液，每次加载前八个孔，随后加入沉淀剂溶液。母液分配臂在每次分配后返回停放位置，此时针头末端置于湿润的海绵中，以防止尖端处的母液干燥。最常用的膜结构与功能生物学组膜蛋白结晶实验条件为：50 纳升的蛋白溶液和 800 纳升的沉淀剂溶液。本次演示中运行机器人的程序已设定为两个机械臂同时移动。通过这种方法，可在五分钟内完成一块96孔板的蛋白质溶液和沉淀剂的加样。一旦加样完成，机器人机械臂即刻返回停放位置。随后将该板从机器人平台上取出，并放置于平坦的固体表面上。将盖玻片轻轻放置在底板上方，使其与间隔层的上部粘性表面接触。必须确保所有96个孔均被完全覆盖，盖玻片与底板对齐成直角，且盖玻片任何部分均不超过底板的轮廓范围。使用滚轮或压辊在盖玻片与间隔层之间形成紧密且均匀的密封。在此阶段应检查培养板，以确保操作步骤正确无误。预期观察到的现象应类似于平底锅上煎蛋的外观。每个孔中的蛋黄部分对应于中间相（meza 相）。蛋清是沉淀溶液，锅的边缘是结晶的边界。理想情况下，这三个区域是同心的。现在，该培养皿已准备好放入温度可控的储存区域，以进行晶体生长。若不再需要设置更多培养板，则应将沉淀剂块从机器人甲板上取下，妥善密封后放回储存。将含有mease的注射器从机器人的分配臂上取下，拆解其各个部件，包括分配针和ferial，用甲醇仔细清洗并干燥，以备下次在Meso机器人中与Mosquito LCP联合使用。下一个视频片段展示了可用于设置原位结晶实验的蚊式 LCP 机器人。该机器人采用了与本文前面所述相似的 Meph 相分配系统。然而，对于机器人一，沉淀剂是使用一次性吸头进行分配的。此处显示的是仪器本身。它包含一个平台，用于放置结晶板和沉淀剂块，以及一个带窗口的腔室，用于控制湿度。在此视图中，湿度腔室的窗口已被打开，同时还包括一个装有分配吸头的卷轴、一个微量分配臂，以及一个基于激光的传感器，用于确定液相分配针的位置。一个升高的平台用于放置结晶板，旁边是一个凹陷的平台，用于固定沉淀剂筛选块。在此流程中，机器人在仪器启动时会执行一系列初始化操作。通过编程软件设置仪器，以适配特定的结晶板和沉淀剂块，并按照指定顺序分配定量的酶液和沉淀剂。这些细节由制造商提供，此处不再展示。使用机器人设置结晶板的操作步骤如下：按照上述“原位介导机器人一”及 JoVE 1 7 1 2 中所述方法，准备一支配有针头并已装入含蛋白质的介相溶液的汉密尔顿注射器。将该注射器固定于机器人分配臂下方的指定位置。使用甲板上安装的激光传感器确定分配注射器针头的 X 和 Y 坐标。这是确保将蛋白酶准确地分配到结晶板每个孔中心的重要步骤。通过触摸控制面板上的按钮，即可启动注射器，使蛋白酶从针头尖端排出。随后用纸巾除去挤出的油相，为机器人加样做好准备，然后将结晶板安装到机器人甲板上。平台表面滴加数滴水以保持湿润，有助于固定结晶板。通过毛细作用移除板上的保护盖，将结晶板牢固地放置于平台上，确保良好贴合。在平台上有三个定位标记，三个角落的孔位以此为中心，以确保微孔板相对于分配针尖的正确位置。此时，仪器已准备好进入设置循环。该过程首先进行第二次引液步骤，即在移至加载新鲜基质蛋白（mease）之前，先将 Mease 分配到一块小玻璃板上。在此流程中，我们看到机器人首先为微孔板上的八个垂直排列的孔加载 mease，然后使用一次性吸头将沉淀剂溶液分配到 mease 团块的上方。此过程在整块板的长度方向上重复进行11次，直至所有孔均被填满。整个过程约需五分钟完成。在本视频中，每个孔中分别加入50纳升的Mease和800纳升的沉淀剂溶液。将填满的微孔板从放置在实验台上的机器人平台中取出。按照上述Meso机器人一中的描述，盖上盖玻片，并用乳贴密封微孔板。正确标记后的微孔板现在可置于温控环境中，用于Meso机器人三（Griffin LCP）中的晶体生长。这段最终的视频片段展示了Griffin LCP机器人在进行原位结晶实验设置时的使用情况。Griffin所采用的甲基戊醇相分配系统与上述机器人一中描述的系统类似。但在本例中，96种沉淀剂溶液可同时分配。此处显示的是仪器本身。它包括一个放置结晶板和沉淀剂板的平台、一个测量分配臂和一个 Phoenix 96 吸头装置。在最后一个视频片段中展示了机器人正在运行时分配沉淀剂溶液的过程。首先用沉淀剂溶液加载96通道头。系统提供用户自定义延迟，以方便吸取黏稠的沉淀剂。MEA相按顺序依次分配至96个孔中，整个过程约需一分钟完成。最后，96头移液装置将96种沉淀剂溶液同时分配至结晶孔中MEA相液滴的上方。整个板加载过程在两分钟内完成。将填满的板从机器人工作台上取下，用盖玻片密封，并置于受控温度条件下储存，以进行晶体生长。大分子晶体学进行结构测定的整体流程中的后续步骤包括收集晶体并进行低温冷冻，以及记录和处理来自晶体的X射线衍射数据。这些主题在本系列的其他专题文章中分别进行介绍。

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生物学

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