荧光检测病毒RNA原位杂交（FISH）
May 5th, 2012
荧光原位杂交（FISH）方法被开发的可视化检测病毒基因组RNA，用荧光显微镜。探针与特异性病毒RNA，然后可以使用杂交和免疫荧光技术相结合确定。这种技术提供了识别病毒的RNA或DNA在稳态本地化的优势，提供对控制细胞内的病毒贩卖事件的信息。
该程序的总体目标是可视化病毒 RNA 在细胞内 C 2 中的位置。为了首先完成此作，请在玻璃盖玻片上培养将要转染或感染的细胞。第二步是在成功转染或感染后用 4% 多聚醛固定细胞。
接下来，将细胞与标记 RNA 的杂交混合物一起孵育。这是通过将盖玻片单元面朝下放在载玻片上的杂交混合物上来完成的。该程序的最后一步是使用抗体对细胞进行 RNA 标记染色。
最终，标记的 RNA 在细胞内的定位通过 C 2 杂交或 fish 中的荧光可视化。与其他方法（如 RNA 成像和使用标签的活细胞）相比，该技术的主要优点是可以检测天然 RNA，而不是修饰的 RNA。一般来说，刚接触这项技术的人会很挣扎，因为它需要患者护理和处理盖玻片、方法标准化以及精确的时间。
在孵育过程中，培养用于固定的细胞的具体程序将取决于细胞的类型。对于贴壁细胞，最初将它们接种到未经处理的无菌玻璃盖玻片上是很重要的。因此，收获后的最终一致性约为 70% 至 80%非贴壁细胞应以标准方式培养，直到准备好收集。
然后在感染或转染前 24 小时将它们与用聚 L 赖氨酸处理的典型 12 孔聚苯乙烯组织培养板 150， 000 个细胞/孔的盖玻片一起孵育。将盖唇上的细胞在 37 摄氏度下孵育 1 小时，以开始细胞固定程序。小心吸液弃去培养基，并轻轻加入 1 个 XPBS 制备的双蒸水。
或 DPBS 洗涤细胞 1 分钟。也可以使用 Dathyl pyro CARBATE 或 DEPC 处理的一种 XPBS。不要使用未经处理的 PBS，因为它可能含有 R nase 酶。
丢弃 DPBS 并轻轻添加足够的。4% 对甲醛覆盖细胞，完全孵育 15 至 20 分钟，然后丢弃石聚醛并用 DPBS 洗涤细胞 1 分钟。弃去 DPBS，加入 0.1 摩尔甘氨酸孵育 10 分钟。
接下来，丢弃甘氨酸，用 DPBS 洗涤细胞 1 分钟。丢弃 DPBS 后，加入 0.2% Triton X 100，孵育 5 至 10 分钟。如果对核仁或核包膜蛋白进行染色，则用 triton X 100 渗透不超过 5 分钟，否则蛋白质定位将变得弥漫。
丢弃 triton X 100 并在 DPBS 中洗涤两次，每次一分钟，然后再开始捕鱼程序。准备用于孵育盖子的侧面 Slips 注意清洁并贴好标签。对于 18 毫米的盖玻片，向玻片中加入 50 μL DNA 溶液。
该程序最困难的方面是正确处理盖玻片。重要的是要确保孵育盖玻片的右侧并轻柔地处理它们。为避免破损，将盖玻片添加到载玻片上，确保将其细胞面朝下，并在室温下孵育 15 分钟15 分钟后，将盖玻片销售面朝上放入装有 X-D-P-B-S 的培养皿中。
将盖玻片清洗一分钟。此组合包含以下内容。50% 去离子形式酰胺 1 毫克/毫升，TRNA 两个 X-S-S-P-E 五个 X dnar RNA 输出探针和 DEPC 水，最终体积为 50 微升。
该探针是一种 dig genin 标记的 RNA 探针，旨在补充病毒基因组 RNA。地方。每个盖玻片单元的面朝下在载玻片上的杂交混合物上。孵育应在含有 50% FIDE 两个 X-S-S-P-E 的托盘中进行。
混合，在 42 摄氏度下孵育 16 至 18 小时。接下来，将盖玻片细胞面朝下放入 50 μL 50% fide 中，在 42 摄氏度下孵育 50 分钟。将盖玻片面朝下放入 50 微升两个 X-S-S-P-E 中，在 42 摄氏度下分别孵育 5 分钟，将盖玻片分成两个 X-S-S-P-E 两次。
最后，将盖玻片放入一个 X-D-P-P-S 中清洗一分钟。要开始此程序，将细胞面朝下放入 50 μL 的 1 X Roche 封闭液中，在室温下封闭 30 分钟，封闭完成后，将每个盖玻片细胞面朝下放入 50 μL 一抗溶液中，该溶液包含适当浓度的实验用所有一抗。一小时后在 37 摄氏度下孵育 1 小时。
将盖玻片细胞面朝上放入含有 DPPS 的培养皿中，并洗涤盖玻片 10 分钟。接下来，将 50 μL 二抗溶液移液到每个盖玻片的载玻片上。Alexa 地板偶联抗体可用于生成一系列颜色，并以 1 比 500 的稀释度在一种 x 封闭溶液和一种 X-D-P-B-S 中将每个盖玻片细胞面朝下放入二抗溶液中，并在 37 度下孵育 1 小时。
清洗盖玻片两次，每次 10 分钟。在 DPBS 干燥中，盖子将细胞面朝上滑到一张吸墨纸上。请务必盖住盖玻片，以避免暴露在光线下和漂白。
一旦所有液体蒸发，将盖玻片安装到新的载玻片上。使用 8 微升 Immuno 支架轻轻敲击盖玻片以消除任何气泡，在盖玻片的边缘涂抹指甲油以将其固定到位。通过显微镜技术对 RNA 和蛋白质进行可视化对于该程序的成功也至关重要。
所用显微镜的设置可能有助于或阻碍可视化。因此，在给定的实验中，显微镜上的设置必须正确设置并且从一个样品到另一个样品保持一致，这一点至关重要。该图说明了鱼病毒 RNA 可视化和免疫荧光蛋白质定位的代表性结果。
在第一个面板中，用 HIV one 转染 hela 细胞，在整个细胞质中可以看到以绿色显示的 HIV 病毒 RNA，大部分是弥漫显示的，虽然小的细胞质小点并不少见，但可以通过将阳性细胞与周围细胞进行比较来看到特异性，这些细胞不显示荧光，如仅代表病毒 RNA 染色的黑白插图所示。红色染色反映了 Ross GA PSH 三结构域结合蛋白或 G 三 bp 的免疫荧光，当 helo 细胞转染缺乏调节 rev 蛋白的 HIV 时，它主要标记细胞质。产生的病毒 RNA 保留在细胞核中。
这可以可视化为细胞核中亮绿色信号和细胞质中缺乏 RNA 荧光信号。HIV 1 病毒 RNA 的分布也可以通过某些细胞蛋白的过表达来改变。例如，RAB 7 相互作用溶酶体蛋白或参与内体囊泡运输的真实 A 蛋白的过表达导致绿色追踪的病毒基因组 RNA 重新定位到微管组织中心。
在这里，内体被灯 1 标记并染成红色。相反，过表达不能与 P one 50 粘附的 δ N 结合的氨基末端缺失的 delta N 会分散在细胞质内的晚期内体，超过 P 50 dyin 的表达会阻断 dine motor 的大亚基并释放晚期内体，但也将病毒基因组 RNA 和 HIV V one 结构蛋白释放到细胞外围。当 HIV 1 在 helo 细胞中表达，然后在不同时间点收集和分析细胞时，病毒 RNA 早在转染和感染后 3 小时就出现在细胞中，并在 12 小时内通过这种 FISH 技术变得很容易观察到。
在这里，病毒 RNA 表达以绿色追踪，而细胞蛋白 H-N-R-N-P-A 一被染成红色 一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在第一天 20 分钟内完成，在第二天在第二天四个半小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住小心处理盖玻片，以避免弄破它们，并确保在涂抹二抗后避免光线照射。不要忘记，在处理 HIV V 1 和任何其他更高级别的病原体时，在固定之前是极其危险的，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如进行充分的培训和遏制。
概述
本文介绍了一种荧光原位杂交（FISH）方法，用于利用荧光显微镜可视化细胞内的病毒基因组RNA。该技术允许识别RNA的定位，为细胞内病毒运输提供见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 病毒学
背景
- 荧光显微镜是研究细胞成分的强大工具。
- FISH能够检测细胞内特定的RNA序列。
- 该方法可以区分天然RNA和修饰RNA。
- 样品的正确处理和准备对于成功的可视化至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来可视化受感染细胞中的病毒RNA。
- 增强对病毒RNA定位和运输的理解。
- 为FISH技术新手的研究人员提供详细的协议。
使用的方法
- 在玻璃盖片上培养细胞以进行转染或感染。
- 使用甲醛固定细胞。
- 与特定于病毒基因组RNA的RNA探针进行杂交。
- 免疫荧光染色以可视化RNA定位。
主要结果
- 成功地使用FISH可视化细胞内的病毒RNA。
- 展示了RNA与细胞结构的关系中的定位。
- 提供了可以在其他研究中复制的清晰协议。
- 强调了使用天然RNA检测方法的优势。
结论
- FISH方法对于研究病毒RNA定位有效。
- 该技术可以改善对病毒感染机制的理解。
- 未来的研究可以在此方法基础上探索其他RNA动力学。
常见问题
Executive Industry Relevance
Fluorescence in situ hybridization (FISH) enables direct visualization of viral RNA localization within host cells, providing critical insight into viral replication and intracellular trafficking. This capability supports mechanistic de-risking and target validation at early discovery and preclinical inflection points. FISH/IF co-analyses facilitate the identification of RNA-protein co-localization, informing downstream biochemical and biophysical validation in biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of viral RNA trafficking and localization mechanisms in host cells.
- Supports functional target validation by revealing the impact of viral or host protein perturbations on RNA distribution.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses regarding viral assembly and replication.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for quantitative imaging-based assays of RNA localization.
- Standardizes detection of native viral RNA, improving assay reproducibility and comparability.
- Enables robust screening of compounds or genetic perturbations affecting viral RNA trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular readouts with disease-relevant viral infection models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by linking molecular localization to functional outcomes in preclinical systems.
- Provides mechanistic de-risking for candidate interventions targeting viral RNA processes.
Pipeline & Workflow Integration
FISH-based viral RNA detection integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational model validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on viral RNA trafficking and host-pathogen interactions.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging outputs for compound or genetic screens.
- Analytics: Delivers spatially resolved RNA localization data for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular localization to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for RNA localization studies across multiple viral systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral replication studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability of RNA localization assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological mechanisms early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral targets and candidate interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and RNA probe design.
- Demands access to high-quality imaging instrumentation and standardized analytical workflows.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptation may be needed for different cell types or viral systems.
- Careful handling and precise timing are critical to avoid technical artifacts and ensure data quality.
