高通量使用自动染色体的物理图谱原位杂交

该程序的总体目标是使用高压染色体制备将 DNA 探针定位到蚊子多坦染色体上，然后进行 C 2 中自动荧光杂交和自动成像。这是通过首先使用高压方法制备 Polytan 染色体扩散来实现的。该程序的下一步是使用 Nick 平移方案用荧光染料标记基因组背 DNA，从而制备荧光探针。

第三步是使用自动玻片染色系统进行 C 2 荧光杂交。最后一步是使用自动荧光成像系统扫描和拍摄标记的染色体。最终，图像可以显示荧光标记的 DNA 探针在多染色体上的定位。

该技术或现有方法（如标准手动原位杂交方案）的主要优点是，最高通量的物理映射方案可产生更一致的结果，并显著减少手动作时间。该方案首先在采血后约 25 小时解剖半重力雌性和非重力雌性，以便在它们处于 Christopher 的第三阶段时收集卵巢。在这个阶段，卵泡内带有护士细胞的透明区域应呈圆形，收集 5 名女性的卵巢并将它们固定在 500 微升新鲜制备的改良汽车噪音溶液中。

然后，它们可以在室温下储存长达 24 小时或在零下 20 摄氏度下储存更长时间。接下来，在制作卵巢解剖载玻片之前，准备汽车噪音溶液和 50% 丙酸。将每对卵巢置于一滴新鲜的汽车噪声溶液中，放在解剖显微镜下的无尘载玻片上。

用解剖针劈开卵巢。将所有卵巢碎片转移到六张含有 50% 丙酸的干净载玻片上。使用解剖针将毛囊彼此分开。

然后用纸巾擦去所有残留的纸巾。再加入一滴 50% 丙酸，等待 3 到 5 分钟。传说，卵泡在 50% 丙酸中放置 3 到 5 分钟可显着改善染色体扩散。

接下来，贴上盖玻片并再等待一分钟以展开细胞核。用滤纸和塑料包裹载玻片。将 Dremel 设置在 3 到 5， 000 RPM 之间，并在大约一分钟内，将旋转的 dremel 尖端轻轻旋转在盖玻片上。

用相位显微镜确认传播质量，并在需要时将 dremel 应用更长时间，以使染色体变平。将第二个盖玻片放在第一个盖玻片旁边，然后将盖玻片与另一台显微镜夹在一起。接下来滑动，用塑料片和滤纸包裹载玻片，将包装载玻片放入虎钳中，将载玻片挤压至 85 至 120 英寸磅之间。

将所有六张载玻片上的染色体展平后，解开载玻片并去除多余的载玻片以进一步展平染色体。将玻片在 55 摄氏度下在玻片变性杂交系统中孵育 10 至 15 分钟。接下来，将玻片浸入液氮中至少 15 秒或直到气泡停止。

然后用剃须刀片快速取下盖玻片，并立即将玻片置于 50% 乙醇的冷中 5 分钟。按顺序对每张幻灯片重复此过程。在 70%a、90% 和 100% 乙醇浴中脱水载玻片。

将它们浸入每个浴槽中 5 分钟。最后，载玻片风干后，它们可以供鱼类染色。自动化设备执行程序中的大部分步骤，但探针标记除外。

因此，在加载设备之前，使用商业 NIC 翻译方案用荧光染料标记 DNA，并准备好探针，将载玻片和试剂加载到自动载玻片中，从而制备荧光探针。染色系统并对系统进行编程以执行以下步骤。首先，供应 800 微升 1 XPBS，持续 20 分钟。

其次，吹干载玻片。第三，在一个 XPBS 中用 450 微升 4% 福尔马林固定载玻片 1 分钟。然后用 100% 乙醇洗涤玻片 1 秒、2 次和 2 分钟。

乙醇浴后，再次吹干载玻片。现在将玻片在 45 摄氏度下加热两分钟，以避免起泡。然后应用 20 微升 DNA 探针，然后滴入矿物油和盖玻片，然后在自然界中将染色体在 90 摄氏度下放置 10 分钟。

然后将玻片设置为 42 摄氏度杂交 14 小时。杂交后，将严格性洗涤在 42 摄氏度下洗涤 2 分钟，然后连续施用 4 次 1 秒 2 个 XSSC 并干燥。然后在 42 摄氏度下涂抹 800 微升 0.4 XSSC，持续 10 分钟，分两次，然后再洗涤一次，在 25 摄氏度下涂抹两次 XSSC，持续 10 分钟。

现在涂抹 50 微升溜溜球，然后是矿物油和盖玻片。将玻片在 25 摄氏度下孵育 10 分钟。然后取下盖玻片。

在两个 XSSC 中洗涤玻片 4 次，每次洗涤 1 秒，然后吹干玻片。最后，将 15 微升延长金抗褪色试剂涂抹到每张载玻片上，并附上新的盖玻片。启动 Accord plus 自动扫描系统，从奥林巴斯卤素灯泡的 U-R-F-L-T 电源开始。

然后是计算机，最后是带有相机附件的显微镜。现在先打开 duet 软件包，设置 10 倍预扫描。单击联机按钮，输入新的案例 ID 并分配幻灯片 ID。

单击标有 bf 的点。这是 brightfield 选项。选择扫描选项以 10 x pre-scan。

选择 2， 500 x 圆、10， 000 x 圆或矩形。单击 set and run。然后，好的，按照提示正确调整扫描，然后单击 完成.

要开始扫描，请按 main 选项卡返回主屏幕。现在单击脱机按钮，找到分配的案例 ID 和幻灯片 ID。然后点击离线。

在左上角的黑框中扫描。单击箭头并选择 10 x 预扫描。找到感兴趣的图像后，使用箭头浏览扫描的图像。

双击目标区域中间的屏幕，然后按 snap。这将以图像为目标，以便在选择所有目标后稍后捕获。右键单击每张图像，单击分类，选择 10 x 预扫描，然后选择 polytan。

返回主菜单并设置 40 倍预扫描。再次选择 online 并选择一张幻灯片。将 BF 更改为 ffl，并将任务名称更改为重新访问 dash X 40 dash rg。

将最后一个设置正下方的部分更改为重新访问 dash all。然后运行程序并按照提示进行作。要设置自动化，请单击 Start matching views 按钮以匹配 10 x 和 40 x 图像。

单击 finish 开始扫描。完成后，单击分类并查看图像。使用高压技术制备来自女性异常冈比亚的卵巢护士细胞多坦染色体。

这种方法不会破坏或改变大部分染色体结构。它使弯曲的染色体变平，从而露出在常规制备中看不到的隐藏细条带。用从异常 S Gambia nd Tam 背文库获得的 back DNA 克隆探测染色体。

该文库由异常 S Gambia 害虫菌株的星形幼虫中的雄性和雌性首先产生。按照此程序，可以执行自动高通量物理映射，以促进基于染色体的基因组组装的快速开发。