定量健身分析工作流程
2012年8月13日
健身定量分析（QFA）是一系列估计微生物培养适应度的实验和计算方法的互补。 QFA估计的基因突变，药物或其他适用于微生物的生长治疗的效果。可以设计实验缩放从单一文化的集中分析数以千计的并行文化。
该程序的目的是以精确和高通量的方式在基因组范围内并行捕获定量微生物培养适应性。这是通过首先在 96 孔板中产生微生物菌落的图灵和阵列文库，然后将培养物培养至饱和来实现的。接下来，将饱和培养物用水稀释，然后点样到固体琼脂平板上。
然后定期拍摄固体 a garf 板，直到微生物菌落的生长饱和。最后，将每种培养物生长的时间过程照片转换为细胞密度的定量测量，并总结了使用生长模型和微生物适应性定量测量观察到的生长曲线。最终，通过证明微生物菌株在与不同的突变结合或在不同条件下生长时具有不同的适应性，可以获得显示遗传相互作用证据的结果。
与现有方法（如 SGA 或条形码竞赛实验等高密度固定方法）相比，该技术的主要优点是体能测量更准确。该方法可以帮助回答癌症药物开发领域的关键问题，例如哪些基因和过程在响应 DNA 损伤和细胞周期控制中很重要，以潜在药物靶点的形式理解和转化此类研究和基本微生物在人类癌细胞中。虽然这种方法可以提供对端粒功能和视觉的洞察。
它也可以应用于酵母生物学的其他领域，或者实际上是健身表型可以提供对微生物生物学的见解的任何领域。我们希望 QFA 可以应用于存在阵列文库的许多其他微生物。例如，povi e coli、orilla surplus 从饱和过夜培养物开始，在 200 微升体积的富液培养基中发挥多达 96 种独立酵母菌株的作用。
在 96 孔培养皿中，首先将 96 针、八分之一英寸直径的手动复制板浸入 100% 乙醇中，然后燃烧并冷却阵列，在 96 孔板涡旋的孔中加入 200 微升无菌水，具有饱和酵母培养物，并通过将灭菌的针工具浸入菌株中稀释 3 次。然后，进入装有水的板中，对针式工具进行消毒，并使其冷却，然后再将其浸入稀释的培养物中 3 次。然后将枢轴转移到固体琼脂平板上。
孵育琼脂板后，使用 s 和 p 机器人 SP 成像仪手动成像以进行自动培养。从在固体琼脂上生长的独立酵母菌株的矩形阵列开始。在此示例中，起始菌株是与酵母缺失集合交叉温度敏感查询突变的结果。
1， 536 个培养物代表 384 种独立酵母菌株的四个重复，使用带有 96 针、1 毫米针直径无菌针工具的机器人在 SGA 板上培养，将 1， 536 株中的 384 株转移到 4 96 株中。含有 200 μL 选择性培养基的孔培养板在 20 摄氏度下培养培养物至饱和。为了发现饱和酵母培养物，首先将它们转移到液体处理机器人和 Resus，将它们悬浮在磁力振荡器上，通过使用无菌 96 针机器人针工具将培养物稀释到 1 到 70 左右，钉入 200 微升无菌水中。
清洁和消毒针式工具后，将稀释的培养物点到琼脂平板上。在 384 孔中，将板转移到带有自动转盘和检修口的温控加湿培养箱中。对培养物进行成像 使用机器人自动成像仪，反复从培养箱中取出板，取下盖子，将它们转移到 35 毫米相机下方均匀照明的空间，以 5， 184 x 3， 456 捕获图像。
像素分辨率替换盖子，然后将它们返回到培养箱转盘，以跟踪板上的培养位置和应用于它们的处理。根据培养箱名称、温度、唯一的连续批号和培养箱中的位置，自动为培养板添加条形码。图像名称是板名称和时间戳的串联，在图像捕获时自动生成。
板通常也会手动标记，以确保它们在机器人转盘之间转移时保持相同的顺序。元数据文件是手动生成的制表符分隔的文本文件。实验描述文件 FT 二。
表 1 对于每个实验都是唯一的，但文库描述 FT 3、表 1 可以广泛重复使用。构建完成后，实验在实验描述文件 FT 两个表中描述，表一包含用于条形码或自动生成的板名称的列，实验开始时间戳，固体琼脂培养基的板处理内容，屏幕名称，具有多个板的文库的文库板号，以及用于从 1、536、孔格式缩小到 384 的重复象限数。用文库描述文件 FT 3 对 e 菌株文库进行格式化，表 1 说明了在每个培养位置生长的基因型。
在元器件库的每个板中，它包含第 4 列、元器件库名称、ORF、板号板、行板列和可选的注释列。FT 4 可以提供可选的标准基因名称文件，表 1 描述了与每个系统 ORFY 编号相关的标准基因名称，以识别正在筛选的菌株。该文件包含两列，ORF 和 gene name，用于分析数据。
QFA 计算工作流程需要访问安装了的相当强大的多核计算机工作站。Colonizer 图像分析软件工具和 QFAR 软件包都在线记录，可免费获得并在一系列作系统上运行。以每个捕获的板图像作为输入运行定植器，生成一个定肠器输出文件 FT 5，每个图像的表 1 捕获的定植器输出文件，指定培养密度估计、培养物、面积、形状和颜色。
对于图像板上的 384 个位置，系统会自动从源图像文件名复制输出文件名。QFAR 包包含函数 seldens to time courses 对于每个文化，以使广义 logistic 总体模型适合观察和绘图。两者均参见图 2 和图 3 作为示例。
拟合的参数值将写入 QFA 逻辑参数文件。QFAR 软件包还包含用于质量控制的功能。由于板边缘营养物质的可用性更高且图像分析困难，边缘菌落被丢弃。
SGA 失败的板壁附近和培养物以及显示与筛选特异性标记基因连锁的基因型从分析中剥离。几个定量适应度度量是从每种文化的 logistic 种群模型参数得出的。这些包括每组重复培养物和每个适应度定义的最大群体倍增率和从接种到饱和的分裂次数。
适应性估计值的几个汇总统计量是计算均值和中等适应性、适应性标准差和观察到的重复数。汇总统计数据输出到 QFA 健康汇总文件 FT 8 中，表 1 以供进一步分析。例如，遗传相互作用的计算分数 FT 9 表 1。
该图显示了对数尺度 OUTTA 384 QFA 上的一条典型生长曲线。由定植剂定量在 20 摄氏度下在固体琼脂上生长的培养物，大约两天后首次检测到细胞密度的增加。这种延迟可能是接种到固体培养基上后培养滞后阶段和细胞密度检测下限的综合影响。
在这里，从单个板中捕获了 308 条相似的生长曲线。请注意，产生平坦线的菌株病得很重或死亡。该图展示了两种全基因组 QFA 筛选的比较，以推断遗传相互作用强度。
QFAR 包还包括生成先前生长曲线图和输出检查基因型的排名列表和遗传相互作用强度估计的功能。连同 Q 值一起观察的 GIS 的显著性一旦掌握了完整的全基因组四个复制 QF。实验可以在三周内完成。在尝试此过程时，请务必记住对所有板和图像的跟踪和命名进行组织。
所有板都必须接种并以正确的方向定位并进一步订购。数据分析依赖于实验科学家构建的辅助文本文件的正确性。看完这个视频，你应该对如何估计数千种独立微生物培养物的适应度有一个很好的了解。
通过反复拍摄斑点培养物、在固体琼脂平板上生长、将捕获的图像转换为细胞密度的估计值并生成生长曲线来估计适应性。生长曲线的数学建模提供了定量的适应度估计，然后可用于在全基因组范围内推断基因产物之间的功能关系。
概述
定量适应度分析（QFA）是一种通过实验和计算方法来估计微生物培养物适应度的方法。它允许评估基因突变和处理对微生物在各种尺度上的生长影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物生物学
- 基因相互作用
- 高通量筛选
背景
- QFA在全基因组范围内捕捉微生物培养物适应度。
- 它利用96孔板进行高通量分析。
- 该方法提供比传统技术更准确的适应度测量。
- 它可以应用于各种微生物生物和研究。
研究目的
- 分析基因突变和处理对微生物生长的影响。
- 提高对微生物生物学和潜在药物靶点的理解。
- 提供关于癌症药物开发和DNA损伤反应的见解。
使用的方法
- 在96孔板中培养微生物菌落直至饱和。
- 在固体琼脂板上点样培养以进行成像。
- 自动成像和分析生长曲线。
- 使用计算工具进行数据分析和适应度估计。
主要结果
- 展示了不同条件下微生物菌株的不同适应度水平。
- 提供了基因相互作用影响微生物生长的证据。
- 显示了在癌症研究和药物靶点识别中的潜在应用。
结论
- QFA是研究微生物适应度和基因相互作用的强大工具。
- 该方法提高了适应度测量的准确性。
- 它在微生物生物学和药物开发中有广泛应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative Fitness Analysis (QFA) enables high-throughput, quantitative assessment of microbial fitness across thousands of genotypes or treatment conditions, supporting robust genetic interaction and drug sensitivity screens. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by providing precise, scalable growth measurements and facilitating systematic target validation. QFA's integration of experimental and computational steps positions it as a reusable platform for portfolio-wide biological de-risking and mechanistic interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of genetic interactions and pathway dependencies at scale.
- Provides quantitative fitness metrics to clarify functional consequences of gene perturbations or compound treatments.
- Supports mechanistic de-risking by ranking genetic or chemical sensitivities across diverse backgrounds.
- Facilitates triage of targets based on robust, comparative fitness data.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative growth curves for assay standardization and reproducibility.
- Enables high-throughput screening of genetic libraries or compound panels with automated imaging and analysis.
- Supports scalable, parallel evaluation of microbial responses to diverse treatments or environmental conditions.
- Prepares robust datasets for downstream analytics and compound prioritization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial fitness phenotypes with disease-relevant pathways, such as DNA damage response and cell cycle control.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical target assessment in model organisms.
- Enables risk-adjusted advancement of targets with quantitative, comparative fitness evidence.
- Supports translational biomarker identification through systematic phenotype mapping.
Pipeline & Workflow Integration
QFA fits within the discovery continuum from early genetic screening and target validation through to preclinical model assessment, supporting both hypothesis-driven and unbiased screens.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing and pathway mapping via quantitative fitness outputs.
- Screening: Provides reproducible, high-throughput assay data for compound or genetic library evaluation.
- Analytics: Generates growth curves, doubling times, and ranked fitness metrics for robust statistical comparison.
- Translational Research: Links microbial phenotypes to disease-relevant mechanisms, informing preclinical prioritization.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for repeated use across diverse screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Standardizes data acquisition and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial genetics, quantitative modeling, and computational analysis.
- Needs access to automated imaging systems, robust data storage, and multi-core computational infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of metadata, plate tracking, and data formats.
- Adaptable to various microbial species and library formats with appropriate protocol adjustments.
- Throughput and precision depend on automation level and quality control of image analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
2:39
Manual Quantitative Fitness Analysis Protocol: Culturing Yeast Strains
3:11
Fully Automated Quantitative Fitness Analysis Protocol
4:48
Image and Experimental Metadata Capture: Automated Quantitative Fitness and Data Analysis
9:32
Representative Fitness Analysis Results
10:40
Conclusion
0:05
Title
