大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型：通过焦油紫染色评估脑梗死

本实验的总体目标是在小鼠中模拟缺血性脑卒中。首先，暂时性结扎颈总动脉，而尽可能远端地永久结扎颈外动脉。在颈外动脉分叉上方放置另一根略紧的临时缝线。

第二步是使用反向作用镊子夹闭颈内动脉，以避免出血。然后在永久性和临时性结扎线之间切断颈外动脉。接下来，将硅胶包被的单丝线引入颈外动脉中。

然后将ECA倒转，插入单丝线至ICA，直至其进入大脑中动脉起始部。一小时后，通过撤出单丝线恢复血流，以模拟人类血栓栓塞性卒中后溶栓治疗所实现的血流再通。最终，可在再灌注后即刻以及再灌注后的不同时间点评估神经功能缺损程度，以此反映T-M-C-A-O模型的成功情况及脑梗死的严重程度。

使用美国国立卫生研究院（NIH）的 Cyan 图像软件计算经氯化三苯基四氮唑（Crestal Violet）染色的代表性脑切片上的梗死体积。采用血管内缝线法进行短暂性大脑中动脉闭塞的主要优势之一，在于其能够模拟患者缺血性卒中后血流再通的情况，而在小鼠中建立该模型则为利用基因标记工具鉴定目标蛋白的作用提供了可能。在卒中研究中，短暂性大脑中动脉闭塞通常在2至3月龄、体重介于22至28克之间的雄性C57BL/6小鼠上进行。

本方案已获得 IRCM 生物伦理护理委员会批准，旨在提高梗死体积的可重复性。我们使用的是 Doco Corporation 生产的可重复使用的 12 毫米长、6-0 硅涂层单丝线。术前两小时。

以每千克0.03毫克的剂量对小鼠进行腹腔注射布托啡诺。开始操作时，使用5%异氟烷对小鼠进行麻醉，并以2.5%异氟烷维持麻醉。手术期间使用加热垫保持小鼠体温恒定。用70%乙醇或碘伏对小鼠腹部皮肤进行消毒。然后在颈部做正中切口，并在体视显微镜下分离皮下软组织。

钝性分离小鼠颈部以暴露气管。接着，牵开肌肉以定位颈总动脉。仔细分离左侧颈总动脉与其周围组织。

在动脉周围放置一段临时的5-0丝线缝合线，将其剪成20毫米的段。注意不要损伤迷走神经。接下来，分离左侧颈总动脉内侧支（ICA）与外侧支（ECA）的分叉处，并尽可能远端地在外侧颈总动脉（ECA）周围放置一永久性缝合线。

在颈外动脉分叉上方再置一根临时缝线。然后使用反向动作镊子夹闭左侧颈内动脉，以防止出血。再次注意，务必避免损伤迷走神经。

在ECA分叉为ECA和ICA之前，且在先前放置的永久性缝线与临时性缝线之间，于ECA上剪开一个小孔。接着，将一根12毫米长、六零规格、带硅涂层的单丝缝线经ECA断端引入，完全切断ECA，并将单丝缝线反向送入ICA内。结扎缝线以确保牢固，防止出血，随后移除反向操作镊子。

然后将单丝引入Willis环，直至单丝阻塞大脑中动脉（MCA）起始部。其插入深度约为颈外动脉（ECA）与颈总动脉（CCA）分叉处远端9至10毫米。通常情况下，单丝会受阻而无法继续前进。

注意避免穿破腭降动脉。应将颈外动脉上的缝线扎紧，以确保尼龙丝固定到位。现在使用自动夹式伤口闭合系统关闭皮肤。

在术后期（60分钟）内，皮下注射一毫升生理盐水溶液，并将小鼠置于红外加热灯下。按之前方法麻醉小鼠，取下自动夹子，轻轻打开ECA上的结扎线，使单丝线退出，血液重新灌注。随后永久结扎ECA上的临时缝线，以防止出血。

脑卒中后1小时，撤出单丝线并保留以备重复使用。接着，移除颈总动脉（CCA）上的临时缝线，以允许血液重新循环。缝合伤口并进行皮下缝合。

向小鼠注射另一毫升生理盐水。确认动物恢复活动能力后，将其放回笼中，并将笼子的一半置于加热垫上，以便小鼠自主选择所处环境。术后12小时，所有假手术组小鼠接受第二次剂量的丁丙诺啡。

所有操作步骤均相同，但手术后不插入单丝。通过评估神经功能缺损来确认T-M-C-A-O模型建立的成功，并在灌注后1、24、48和72小时，采用六分制对小鼠的神经功能缺损程度进行评分，具体如下：0分表示正常；1分表示轻度异常，即被尾部提起时出现轻微转向，伴或不伴有间歇性卷曲，超过50%的尝试中向对侧卷曲。

2分表示在超过50%的尝试中，向对侧出现轻度、持续的卷曲；3分表示持续、有力且迅速的卷曲，小鼠保持卷曲姿势超过1至2秒。

其鼻子几乎触及尾巴。4级表示严重卷曲。进一步发展为桶状，丧失行走或书写反射，5级表示昏迷或隆起。

用 PBS 溶液灌注后，迅速将脑组织在异戊烷中冷冻，并在 -80 摄氏度下保存。请注意，根据计划进行的免疫组织化学研究，小鼠脑组织也可用 4% 多聚甲醛灌注。接下来，使用冷冻切片机切割 17 µm 厚的冠状脑切片，共使用 30 张载玻片。

每30个切片中取一片置于同一张载玻片上。然后用结晶紫对第1张和第15张切片进行染色。为了更准确地估算损伤体积，可使用图像分析系统（如美国国立卫生研究院提供的Scion图像软件）评估病灶边界，即在左右脑半球中呈现白色的梗死区域。

在所有脑切片上重复此 D 限制操作。以任意单位计算梗死体积，并将其表示为每张切片对侧未损伤区域的百分比。将其他切片保存在零下 80 摄氏度，用于免疫组织化学研究。

神经评分评估证实了T-M-C-A-O在经颅内手术处理的小鼠中取得了成功。如图所示，小鼠表现出持续、强烈且中等程度的卷曲，其身体保持卷曲状态超过一到两秒，鼻子几乎触及尾巴。在本实验中，所有小鼠均表现出至少轻度持续的卷曲反应，这在整个测试期间对应神经评分为2分。

采用克雷斯尔紫染色以评估脑梗死范围。以下显示的是小鼠经T-M-C-A-O处理后，再灌注72小时后的代表性冠状脑切片，经克雷斯尔紫染色后的结果。梗死区域主要位于纹状体、皮层及邻近脑区，由于克雷斯尔紫无法染色，这些区域呈白色，图中已标注。

图中紫色部分显示的是损伤体积，即右侧半球的白色部分占左侧对侧未损伤半球区域的百分比。缺血性脑卒中后，C57BL/6雄性小鼠的梗死体积约占未损伤半球的70%。该方法可实现高度可重复的病灶损伤。

观看本视频后，您应能充分掌握如何在小鼠中实施短暂性缺血性脑卒中模型。此外，通过梗死体积定量分析法来测量脑组织损伤范围，可使您能够利用免疫组织化学方法检测大量相关标志物，具有显著优势。感谢观看，祝您的实验顺利成功。