小鼠模型的腔内MCAO脑梗塞评价甲酚紫染色

可植入大脑中闭塞小鼠模型中，本文提出的。脑梗塞的程度进行评估，神经行为学评分和甲酚紫染色，染色，TTC替代，提供了巨大的优势，以测试在并行的兴趣标记。

该程序的总体目标是模拟小鼠的缺血性中风。首先，暂时结扎颈总动脉，而颈外动脉尽可能向远端永久结扎。另一根稍紧的临时缝合线放置在分叉上方的 ECA 上。

第二步是用反向作用镊子夹住颈内动脉，以避免出血。然后在永久和临时结字之间剪断 ECA。接下来，将硅涂层单丝引入 ECA 中。

然后将 ECA 倒置以将单丝引入 ICA，直到它包括大脑中动脉的底部。一小时后，通过去除单丝来恢复血流，以模拟人类血栓栓塞爪裂解后血流的恢复。最终，反映 T-M-C-A-O 成功和梗死严重程度的神经功能缺损可以在再灌注后和再灌注后的不同时间进行评估。

来自 NIH 的青色图像软件用于计算由牙槽嵴 Violet 染色的代表性脑切片上的梗塞体积。使用腔内细丝技术进行短暂性大脑中动脉闭塞的主要优点之一是它模拟患者的缺血性中风，恢复血流，并且在小鼠中开发该程序提供了使用标记遗传学工具确定靶蛋白作用的可能性。在中风中，对 2 至 3 个月大的雄性 C 57 黑色 6 只体重在 22 至 28 克之间的小鼠进行短暂的大脑中动脉闭塞。

该方案已获得 IRCM 生物伦理护理委员会的批准，以提高梗死体积的可重复性。我们正在使用 Doco Corporation 的可重复使用的 12 毫米长、6 欧姆硅涂层单丝。手术前 2 小时。

每公斤 0.03 毫克的剂量向小鼠腹膜内注射丁丙诺啡。要开始该程序，用 5%isof 氟麻醉小鼠并保持 2.5% ISO 氟的麻醉，使用加热垫在手术过程中保持小鼠体温恒定，用 70% 乙醇或优碘消毒小鼠的蕨类皮肤。然后在颈部做一个中线切口，在立体显微镜下拉开软组织。

钝头解剖小鼠脖子，以露出气管。接下来，回缩肌肉以找到颈动脉。小心地从周围组织中解剖左颈总动脉。

放置临时的 5 oh 丝缝合线，在动脉周围切成 20 毫米的段。注意不要损伤迷走神经。接下来，将左颈内总动脉 （ICA） 和颈总外动脉 （ECA） 的分叉分开，尽可能远端在 ECA 周围放置永久缝合线。

以及分叉上方 ECA 上的另一条临时缝合线。然后使用反向作用镊子夹住左侧 ICA，以避免出血。同样，要非常小心，不要伤害迷走神经。

在 ECA 和 ICA 分叉之前以及之前放置的永久和临时缝合之间，在 ECA 上切一个小孔。接下来，将 12 毫米 6 oh 硅涂层单丝缝合线引入 ECA，完全切割 ECA 并将单丝倒置到 ICA 中。将缝合线系紧以防止出血并取下反向作用的镊子。

然后将单丝引入 Willis 环中，直到单丝阻塞 MCA 挡块的基部。它的插入距离 ECA 和 CCA 的分叉处约 9 到 10 毫米。通常，单丝会被堵塞，无法再移动。

小心不要穿透 tego 腭动脉。将缝合线紧紧系在 ECA 上，以便将细丝固定到位。现在使用自动夹伤口闭合系统闭合皮肤。

下注射 1 毫升生理盐水溶液，并在封闭后期间（即 60 分钟）将小鼠置于红外加热灯下。像以前一样麻醉小鼠并取下自动夹，稍微打开 ECA 上的缝合线，让单丝抽出并让血液再灌注。然后永久系上 ECA 上的临时缝合线以防止失血。

中风后 1 小时，取出单丝并保留以备重复使用。接下来，取下 CCA 上的临时缝合线，让血液再循环。闭合伤口并皮下注射。

再向小鼠注射 1 毫升生理盐水。确保动物恢复活动能力后，将其放回笼子中，并将笼子的一半放在加热垫上，让老鼠选择它们的环境。手术后 12 小时，小鼠接受另一剂丁丙诺啡进行所有假手术。

所有程序都是相同的，除了手术后没有插入单丝。评估神经功能缺损以确认 T-M-C-A-O 的成功并确定其效率评分小鼠在灌注后 1、24、48 和 72 小时的神经功能缺损，采用六分制，0 等于正常，1 等于轻度，转动有或没有不一致的卷曲当被尾巴捡起时。超过 50% 尝试向对侧卷曲。

2 等于轻度持续卷曲超过 50% 尝试向对侧卷曲。三等于一致、有力和即时的卷曲。鼠标保持卷曲位置超过 1 到 2 秒。

它的鼻子几乎到了尾巴。4 等于严重的冰壶。进展为桶状、行走或写作、反射 5 等于昏迷或土丘。

用 PBS 溶液灌注后，将大脑快速放入 isop 戊烷中，并将其储存在零下 80 摄氏度。请注意，根据计划的免疫组织化学研究，小鼠大脑也可以灌注 4% 多聚甲醛。接下来，使用低温恒温器通过 17 张载玻片切割 30 微米的冠状脑切片。

将每 30 个部分的 1 个部分放在同一张幻灯片上。然后用牙槽槽骨紫对第一张和第 15 张载玻片进行染色。为了更准确地估计损伤量，请使用图像分析系统（例如 NIH 的 Scion 图像）来评估病变 deli，即在左右脑半球呈白色的梗塞区域。

对所有脑切片重复此 D 限制。以任意单位计算梗死体积，并将其表示为每个切片对侧非病变面积的百分比。将其他载玻片保持在零下 80 摄氏度以进行免疫组织化学研究。

神经评分评估证实了 T-M-C-A-O 在我接受腔内手术中的成功。如图所示，观察到一致、强烈和中等的卷曲，鼠标保持卷曲姿势超过一到两秒，鼻子几乎够到尾巴。在我们的实验中，所有小鼠都表现出至少轻微一致的卷曲，这对应于整个测试期间的神经评分为 2。

进行 Kressel 紫染色以评估脑梗塞的程度。按照此处显示的 T-M-C-A-O 所示，再灌注后 72 小时后用嵴紫染色的小鼠脑的代表性冠状切片。梗塞区域，主要是纹状体和皮质以及相邻的大脑区域，被标记为白色，因为它没有被嵴染色。

此处显示的紫色是损伤体积，即右半球的白色部分，表示为左半球对侧非病变区域的百分比。缺血性中风后 C 57 黑色 6 只雄性小鼠的梗死体积约占非束缚半球的 70%。该程序提供了很强的病变可重复性。

观看此视频后，您应该对如何对小鼠进行短暂性脑缺血性卒中有很好的了解。此外，测量大脑实际体积的测验违规方法为您提供了巨大的优势，即拥有大量材料来通过免疫化学测试相关标记。感谢您的观看，祝您的实验好运。