Name: 小鼠模型的腔内MCAO脑梗塞评价甲酚紫染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学习小鼠腔内线栓法建立短暂性大脑中动脉闭塞模型，通过甲酚紫染色评估脑梗死体积和神经功能缺损。该方法可模拟缺血性卒中并支持遗传学研究。

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本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）团队项目资助 # CTP 82946、加拿大卫生研究院（CIHR）资助 # MOP 102741、加拿大讲席计划 # 216684 以及 Strauss 基金会的支持。E.R. 获得了加拿大心脏与中风基金会博士后奖学金的资助。

短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）
 1. 手术步骤（图1）
 对2至3月龄的雄性C57Bl/6小鼠（22–28 g）进行短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）手术。本实验方案已获IRCM生物伦理委员会动物护理部门批准。手术器械通过高压灭菌法（121 °C、15 psi，持续60分钟）进行灭菌。每只动物实验之间，使用高温珠灭菌器对器械进行灭菌（15秒）。手术台及其他设备使用70%乙醇进行消毒。
 手术前2小时，通过腹腔注射给予小鼠布托啡诺（0.03 mg/kg 体重）进行镇痛。
 图 1A。
 <ol>
 <li>使用5%异氟烷对小鼠进行深度麻醉，随后以2.5%异氟烷维持麻醉。手术期间使用加热垫保持小鼠体温恒定。</li>
 <li>使用70%乙醇或碘伏对小鼠毛发和皮肤进行消毒。由于剃毛可能产生毛发碎片、微小擦伤及炎症，进而影响脑卒中病理生理过程，因此我们不剃除小鼠毛发。</li>
 <li>沿颈部正中线做切口，并轻轻分离软组织。</li>
 <li>在体视显微镜（Stemi 2000, Zeiss）下进行钝性分离，暴露气管并牵开肌肉以定位颈总动脉。</li>
 <li>仔细分离左侧颈总动脉（CCA）周围组织，并使用5-0丝线剪成20 mm段制成的临时缝线（1）暂时阻断CCA。操作时需格外小心，避免损伤迷走神经。</li>
 <li>分离左侧颈内动脉（ICA）与颈外动脉（ECA）的分叉处。在ECA远端尽可能远处放置一根永久性缝线（2），并在分叉远端ECA上再放置一根稍紧的临时缝线（3）。</li>
 <li>使用反向镊子夹闭左侧ICA（4），以防止出血。操作时需格外小心，避免损伤迷走神经。</li>
 <li>在永久性缝线（2）与临时缝线（3）之间的ECA上剪开一个小孔（5）。</li>
 </ol>
 图 1B。
 <ol start="9">
 <li>将一根长约12 mm、6-0规格的单丝硅胶涂层缝合线（Doccol Corporation，约9–10 mm长度涂有硅胶）插入ECA（6），在永久缝线远端完全切断ECA，并将阻断器翻转入ICA。用缝线在单丝线周围牢固结扎以防止出血，随后移除反向操作镊子。</li>
 <li>推进阻断器以闭塞Willis环中大脑中动脉（MCA）的起始部。当插入深度达到ECA与CCA分叉处远端约9–10 mm时停止推进，此时阻断器受阻无法继续前进。操作时需格外小心，避免穿入翼腭动脉。结扎ECA上的缝线（3），牢固固定单丝线的位置。</li>
 <li>使用自动夹式伤口闭合系统关闭皮肤。</li>
 <li>皮下注射1 ml生理盐水，并在术后整个观察期（60 min）内将小鼠置于红外加热灯下保温。</li>
</ol>
 2. 大脑中动脉血流的恢复
 在重新麻醉前，可通过神经评分评估手术的成功情况。
 <ol>
 <li>按照先前所述方法麻醉小鼠，并移除自动夹具。</li>
 <li>轻轻松开颈外动脉（ECA）上的缝线（3），以便抽出单丝线并恢复血液再灌注。</li>
 <li>永久结扎颈外动脉（ECA）上的临时缝线，以防止出血。单丝线保留以供重复使用。</li>
 <li>移除颈总动脉（CCA）上的临时缝线（1），以恢复血液再循环。</li>
 <li>缝合伤口。小鼠应皮下注射另1 ml生理盐水溶液。</li>
 <li>将小鼠置于红外加热灯下1小时。在确认动物恢复活动能力后，将其放回笼中，并继续置于加热垫和毛巾上72小时。注意仅将笼子的一半放置在加热垫上，以便小鼠可自行选择适宜环境。由于术后通常会出现体重下降，需将软化食物置于培养皿中以促进进食。 
 术后12小时，小鼠再次接受一次丁丙诺啡给药（0.03 mg/kg 体重，腹腔注射）。</li>
</ol>
 3. 假手术操作
 假手术组的所有操作步骤均相同，只是不插入阻断器。
 4. 神经功能评分
 神经功能缺损可用于评估再灌注后即刻tMCAO手术的成功情况，以及后续损伤严重程度的估计。神经功能缺损评分按照先前所述方法5进行，于再灌注后1、24、48和72小时分别实施。采用扩展的六分制评分标准：
 <ul>
 <li>0：正常。</li>
 <li>1：轻度环形运动行为，抓尾提起时可伴有或不伴有方向不一致的旋转，向对侧旋转的尝试&lt;50%。</li>
 <li>2：轻度持续性环形运动，向对侧旋转的尝试&gt;50%。</li>
 <li>3：持续性强而迅速的环形运动，小鼠保持旋转姿势超过1–2秒，鼻尖几乎触及尾巴。</li>
 <li>4：严重旋转发展为桶状翻滚，丧失行走能力或翻正反射。</li>
 <li>5：昏迷或濒死状态。</li>
</ul>
 5. 甲苯胺蓝染色（图2）
 在灌注 PBS 溶液后，将脑组织迅速置于异戊烷中冷冻，并保存于 -80 °C。根据计划进行的免疫组织化学研究，小鼠脑组织也可用 4% 多聚甲醛（PFA）进行灌注固定。使用恒冷箱对脑组织进行冠状面切片（厚度 17 μm）。每 30 片中选取 1 片收集到同一张载玻片上，以代表全脑损伤情况。对于体积定量分析，采用焦油紫染色对 2 张载玻片进行染色，并使用图像分析系统（Scion Corporation，Frederick，MD）评估病灶。损伤体积以任意单位（像素）计算，并表示为每张切片对侧未损伤区域的百分比。其他载玻片则保存于 -80 °C，用于后续免疫组织化学研究。 alternatively，PFA 固定的脑组织可使用振动切片机切成 30–50 μm 厚的切片，并按照 Han et al. (2009)6 推荐的方法测量梗死体积。

<ol><li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%2C+I%3A+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. rain <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((infarction+is+not+reduced+in+SOD-1+transgenic+mice+after+a+permanent+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia.</a> Neuroreport. 5, 293-296 (1993).</li>
<li>Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenic+mice+are+highly+resistant+to+reperfusion+injury+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 25, 165-170 (1994).</li>
<li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+stroke+model+guidelines+for+preclinical+stroke+trials+%281st+edition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Stroke+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition.</a> J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).</li>
<li>Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlortetracycline+and+demeclocycline+inhibit+calpains+and+protect+mouse+neurons+against+glutamate+toxicity+and+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia.</a> J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).</li>
<li>Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postischemic+brain+injury+is+attenuated+in+mice+lacking+the+beta2-adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor.</a> Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).</li>
<li>Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCSK9+reduces+the+protein+levels+of+the+LDL+receptor+in+mouse+brain+during+development+and+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke.</a> J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).</li>
<li>Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+pterygopalatine+arterial+blood+flow+decreases+infarct+volume+variability+in+a+mouse+model+of+intraluminal+suture+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).</li>
<li>Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+suture+size+and+carotid+clip+application+upon+blood+flow+and+infarct+volume+after+permanent+and+temporary+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Res. 970, 131-192 (2003).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li>
</ol>

本文的制作与免费访问由蔡司公司（Zeiss, Inc.）赞助。

已开发出多种脑卒中模型以模拟患者脑卒中的后果。选择何种脑卒中模型取决于具体的生物学问题。血管内大脑中动脉闭塞（MCAO）模型可模拟患者中最常见的缺血性脑卒中类型之一，且相较于Tamura模型具有更小的侵入性和更高的可重复性4,7。该模型在神经保护、神经修复及细胞死亡分析方面具有重要研究价值。血管内MCAO模型的成功依赖于多种因素，如动物的性别、年龄和体重、体温、麻醉方式以及手术时间，这些因素均需严格控制。阻塞线的物理特性（如头端直径、长度、形状和柔韧性）对MCAO模型的一致性至关重要4。本文中我们采用的是由Doccol Corporation提供的12 mm长、6-0规格的单丝线，其近端9-10 mm处涂有硅胶。该单丝线的一大优势在于可减少蛛网膜下腔出血；同时，由于其涂层长度足以覆盖全部颈内动脉（ICA）长度，从而有效阻断来自Willis环前、后交通动脉及翼腭动脉（PPA）的残余血流，显著降低梗死体积的变异性（本实验室中变异率约为15%）8。此外，结扎颈总动脉（CCA）也可进一步减小梗死体积的变异性9。
	通过不同方法可评估tMCAO后脑损伤的程度。神经功能缺损可如前所述进行测量，但该方法难以实现高效评估。通常采用TTC染色来检测梗死范围。近年来，磁共振技术也被用于评估，尤其适用于神经保护治疗的研究。为了理解卒中过程中涉及的细胞机制，如神经修复、细胞死亡或细胞增殖，通过免疫组织化学检测多种标志物至关重要且信息丰富。因此，我们的脑切片制备方案具有显著优势，既可实现上述分析，又可最大限度减少实验小鼠的使用数量。此外，Tureyen et al. 10 报道指出，焦油紫染色与TTC染色之间具有良好的相关性。

<table><tbody><tr><td>体视显微镜 </td><td><a href="http://www.zeiss.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>高亮度光纤光源照明器 </td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>CDMV</td><td>108737</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Gaymar Medsearch</td><td>TP22G</td><td></td></tr><tr><td>红外加热灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超细镊子，型号 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78320-5TI</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀，3 mm 刃口，直型</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72932-01</td><td></td></tr><tr><td>LA-1 和 MPF-1 型，全平刃</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77926-5S</td><td></td></tr><tr><td>负压操作镊子，KOPINC 5 型</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72850-F</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀，5 1/2 英寸，直型</td><td>Cedarlane</td><td>72960</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip 初学者套装</td><td>Harvard apparatus</td><td>34-0557</td><td></td></tr><tr><td>BD Autoclip 伤口闭合系统，9 mm 长，100 个/包</td><td>Fisher</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>5-0 缝合线</td><td>Harvard apparatus</td><td>517763</td><td></td></tr><tr><td>缝合材料 PDS II 单股紫线，5-0，RB-1；Z303H</td><td>CDMV</td><td>6167</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 长 6-0 硅涂层单股缝合线</td><td>Doccol Corporation</td><td>60SPRePK5</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器 </td><td>Fisher</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>26G 1/2 针头</td><td>Fisher</td><td>BD-305111</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C57BL/6&lt;/em&gt; 小鼠</td><td>IRCM</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大脑中动脉闭塞（mcao）小鼠模型：通过焦油紫染色评估脑梗死

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

脑卒中是全球范围内导致死亡的第三大原因，也是导致残疾的首要原因。缺血性脑卒中约占所有脑卒中病例的80%。然而，目前唯一可用于治疗急性缺血性脑卒中的药物是溶栓剂组织型纤溶酶原激活物（tPA）。这一现状促使研究人员在多种物种中建立了多种缺血性脑卒中模型。其中，已开发出两大类啮齿类动物模型：全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型。为了模拟临床上约80%的血栓性或栓塞性脑卒中发生在大脑中动脉（MCA）供血区域的状况，采用经腔内阻塞大脑中动脉（MCAO）的模型在脑卒中研究中具有高度相关性。该模型最早由Koizumi et al. 于1986年在大鼠中建立1。由于小鼠具有易于进行遗传操作的优势，此类模型也已在小鼠中成功建立2-3。
	本文介绍了在C57/Bl6小鼠中进行的短暂性大脑中动脉闭塞（MCA）操作步骤。既往研究报道，栓塞线的物理特性，如头端直径、长度、形状和柔韧性，对梗死体积的可重复性至关重要。 4此处使用了市售的硅涂层单丝线（Doccol Corporation）。另一个显著优势是，该单丝线可降低诱导蛛网膜下腔出血的风险。使用蔡司体视显微镜Stemi 2000，将硅涂层单丝线插入颈内动脉（ICA） 通过 在颈外动脉（ECA）上做一切口，将单丝线栓插入并阻塞大脑中动脉（MCA）起始部。1小时后拔出线栓以恢复血流，模拟人类血栓栓塞性血凝块溶解后的再灌注过程。脑梗死范围可通过神经功能评分及梗死体积测量进行评估。因此，缺血性小鼠在不同再灌注时间点接受神经功能评分分析。为评估梗死体积，通常采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法。本实验采用焦油紫（cresyl violet）染色，因其可为免疫组织化学检测多种关键标志物提供便利。本视频中，我们报道了大脑中动脉阻塞（MCAO）手术操作、神经功能评分以及采用焦油紫染色评估梗死体积的方法。

神经功能评分评估可确认卒中后tMCAO模型的成功建立，并判断再灌注后的tMCAO模型效率。在我们的实验中，所有接受血管内栓塞手术的小鼠均表现出至少轻度持续性蜷缩（神经功能评分为2分），且神经功能缺损通常可持续稳定达72小时。大多数小鼠表现为轻度持续性蜷缩（神经功能评分为2分）。对于未出现蜷缩行为的小鼠，将被排除在研究之外。然而，神经功能评分评估无法使我们区分海马损伤与海马完整的小鼠。
	手术当天未观察到死亡情况，表明未发生蛛网膜下腔出血。当发现小鼠出现蛛网膜下腔出血时，该小鼠将被系统性地排除在分析之外。使用来自Doccol Corporation的硅涂层单丝线，其表面比实验室自制的单丝线更光滑，可提高tMCAO模型的成功率，并减少蛛网膜下腔出血的发生。在此模型中，24小时至72小时之间的死亡率为14%，这与通常报道的60分钟阻塞模型的结果一致。观察到的死亡率可能是由于该小鼠品系的梗死体积较大所致。此外，还观察到病变具有高度可重复性（标准差为15%），这对于研究神经保护分子尤为重要，因为模型本身的变异性可能会掩盖药物的作用效果。
	为了评估tMCAO后脑损伤的程度，我们选择使用焦油紫染色（图2）而非TTC染色，以便获得充足的组织材料用于检测相关标志物6。损伤范围相对一致。然而，我们注意到部分小鼠的海马体也受到损伤（约占小鼠总数的30%）。值得注意的是，焦油紫染色可在术后长达1周内应用。文献中报道的脑梗死百分比在不同研究之间存在差异，这取决于小鼠品系的选择、麻醉方式、脑切片厚度、所用单丝线栓的规格或染色方法6, 7。
	<img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="Cerebral artery diagram; ACA, MCA, PCA, ECA pathways; shows blood flow distribution." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 使用硅胶包被的管内单丝线栓闭塞大脑中动脉的示意图。A小鼠脑及脑动脉简化示意图，显示为引入硅胶包被单丝线而进行的连续缝合与夹闭操作。 B. 单丝线穿过威尔氏环的位置示意图。单丝线经颈内动脉（ICA）置入 通过 ECA 用于阻断 MCA 的起始部。 ACA，大脑前动脉；BA，基底动脉；CCA，颈总动脉；C. Willis，威尔利斯环；ECA，颈外动脉；ICA，颈内动脉；MCA，大脑中动脉；PCA，后交通动脉；PPA，翼腭动脉。
	<img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="小鼠脑组织切片，脑卒中实验；脑梗死的比较分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 小鼠脑组织在再灌注后 72 小时的代表性冠状切片，经焦油紫染色。 梗死区域（主要为纹状体、皮层及邻近脑区）呈白色（未被焦油紫染色）。损伤体积（右侧半球白色部分）被界定，并以对侧未受损区域（左侧半球）的百分比表示。

本文介绍了小鼠大脑中动脉腔内阻塞模型。通过神经功能评分和焦油紫染色来评估脑梗死范围，后者是TTC染色的一种替代方法，具有可同时平行检测多种目的标志物的显著优势。

大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型：通过焦油紫染色评估脑梗死

脑卒中是全球第三大死亡原因，也是致残的首要原因。缺血性脑卒中约占所有脑卒中病例的80%。

本实验的总体目标是在小鼠中模拟缺血性脑卒中。首先，暂时性结扎颈总动脉，而尽可能远端地永久结扎颈外动脉。在颈外动脉分叉上方放置另一根略紧的临时缝线。第二步是使用反向作用镊子夹闭颈内动脉，以避免出血。然后在永久性和临时性结扎线之间切断颈外动脉。接下来，将硅胶包被的单丝线引入颈外动脉中。然后将ECA倒转，插入单丝线至ICA，直至其进入大脑中动脉起始部。一小时后，通过撤出单丝线恢复血流，以模拟人类血栓栓塞性卒中后溶栓治疗所实现的血流再通。最终，可在再灌注后即刻以及再灌注后的不同时间点评估神经功能缺损程度，以此反映T-M-C-A-O模型的成功情况及脑梗死的严重程度。使用美国国立卫生研究院（NIH）的 Cyan 图像软件计算经氯化三苯基四氮唑（Crestal Violet）染色的代表性脑切片上的梗死体积。采用血管内缝线法进行短暂性大脑中动脉闭塞的主要优势之一，在于其能够模拟患者缺血性卒中后血流再通的情况，而在小鼠中建立该模型则为利用基因标记工具鉴定目标蛋白的作用提供了可能。在卒中研究中，短暂性大脑中动脉闭塞通常在2至3月龄、体重介于22至28克之间的雄性C57BL/6小鼠上进行。本方案已获得 IRCM 生物伦理护理委员会批准，旨在提高梗死体积的可重复性。我们使用的是 Doco Corporation 生产的可重复使用的 12 毫米长、6-0 硅涂层单丝线。术前两小时。以每千克0.03毫克的剂量对小鼠进行腹腔注射布托啡诺。开始操作时，使用5%异氟烷对小鼠进行麻醉，并以2.5%异氟烷维持麻醉。手术期间使用加热垫保持小鼠体温恒定。用70%乙醇或碘伏对小鼠腹部皮肤进行消毒。然后在颈部做正中切口，并在体视显微镜下分离皮下软组织。钝性分离小鼠颈部以暴露气管。接着，牵开肌肉以定位颈总动脉。仔细分离左侧颈总动脉与其周围组织。在动脉周围放置一段临时的5-0丝线缝合线，将其剪成20毫米的段。注意不要损伤迷走神经。接下来，分离左侧颈总动脉内侧支（ICA）与外侧支（ECA）的分叉处，并尽可能远端地在外侧颈总动脉（ECA）周围放置一永久性缝合线。在颈外动脉分叉上方再置一根临时缝线。然后使用反向动作镊子夹闭左侧颈内动脉，以防止出血。再次注意，务必避免损伤迷走神经。在ECA分叉为ECA和ICA之前，且在先前放置的永久性缝线与临时性缝线之间，于ECA上剪开一个小孔。接着，将一根12毫米长、六零规格、带硅涂层的单丝缝线经ECA断端引入，完全切断ECA，并将单丝缝线反向送入ICA内。结扎缝线以确保牢固，防止出血，随后移除反向操作镊子。然后将单丝引入Willis环，直至单丝阻塞大脑中动脉（MCA）起始部。其插入深度约为颈外动脉（ECA）与颈总动脉（CCA）分叉处远端9至10毫米。通常情况下，单丝会受阻而无法继续前进。注意避免穿破腭降动脉。应将颈外动脉上的缝线扎紧，以确保尼龙丝固定到位。现在使用自动夹式伤口闭合系统关闭皮肤。在术后期（60分钟）内，皮下注射一毫升生理盐水溶液，并将小鼠置于红外加热灯下。按之前方法麻醉小鼠，取下自动夹子，轻轻打开ECA上的结扎线，使单丝线退出，血液重新灌注。随后永久结扎ECA上的临时缝线，以防止出血。脑卒中后1小时，撤出单丝线并保留以备重复使用。接着，移除颈总动脉（CCA）上的临时缝线，以允许血液重新循环。缝合伤口并进行皮下缝合。向小鼠注射另一毫升生理盐水。确认动物恢复活动能力后，将其放回笼中，并将笼子的一半置于加热垫上，以便小鼠自主选择所处环境。术后12小时，所有假手术组小鼠接受第二次剂量的丁丙诺啡。所有操作步骤均相同，但手术后不插入单丝。通过评估神经功能缺损来确认T-M-C-A-O模型建立的成功，并在灌注后1、24、48和72小时，采用六分制对小鼠的神经功能缺损程度进行评分，具体如下：0分表示正常；1分表示轻度异常，即被尾部提起时出现轻微转向，伴或不伴有间歇性卷曲，超过50%的尝试中向对侧卷曲。2分表示在超过50%的尝试中，向对侧出现轻度、持续的卷曲；3分表示持续、有力且迅速的卷曲，小鼠保持卷曲姿势超过1至2秒。其鼻子几乎触及尾巴。4级表示严重卷曲。进一步发展为桶状，丧失行走或书写反射，5级表示昏迷或隆起。用 PBS 溶液灌注后，迅速将脑组织在异戊烷中冷冻，并在 -80 摄氏度下保存。请注意，根据计划进行的免疫组织化学研究，小鼠脑组织也可用 4% 多聚甲醛灌注。接下来，使用冷冻切片机切割 17 µm 厚的冠状脑切片，共使用 30 张载玻片。每30个切片中取一片置于同一张载玻片上。然后用结晶紫对第1张和第15张切片进行染色。为了更准确地估算损伤体积，可使用图像分析系统（如美国国立卫生研究院提供的Scion图像软件）评估病灶边界，即在左右脑半球中呈现白色的梗死区域。在所有脑切片上重复此 D 限制操作。以任意单位计算梗死体积，并将其表示为每张切片对侧未损伤区域的百分比。将其他切片保存在零下 80 摄氏度，用于免疫组织化学研究。神经评分评估证实了T-M-C-A-O在经颅内手术处理的小鼠中取得了成功。如图所示，小鼠表现出持续、强烈且中等程度的卷曲，其身体保持卷曲状态超过一到两秒，鼻子几乎触及尾巴。在本实验中，所有小鼠均表现出至少轻度持续的卷曲反应，这在整个测试期间对应神经评分为2分。采用克雷斯尔紫染色以评估脑梗死范围。以下显示的是小鼠经T-M-C-A-O处理后，再灌注72小时后的代表性冠状脑切片，经克雷斯尔紫染色后的结果。梗死区域主要位于纹状体、皮层及邻近脑区，由于克雷斯尔紫无法染色，这些区域呈白色，图中已标注。图中紫色部分显示的是损伤体积，即右侧半球的白色部分占左侧对侧未损伤半球区域的百分比。缺血性脑卒中后，C57BL/6雄性小鼠的梗死体积约占未损伤半球的70%。该方法可实现高度可重复的病灶损伤。观看本视频后，您应能充分掌握如何在小鼠中实施短暂性缺血性脑卒中模型。此外，通过梗死体积定量分析法来测量脑组织损伤范围，可使您能够利用免疫组织化学方法检测大量相关标志物，具有显著优势。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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学习小鼠腔内线栓法建立短暂性大脑中动脉闭塞模型，通过甲酚紫染色评估脑梗死体积和神经功能缺损。该方法可模拟缺血性卒中并支持遗传学研究。

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