Name: 从老鼠肠道树突状细胞和巨噬细胞的分离和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学习从小鼠肠道组织中快速分离树突状细胞和巨噬细胞的方法，通过酶解消化和流式细胞术进行表型分析与功能表征，适用于免疫学研究中细胞因子产生及抗原呈递机制的深入探索。

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感谢亚伦·雷（埃默里大学儿科系和亚特兰大儿童保健中心流式细胞分选核心实验室）提供的细胞分选技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AA01787001、克罗恩病与结肠炎基金会职业发展奖以及埃默里-埃格尔斯顿儿童研究中心种子基金（资助号：T.L.D.）资助支持。

1. 肠道上皮细胞的分离与解离
试剂与仪器的准备：
<ul>
	<li>将无 Ca2+/Mg2+ 的 PBS（CMF PBS） warmed 至室温。</li>
	<li>将含 5% FBS 的无 Ca2+/Mg2+ HBSS（CMF HBSS/FBS）和 2 mM EDTA warmed 至室温。</li>
	<li>将轨道摇床预热至 37 °C。</li>
</ul>
注意： 步骤 1.1 至 1.7 必须尽快完成，以尽量减少细胞死亡并获得最大细胞得率。 
<ol>
	<li>将小鼠置于 CO2 安乐死舱中处死，并用 70% 乙醇喷洒腹部和胸部。</li>
	<li>用剪刀在腹部中央做一个小的横向切口，剥离皮肤以暴露腹膜。</li>
	<li>在幽门括约处剪断，分离胃与上段小肠；用镊子轻轻分离肠系膜，并在回盲瓣处再次剪断，使整个小肠与大肠分离；在肛缘处剪断，并再次分离肠系膜，直至大肠完全游离。</li>
	<li>用剪刀纵向剪开结肠，并在室温下用无钙镁 PBS（CMF PBS）冲洗肠腔内的粪便内容物和黏液。</li>
	<li>用剪刀和镊子在肉眼可见的水平下沿小肠对系膜缘分离并取出派伊尔结，然后纵向剪开小肠。</li>
	<li>在室温下用无钙镁 PBS（CMF PBS）冲洗小肠肠腔内的粪便内容物和黏液。</li>
	<li>将小肠和大肠分别切成约 1.5 cm 的片段，并分别放入含有 30 ml 预热的含 2 mM EDTA 的无钙镁 HBSS/FBS（CMF HBSS/FBS）的 50 ml 锥形管中。每根 50 ml 锥形管中不得放入超过一段肠道。</li>
	<li>将每个 50 ml 锥形管水平放置于摇床上，在 37 °C 下以 250 rpm 振荡 20 分钟。</li>
	<li>将单层金属网筛置于废液桶上方，将每个 50 ml 锥形管中的内容物倒入筛中，回收 1.5 cm 的肠段，并将其转移至分别含有 30 ml 预热的含 2 mM EDTA 的 CHBSS/FBS 的 50 ml 锥形管中。</li>
	<li>重复步骤 1.8。</li>
</ol>
2. 组织消化与肠道细胞的分离
试剂与仪器的准备：
<ul>
	<li>胶原酶溶液： 将1.5 mg/ml VIII型胶原酶溶解于预热的含40 μg/ml DNase I的CMF HBSS/FBS中。</li>
	<li>预热的CMF HBSS/FBS和2 mM EDTA。</li>
	<li>预热至37 °C的轨道摇床。</li>
	<li>冰冷的CMF HBSS/FBS。</li>
</ul>
<ol>
	<li>第二次振荡后，将每个50 ml锥形管中的内容物通过滤网过滤，并用纸巾吸去多余培养基，将1.5 cm长的肠段转移至小型塑料称量舟中。</li>
	<li>在称量舟中直接用剪刀迅速剪碎1.5 cm的肠段，并将剪碎的肠组织加入20 ml胶原酶溶液中。将每个50 ml锥形管水平放置于摇床上，于37 °C以200 rpm振荡消化10–20分钟。有关优化细节，请参见下文讨论部分。</li>
	<li>短暂涡旋以确保残留肠组织充分解离，并通过100 μm细胞滤网直接滤入50 ml锥形管中。</li>
	<li>用CMF HBSS/FBS补满每个50 ml锥形管，于4 °C以1500 rpm离心5分钟。若结肠样本离心后未见明显沉淀，应再离心3.5分钟。重复此洗涤步骤一次。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀用预冷的CMF HBSS/FBS重悬，并将样本置于冰上。</li>
	<li>继续进行第3节的流式细胞术采集/分析，或进入第4节进行磁珠富集以实现高速细胞分选。</li>
</ol>
3. 树突状细胞和巨噬细胞多色流式细胞术分析的抗体染色
试剂与仪器的准备：
<ul>
	<li>预冷的 CMF PBS。</li>
	<li>预冷的染色缓冲液（CMF PBS + 5% FBS）。</li>
	<li>使用 LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒，在预冷的 CMF PBS 中按 1:1000 稀释比例配制死细胞染色液。</li>
	<li>将以下荧光标记的单克隆抗体（mAbs）加入预冷的染色缓冲液中，配制抗体染色混合液：CD45-PerCP、CD103-PE、CD11c-APC、MHC-II（I-Ab）-Alexa Fluor 700、CD11b-eFluor 450、F4/80-PE-Cy7。</li>
</ul>
<ol>
	<li>将细胞转移至一个5 ml的聚苯乙烯圆底（FACS）管中。</li>
	<li>用预冷的无钙镁PBS缓冲液洗涤细胞两次。</li>
	<li>在冰上避光孵育死细胞染料15分钟。</li>
	<li>用预冷的无钙镁PBS缓冲液再次洗涤细胞两次。</li>
	<li>用冰上预冷的染色缓冲液中的2.4G2抗FcγRIII/II抗体封闭细胞，冰上孵育10分钟。</li>
	<li>用冰上预冷的染色缓冲液洗涤细胞一次。</li>
	<li>在冰上避光条件下，加入抗体染色混合液，孵育20分钟。</li>
	<li>用冰上预冷的染色缓冲液洗涤细胞两次，将细胞重悬于400 μl冰上预冷的染色缓冲液中，并通过FACS管上的40 μm滤膜帽过滤。</li>
	<li>按照第5节和图1中定义的设门策略，在LSR II流式细胞仪（BD）上获取样本数据。</li>
</ol>
4. 从肠道中富集树突状细胞和巨噬细胞
试剂与仪器的准备：
<ul>
	<li>预冷染色缓冲液（无钙镁 PBS + 5% 胎牛血清）。</li>
</ul>
<ol>
	<li>按照制造商说明书，将步骤 2.5 获得的单细胞悬液与 CD11b 和 CD11c MACS 磁珠共同孵育。</li>
	<li>用预冷的染色缓冲液洗涤细胞，随后进行离心。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 预冷的染色缓冲液中，依次通过 100 μm 和 40 μm 细胞滤网。</li>
	<li>使用 MACS LS 磁性分离柱通过正向选择法富集结合磁珠的细胞。</li>
	<li>重复步骤 4.2，弃去上清液。</li>
	<li>按照步骤 3.7 所述，用表面标志物单克隆抗体孵育细胞。</li>
	<li>用预冷的不含叠氮化钠的染色缓冲液洗涤磁珠富集后的细胞两次。将细胞沉淀重悬于 500 μL 预冷的不含叠氮化钠的染色缓冲液中，并通过 40 μm 细胞滤网收集至流式管中。</li>
	<li>将细胞转移至 BD ARIA II 细胞分选仪进行 FACS 分选，以分离目标肠道树突状细胞和/或巨噬细胞亚群。</li>
</ol>
5. 肠道固有层APC的设门策略
注意：请注意，未染色的肠道细胞可作为阴性对照，以帮助正确设置门控，区分阳性与阴性细胞群。
<ol>
	<li>如图1所示，创建点图并排除死细胞染料阳性的细胞（图1A），随后排除双联体事件（图1B和C）。然后根据前向散射和侧向散射对目标细胞设门，注意排除碎片（图1D）。</li>
	<li>创建另一个点图，进一步对CD45+和I-Ab+细胞设门，这些细胞在表型上表征为抗原呈递细胞（APCs）（图1E）。</li>
	<li>在另一个独立的点图中，分析CD11b和CD11c的表达，以区分特定的树突状细胞（DC）和巨噬细胞亚群（R1、R2和R3；图1F）。R1区域的细胞为CD11c+ CD11bdull/-细胞。R2区域的划定依据是这些细胞在CD11c表面表达水平上与R1细胞相似，但R2细胞同时表达CD11b。随后，R3区域定义为CD11b+且CD11cdull/-的细胞。</li>
	<li>进一步分析R1、R2和R3区域中F4/80和CD103的表达，以分别区分巨噬细胞和DC群体。R1中CD11c+ CD11bdull/-细胞高表达αE整合素CD103，而F4/80表达水平较低（图1G）。R2中CD11b+CD11c+细胞根据其对CD103和F4/80的双相表达特征，包含DC和巨噬细胞两种成分（图1H）。最后，R3中CD11b+CD11cdull/-细胞基于F4/80+和CD103-的表型特征，被认定为巨噬细胞（图1I）16。</li>
</ol>
6. 代表性结果
<img alt="分析细胞群体的流式细胞术散点图，包括CD标志物和死细胞染色。" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 肠道树突状细胞和巨噬细胞的设门策略。 首先在分析中排除死细胞（A）和双联体（B和C），然后根据前向散射和侧向散射对小肠细胞进行设门（D），抗原呈递细胞定义为CD45+I-Ab+（E）。通过CD11b和CD11c的表达鉴定巨噬细胞和树突状细胞（F）。对预设门R1（G）、R2（H）和R3（I）群体的细胞分析其CD103和F4/80的表达情况。
<img alt="CD11c、CD11b 的流式细胞术图谱（A-C）；组织消化时间对总细胞数影响的图表（D-F）" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 细胞得率和抗体染色质量依赖于消化时间。 不同消化程度下肠道组织的 CD11b 和 CD11c 染色模式及总细胞得率：消化不足（A，D）、消化适度（B，E）和消化过度（C，F）。
从小鼠C57BL/6的小肠中分离出肠上皮细胞，使用BD LSR II流式细胞仪对树突状细胞（DCs）和巨噬细胞进行FACS分析。通过未染色及单荧光染色的脾细胞设定电压和补偿参数。首先在分析中排除死细胞（图1A）和双联体细胞（图1B和C）。随后根据前向散射光和侧向散射光对目标细胞进行分析（图1D），接着圈选CD45+和I-Ab+细胞（图1E）。之后，在CD45+I-Ab+细胞中评估CD11b和CD11c的表达，以界定三个区域（R1、R2和R3；图1F）。通过分析这三个区域中CD103和F4/80的表达情况，分别区分树突状细胞与巨噬细胞。R1区域的CD11c+ CD11b微弱/-细胞高表达αE整合素CD103，而F4/80表达水平较低（图1G）。R2区域的CD11b+CD11c+细胞根据其对CD103和F4/80的双相表达特征，包含树突状细胞和巨噬细胞两类（图1H）；而R3区域的CD11b+CD11c微弱/-细胞则基于F4/80+和CD103-的表型特征被认定为巨噬细胞（图1I）16。R2门控内的巨噬细胞与R3门控中的巨噬细胞具有相似的前向和侧向散射特性，可通过CD11c的表达水平加以区分。这些细胞亚群的功能差异目前尚未完全阐明。
组织消化时间对总细胞得率以及CD11b和CD11c表达水平的影响如图2所示。消化3分钟（消化不足）的肠道组织获得的总细胞数量较低（图2D），因此可用于表征的树突状细胞（DCs）和巨噬细胞数量较少（图2A）。消化11分钟时，活细胞得率显著提高（图2E），且DCs和巨噬细胞群体中CD11b和CD11c的表达水平较高，表型特征清晰可辨（图2C）。相比之下，消化50分钟（过度消化）时，细胞得率与优化消化条件相比相似（图2E和F），但随着CD11c表达减弱（图2C）以及死细胞数量增加（数据未显示），利用CD11b和CD11c区分不同细胞群体的界限变得模糊。

<ol><li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li>
<li>Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+antigen+presentation+and+the+control+of+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity.</a> Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).</li>
<li>Abraham, C., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+host+innate+immune+system+and+microbes+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease.</a> Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).</li>
<li>Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regula+tine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regula tine.</a> Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).</li>
<li>Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal dendritic cells.</a> Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).</li>
<li>Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+independent+subset+of+TLR+expressing+CCR2-dependent+macrophages+promotes+colonic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation.</a> J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).</li>
<li>Coombes, J. L., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+intestinal+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in intestinal immune regulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).</li>
<li>Kelsall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+understanding+the+phenotype+and+function+of+intestinal+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages.</a> Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).</li>
<li>Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor%2C+plasticity%2C+and+crosstalk+between+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).</li>
<li>Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamina+propria+macrophages+and+dendritic+cells+differentially+induce+regulatory+and+interleukin+17-producing+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses.</a> Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).</li>
<li>Niess, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1-mediated+dendritic+cell+access+to+the+intestinal+lumen+and+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance.</a> Science. 307, 254-258 (2005).</li>
<li>Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+DCs+interact+with+intestinal+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">How do DCs interact with intestinal antigens.</a> Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).</li>
<li>Bilsborough, J., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+dendritic+cells+play+a+role+in+immunity%2C+tolerance%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease.</a> Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).</li>
<li>Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell%3A+its+role+in+intestinal+inflammation+and+relationship+with+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria.</a> Gut. 52, 1522-1529 (2003).</li>
<li>Medina-Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+regulates+intestinal+macrophage+homeostasis%2C+bacterial+translocation%2C+and+colitogenic+Th17+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice.</a> J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).</li>
<li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Specializations+of+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+That+Control+Th17+and+Regulatory+T+Cell+Responses+Are+Dependent+on+the+T+Cell%2FAPC+Ratio%2C+Source+of+Mouse+Strain%2C+and+Regional+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization.</a> J. Immunol. , 187-733 (2011).</li>
<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nod2+sensor+promotes+intestinal+pathogen+eradication+via+the+chemokine+CCL2-dependent+recruitment+of+inflammatory+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes.</a> Immunity. 34, 769-780 (2011).</li>
<li>Schulz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+CD103%2B%2C+but+not+CX3CR1%2B%2C+antigen+sampling+cells+migrate+in+lymph+and+serve+classical+dendritic+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions.</a> J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).</li>
<li>Jaensson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestinal+CD103%2B+dendritic+cells+display+unique+functional+properties+that+are+conserved+between+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans.</a> J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).</li>
<li>Uematsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+humoral+and+cellular+gut+immunity+by+lamina+propria+dendritic+cells+expressing+Toll-like+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5.</a> Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).</li>
<li>Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1--expressing+intestinal+macrophages+crucially+amplify+chronic+inflammation+in+experimental+colitis+and+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases.</a> J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).</li>
<li>Sun, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).</li>
<li>Kamada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormally+differentiated+subsets+of+intestinal+macrophage+play+a+key+role+in+Th1-dominant+chronic+colitis+through+excess+production+of+IL-12+and+IL-23+in+response+to+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria.</a> J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).</li>
<li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+Th+cells+resembling+regulatory+T+cells+that+inhibit+chronic+colitis+differentiate+in+the+absence+of+interactions+between+CD4+and+class+II+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC.</a> J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

<img src="/files/ftp_upload/4040/4040fig3.jpg" alt="细胞得率优化示意图：影响因素包括胶原酶、组织消化、完整性、大小。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 影响细胞得率和表面抗原表达优化的关键因素。 细胞得率和表面抗原表达直接受组织消化时间、胶原酶的特异性特征、组织剪切程度以及是否存在炎症的影响，后者可能影响组织完整性和细胞含量。组织消化时间过长可能导致细胞活力和表面抗原表达下降，而消化不足则可能导致可用于分析的细胞数量不足。
本文详细描述了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法，可用于多色流式细胞术进行表型鉴定，也可通过磁珠分选（MACS）和细胞分选技术富集细胞，从而对纯化后的细胞开展功能研究。优化胶原酶浓度及组织消化时间对于在不损害细胞活力和表面抗原表达的前提下获得较高的细胞得率至关重要。消化不足会导致总细胞数偏低，可用于鉴定的树突状细胞和巨噬细胞数量稀少（图2A和D</stro...

<table><tbody><tr><td>1× PBS，不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含酚红的 Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>费舍尔科技公司</td><td>SH3001603</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>0.85% NaCl 中的 1 M HEPES</td><td>龙沙公司</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>亚特兰大生物公司</td><td>S11150H</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>VIII 型胶原酶</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>罗氏集团</td><td>14785000</td><td>储存液：100 mg/mL</td></tr><tr><td>适用于 405 nm 激发的 LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒</td><td>英坦科技</td><td>L34957</td><td>使用比例：1:1000</td></tr><tr><td>CD45-PerCP 单克隆抗体 (30F11)</td><td>BD 生物科学公司</td><td>557235</td><td>使用比例：1:100</td></tr><tr><td>CD103-PE 单克隆抗体 (M290)</td><td>BD 生物科学公司</td><td>557495</td><td>使用比例：1:100</td></tr><tr><td>Fc&amp;#947;RIII/II 单克隆抗体 (2.4G2)</td><td>BD 生物科学公司</td><td>553141</td><td>使用比例：1:200</td></tr><tr><td>CD11c-APC 单克隆抗体 (N418)</td><td>eBioscience 公司</td><td>17-0114-82</td><td>使用比例：1:100</td></tr><tr><td>MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 单克隆抗体</td><td>eBioscience 公司</td><td>56-5321-82</td><td>使用比例：1:100</td></tr><tr><td>CD11b-eFluor 450 单克隆抗体 (M1/70)</td><td>eBioscience 公司</td><td>48-0112-82</td><td>使用比例：1:200</td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7 单克隆抗体 (BM8)</td><td>eBioscience 公司</td><td>25-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b 磁珠</td><td>美天旎生物技术公司</td><td>130-049-601</td><td></td></tr><tr><td>CD11c 磁珠</td><td>美天旎生物技术公司</td><td>130-052-001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>BD 生物科学公司</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>单层金属网筛</td><td>Chefmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型称量舟</td><td>费舍尔科技公司</td><td>08-732-116</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 细胞滤网</td><td>BD 生物科学公司</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞滤网</td><td>BD 生物科学公司</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底试管</td><td>BD 生物科学公司</td><td>352235</td><td>使用比例：1:100</td></tr><tr><td>MaxQ 4450 台式轨道摇床</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS MACS 柱</td><td>美天旎生物技术公司</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD 生物科学公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD 生物科学公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠肠道中分离与鉴定树突状细胞和巨噬细胞

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

肠道内存在独特的天然免疫细胞和适应性免疫细胞群体，它们在促进对共生菌群和食物抗原耐受的同时，又能随时对侵入性病原体启动炎症反应1,2。抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，在维持肠道免疫稳态中发挥关键作用，其机制在于能够感知微生物群并作出适当的响应3-14。高效分离肠道DCs和巨噬细胞是表征这些细胞表型与功能的关键步骤。尽管已有多种有效的肠道免疫细胞（包括DCs和巨噬细胞）分离方法被报道6,10,15-24，但许多方法依赖较长的消化时间，可能对细胞表面抗原表达、细胞活力和/或得率产生不利影响。本文详细介绍了一种快速分离大量活的肠道DCs和巨噬细胞的方法。通过使用特异性荧光标记的单克隆抗体直接染色分离得到的肠道细胞，进而进行多色流式细胞术分析，以完成对肠道DCs和巨噬细胞的表型鉴定。此外，利用CD11c和CD11b磁珠激活细胞分选技术结合后续的细胞分选，可获得高纯度的DC和巨噬细胞群体，用于功能研究。

本文详细介绍了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法。通过多色流式细胞术对肠道树突状细胞和巨噬细胞进行表型鉴定，同时采用磁珠富集联合细胞分选技术，获得高纯度的细胞群体用于功能研究。

在肠道内存在着独特的天然免疫和适应性免疫细胞群体，这些细胞参与促进对共生菌群的耐受……

本实验的总体目标是快速分离小鼠肠道树突状细胞（dcs）和巨噬细胞，用于表型和功能特征分析。首先获取肠道组织，然后通过第二步将肠上皮与固有层分离。接下来，在实验的最后步骤中消化肠道固有层。使用荧光标记的偶联抗体对固有层细胞进行染色，并圈定特定的细胞群体。最终，可更准确地鉴定和纯化肠道树突状细胞（DC）和巨噬细胞群体，用于功能研究，以评估细胞因子产生、抗原提呈以及免疫细胞的调控作用。因此，与现有方法相比，该技术的主要优势在于组织消化速度快，可确保细胞表面抗原表达最佳，同时保持细胞活性及完整性。在处死小鼠并通过脚趾夹捏反射确认死亡后，用70%乙醇喷雾测试小鼠腹部和胸部。然后使用剪刀在腹部中央做一个小的横向切口，并将皮肤向后剥离以暴露腹膜。使用剪刀在幽门括约肌处切开，分离胃与上段小肠，并用镊子剥离肠系膜，从而打开腹膜。在回盲瓣处再次剪开，使整个小肠与大肠分离。继续分离大肠上的肠系膜，并在肛缘处做一切口。使用剪刀纵向剪开结肠，并用室温的 C-M-F-P-B-S 冲洗肠腔内的粪便内容物和黏液。然后使用剪刀和镊子在肉眼观察下沿小肠对系膜缘分离出派尔集合淋巴结，并将小肠纵向剪开。接下来，用更多室温的 C-M-F-P-B-S 冲洗小肠腔，清除粪便内容物和黏液。 separately，将小肠和大肠剪成约 1.5 厘米长的片段，并放入各自含有 30 毫升预热的添加了 FBS 和 2 毫摩尔 EDTA 的 C-M-F-H-B-S-S 的 50 毫升锥形管中。将每个 50 毫升锥形管水平放置于摇床上，在 37 摄氏度下以 250 转/分钟的速度振荡 20 分钟。接下来，将单层金属网筛置于废液桶上方。将每个50毫升锥形管中的内容物倒入网筛中，以回收肠段组织，随后将其转移至新的单独含有30毫升添加胎牛血清（FBS）和2毫摩尔EDTA的预温C-M-F-H-B-S-S溶液的50毫升锥形管中。最后，将这些锥形管重新放回轨道摇床中，继续孵育20分钟。第二次振荡后，将每根试管中的内容物通过滤网倒入。再次用纸巾吸去多余的培养基，然后将肠段转移至小型塑料滤网舟中。该技术中最关键的步骤是组织消化，为确保成功，必须快速使用剪刀，并综合考虑消化时间、胶原酶的特性、组织完整性以及待消化组织的大小等各种不同参数。将肠段切碎，然后将剪碎的肠组织加入含有20毫升胶原酶溶液的50毫升锥形管中。将锥形管水平放置于摇床中，在37摄氏度下以200转/分钟振荡消化10至20分钟。随后短暂涡旋振荡管子，以确保残留的肠组织充分解离，接着将细胞悬液通过100微米细胞滤网直接过滤至另一个50毫升锥形管中。最后，用含FBS的C-M-F-H-B-S-S补满锥形管，将细胞悬液在4°C条件下以425 × g离心5分钟，重复两次。随后弃去上清液，用预冷的含FBS的C-M-F-H-B-S-S重悬细胞沉淀，并将样品置于冰上。接着对细胞进行目标表面

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

从老鼠肠道树突状细胞和巨噬细胞的分离和表征

使用 Miltenyi MACs 试剂盒分离淋巴细胞是从全淋巴组织匀浆中纯化细胞的一种可靠方法。利用 Miltenyi 系统纯化的细胞纯度通常 ≥ 96%。本文中，我们演示了分离 CD4+ T 细胞的步骤，这是 Miltenyi...

使用 Miltenyi MACS 分离法从小鼠淋巴结中分离 CD4+ T 细胞

本文介绍了一种高度纯化的小鼠肺树突状细胞的制备方法。重点在于分离传统的树突状细胞亚群。...

小鼠肺树突状细胞的分离

人们对了解派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）中特定细胞亚群的免疫学功能日益关注，PPs 是肠道相关淋巴组织的主要诱导部位。本文概述了制备 PP 单细胞悬液用于流式细胞术分析以及制备 PP...

从小鼠派伊尔集合淋巴结中分离并免疫染色淋巴细胞与树突状细胞

本方案详细介绍了通过一系列酶消化步骤从人胸腺中分离抗原提呈细胞的方法，随后对单细胞悬液进行密度梯度离心，最后通过磁珠分选和/或荧光激活细胞分选（FACS）分离目标细胞群体。...

从人胸腺中分离髓系树突状细胞和上皮细胞

不同的树突状细胞亚群作为稀有群体存在于淋巴器官中，因此难以分离出足够数量和高纯度的细胞用于免疫学实验。本文介绍一种高效、高产量的方法，用于分离目前所知的所有小鼠脾脏树突状细胞主要亚群。...

一种高效且高得率的小鼠树突状细胞亚群分离方法

由于人们日益认识到肠道淋巴细胞在多种肠道及全身性疾病中发挥着关键作用，对这些细胞进行定量表征的研究兴趣不断增长。在本方案中，我们描述了如何从小肠不同区室中分离单细胞群体，以用于后续的流式细胞术分析。...

小鼠小肠淋巴细胞的分离与流式细胞术表征

本文介绍了一种从女性生殖道不同解剖区域分离和纯化树突状细胞的方法，用于评估其表型和功能特征。该方法可经适当调整，用于从其他黏膜组织中分离其他免疫细胞或树突状细胞。...

从人类女性生殖道中分离树突状细胞用于表型与功能研究

单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）能够感知微量的危险相关分子，因此极易被启动。本文提供了从血液和肿瘤中分离MoDC并利用免疫复合物对其进行激活的详细方案，同时强调了应考虑的关键注意事项，以避免其过早激活。...

小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活

本文详细描述了一种从小肠免疫系统的诱导部位（包括肠道相关淋巴组织派伊尔集合淋巴结和引流肠系膜淋巴结）以及效应部位（包括小肠固有层和肠上皮）分离淋巴细胞的实验方案。...

从小鼠小肠免疫系统中分离淋巴细胞

本实验方案的目的是通过胶原酶对组织进行酶消化，分离结肠固有层中定居的单个核细胞。该方案可高效地分离单个核细胞，获得单细胞悬液，进而可用于可靠的免疫表型分析。...

使用胶原酶E从小鼠结肠中分离固有层单个核细胞

本研究对分离灌注的小鼠脑脉络丛采用流式细胞术及两种不同的设门策略；该方案可鉴定出定位于此脑结构中的主要免疫细胞亚群。...

显微解剖小鼠脉络丛中免疫细胞的分离与鉴定

学习从小鼠肠道组织中快速分离树突状细胞和巨噬细胞的方法，通过酶解消化和流式细胞术进行表型分析与功能表征，适用于免疫学研究中细胞因子产生及抗原呈递机制的深入探索。

从小鼠肠道中分离与鉴定树突状细胞和巨噬细胞

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