从老鼠肠道树突状细胞和巨噬细胞的分离和表征
2012年5月21日
在这里，我们详细介绍了小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的快速分离方法。使用多色流式细胞仪分析细胞分选磁珠富集而被用来产生高纯度的功能研究人口肠道DC和巨噬细胞的表型特征。
该程序的总体目标是快速分离小鼠肠道树突状细胞或 dc 和巨噬细胞，以进行表型和功能表征。这是通过首先收获肠道组织来实现的。第二步是将肠上皮与 Lamin propria 分离。
接下来，肠道 Lamin Propria 在手术的最后步骤中被消化。Lamin propria 细胞用荧光、偶联抗体染色，并针对特定细胞群进行门控。最终，可以更准确地表征和纯化肠道 DC 和巨噬细胞群，用于功能研究，以评估细胞因子产生、抗原呈递和免疫细胞的调节。
因此，与现有方法相比，该技术的主要优点是组织消化的快速性确保了最佳的细胞表面抗原表达、细胞活力和/或细胞。对小鼠实施安乐死并通过脚趾捏反射确认死亡后，试将 70% 乙醇喷洒在动物的腹部和胸部。然后用剪刀在腹部中间做一个小的水平切口，剥开皮肤，露出腹膜。
在菌毛括约肌处剪开后，用剪刀打开腹膜，将胃与上小肠分开，并用镊子梳理出肠系膜。再次切开回盲瓣，将整个小肠从大肠中释放出来。继续将肠系膜与大肠分开，并在肛门边缘切开。
用剪刀将结肠纵向切开，并使用室温 C-M-F-P-B-S 将粪便内容物和粘液从肠腔中洗出。然后用剪刀和镊子进行肉眼观察。沿着小肠的抗肠系膜表面解剖出 pyres 斑块，并纵向切开小肠。
接下来，用更多的室温 C-M-F-P-B-S 清除小肠腔中的粪便内容物和粘液。分别将小肠和大肠切成约 1.5 厘米的小块，然后将这些小肠放入单独的 50 毫升锥形管中，其中装有 30 毫升战前 C-M-F-H-B-S-S 与 FBS 和两毫摩尔 EDTA。将每支 50 mL 锥形管水平放入轨道摇床中，在 37 摄氏度下以 250 RPM 摇动试管 20 分钟。
接下来，将单个网状金属丝过滤器放在垃圾桶上。将每 50 毫升锥形管的内容物倒入网孔中以回收肠块，然后将它们放入新的单独的 50 毫升锥形管中，该锥形管含有 30 毫升预热 C-M-F-H-B-S-S，含 FBS 和两毫摩尔 EDTA。最后，将试管放回轨道摇床中再放置 20 分钟。
第二轮摇动后，将每根试管的内容物倒入过滤器中。同样，用纸巾轻拍掉多余的培养基，然后将肠块转移到一个小塑料乳清船上。这项技术最困难的一个方面是组织消化以确保成功，消化持续时间、胶原酶的特性、组织完整性和待消化组织的大小等所有不同参数都必须考虑使用剪刀快速。
将肠块切碎，然后将切碎的肠子加入装有 20 毫升胶原酶溶液的 50 毫米锥形管中。将锥形管水平放入轨道摇床中，在 37 摄氏度下以 200 RPM 的速度消化肠片 10 至 20 分钟。现在短暂涡旋试管以确保任何残留的肠道组织彻底解离，然后通过 100 微米细胞过滤器将细胞浆液直接过滤到 50 毫升锥形管中。
最后，用含 FBS 的 C-M-F-H-B-S-S 加满锥形管，并在 4 摄氏度下以 425 倍 G 离心细胞溶液 2 次，持续 5 分钟。然后倒出上清液，将细胞沉淀重悬于含 FBS 的冰冷 C-M-F-H-B-S-S 中，并将样品置于冰上。对细胞进行染色后，寻找感兴趣的表面蛋白。
首先创建一个点图，排除死细胞染色呈阳性的细胞，如此处所示。接下来，排除 doublet 事件，如 here 和 here。现在使用前向和侧向散射通道对感兴趣的细胞进行门控，确保排除碎片。
然后在 CD 45 阳性和 IAB 阳性抗原上创建另一个点图门控。在单独的点图中呈现细胞可创建区域以区分特定的 DC 和巨噬细胞亚群。此处显示的 R 1 区域捕获 CD 11 C 阳性 CD 11 B 暗淡阴性细胞。
R 2 区描绘了与 R 1 区细胞具有相似 CD 11 C 表面表达水平的细胞，但也表达 CD 11 B 的细胞。可以进一步分析 F four 80 和 CD 1 0 3 的表达，以分别区分巨噬细胞和 DC 群体。从这个点图中可以看出，R 1 区的 CD 11 C 阳性 CD 11 B 暗淡阴性细胞将表达高水平的 α ein CD 1 0 3 和低水平的 F 4 80。
该点图显示，根据 CD 1 0 3 和 F 四 80 的二分表达，R 2 区的 CD 11 B 阳性 CD 11 C 阳性细胞将由 DCS 和巨噬细胞组成。最后，根据它们的 F 4 80 阳性和 CD 1 0 3 阴性表型谱 R 3，门控 CD 11 B 阳性 CD 11 C del 阴性细胞将由巨噬细胞组成，组织消化持续时间对总细胞产量与 CD 11 B 和 CD 11 C 表达之间的关系如下六张图所示。消化 3 分钟的肠道组织产生较低的总细胞数，导致可用于表征的 DC 和巨噬细胞很少 11 分钟组织消化产生高产量的活细胞，产生表达高水平 CD 11 B 和 CD 11 C 的 DC 和巨噬细胞群，这些细胞在表型上是不同的。
相比之下，与优化消化相比，50 分钟的消化产生的细胞产量相似。然而，使用 CD 11 B 和 CD 11 C 描绘不同的细胞群变得更加困难。随着 CD 11 C 的表达减少和死细胞数量的增加。
因此，在优化肠道组织消化的参数后，可以快速获得稳健的细胞产量。因此，小鼠肠道 DC 和巨噬细胞的快速分离可用于评估具有完整表面抗原的免疫细胞的功能特性。
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概述
本文详细介绍了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法。该步骤包括获取肠道组织、分离肠上皮以及消化固有层，以实现对这些免疫细胞的准确表征与纯化。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 神经科学
背景
- 肠道树突状细胞和巨噬细胞在免疫应答中发挥关键作用。
- 准确的分离对于功能研究至关重要。
- 多色流式细胞术用于表型鉴定。
- 磁珠富集可提高细胞纯度。
研究目的
- 快速分离小鼠肠道树突状细胞和巨噬细胞。
- 对这些细胞进行表型和功能特征分析。
- 评估细胞因子产生及抗原呈递能力。
使用方法
- 从小鼠中采集肠道组织。
- 将肠上皮与固有层分离。
- 消化固有层以获得细胞群体。
- 使用荧光标记抗体对细胞进行染色，用于流式细胞术。
主要结果
- 成功分离出高纯度的肠道树突状细胞和巨噬细胞群体。
- 利用流式细胞术进行准确的表型鉴定。
- 增强对这些免疫细胞功能特性的研究能力。
- 深入了解细胞因子产生及免疫调节机制。
结论
- 该方法可实现免疫细胞的快速高效分离。
- 有助于对肠道免疫应答进行详细的功能研究。
- 有助于阐明树突状细胞和巨噬细胞在肠道免疫中的作用。
常见问题
行业重要性概述
快速分离具有活性的肠道树突状细胞和巨噬细胞，可实现对肠道免疫细胞群体的准确表型和功能特征分析。该方法通过保持细胞表面抗原表达和细胞活性，支持以免疫学为重点的发现项目中的靶点验证和作用机制去风险化。该技术为在疾病相关背景下评估免疫调节化合物提供了一个可重复的实验体系。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可用于研究树突状细胞和巨噬细胞亚群在肠道耐受性及炎症通路中的作用。
- 操作价值：可获得高纯度的细胞群体，用于功能检测，评估细胞因子产生和抗原提呈能力。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成树突状细胞和巨噬细胞活化状态的定量流式细胞术检测结果。
- 操作价值：通过磁珠富集和多色染色方案支持检测方法的标准化。
转化与临床前研究
- 科学价值：利用生理相关性免疫细胞促进靶向肠道免疫调节剂的临床前评价。
- 操作价值：通过标准化的分离与表征实现从发现到临床前工作流程的连续性。
流程与工作流整合
该方法通过提供可靠的肠道免疫细胞来源，用于假设验证和通路解析，从而整合到发现生物学的工作流程中。
- Discovery Biology: 支持对参与黏膜免疫和免疫调节的靶点进行功能验证。
- Screening: 提供可重复、高产量的细胞制备方法，用于化合物筛选和表型分析。
- Analytics: 通过流式细胞术实现对细胞表面标志物和功能输出的定量检测。
- Translational Research: 通过一致的免疫细胞制备，连接早期发现与临床前研究。
- Enterprise Reuse: 建立可重复使用的平台，支持跨治疗领域的肠道免疫学项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过维持细胞表面抗原的天然表达和细胞活性，提高预测的可信度。
- 操作价值：通过快速、标准化的组织消化与分离步骤，降低实验变异性。
- 战略价值：在相关组织环境中实现对免疫调节效应的早期评估，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：支持针对肠道免疫通路的候选分子进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备组织解剖、酶消化和流式细胞术方面的专业知识。
- 依赖于轨道摇床、细胞滤网和磁性分离设备的可及性。
- 在不同实验室之间需对消化时间和胶原酶活性进行标准化。
- 应用于不同小鼠品系或肠道区域时，需考虑适应性调整。
- 受限于需要新鲜组织并立即处理以维持细胞完整性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Dissection and Dissociation of Intestinal Epithelial Cells
3:56
Tissue Digestion and Isolation of Intestinal Cells
5:47
Gating Strategy for Laimna Propria Antigen-presenting Cells
7:55
Results: Cell Yield and Antibody Staining Quality Depends on Digestion Time
8:58
Conclusion
