揭示复杂脑部拓扑结构的全脑免疫组织化学染色法

本实验方案的总体目标是揭示完整脑结构中复杂的基因表达模式。首先灌注动物并取出脑组织，随后分离小脑，并采用整体染色方案进行处理，以实现上述目标。

最后一步是通过组织化学显色反应来可视化基因表达。最终采用明场显微镜成像以观察表面基因表达模式。该技术相较于现有方法（如组织切片免疫组织化学）的主要优势在于，无需重建即可在三维空间中可视化复杂的表达模式。

演示该操作的是我实验室的研究生 Joshua White。在处死动物并从颅骨中取出脑组织后，首先将一对镊子的尖端插入上下蚓部中间，将小脑与脑的其余部分分离。然后使用第二对镊子，缓慢地将蚓部和大脑皮层从小脑上剥离。

将小脑调整至前侧朝下、脑干朝上的方向。将镊子插入小脑脑干与小脑第9和10小叶之间的第四脑室区域，用镊子在两侧夹断小脑脚，然后轻轻将小脑从小脑脑干上分离提起。

将小脑浸入4%多聚甲醛中，在4摄氏度下固定，时间不少于24小时，最长可达48小时。小脑可在4%多聚甲醛中长期保存。操作时需在通风橱内进行。轻轻倒出多聚甲醛溶液，并替换为浓固定液。

将含有小脑和固定液的试管置于摇床上，轻轻摇动6至8小时。孵育时间结束后，倒出浓固定液，替换为浓漂白剂。将小脑在该溶液中于4摄氏度下孵育过夜，次日继续轻轻摇动。

将管中的溶液更换为100%甲醇。将管子置于摇床上，室温下轻轻摇动30分钟。孵育时间结束后，将溶液更换为新鲜的100%甲醇，并重复孵育步骤，以确保小脑完全脱水。

现在，将试管放入装有干冰的容器中，在100%甲醇中冷冻组织30分钟。此后，用镊子将试管从干冰中取出，置于实验台面上解冻15分钟。重复冻融过程至少四次，以增强染色液的渗透性。

最后一次冻融后，将离心管放入-80摄氏度冰箱中过夜。组织样本可在-80摄氏度条件下长期保存，保存时间点可选择在冻融步骤之前或之后立即进行。否则，应继续进行后续实验步骤。

第二天，将小脑置于50%甲醇与50% PBS混合液中，室温下振荡孵育60至90分钟进行复水，随后依次转移至85% PBS与15%甲醇、以及100% PBS溶液中，各孵育60至90分钟。接着，对于成年小鼠小脑组织，在室温下以含10微克/毫升蛋白酶K的PBS溶液振荡消化2至3分钟。

对于五日龄或更小的小鼠小脑，此消化步骤并非必需。消化完成后，立即倒掉蛋白酶K溶液，并用PBS洗涤小脑，每次10分钟，共洗涤3次，以防止过度消化。最后一次洗涤后，将溶液更换为P-B-S-M-T和ROCK抑制剂，在4°C下过夜孵育，以阻断组织活性，供次日使用。

倒掉 P-B-S-M-T 封闭液，将组织置于用 P-B-S-M-T 稀释的一抗溶液中，添加 5% DMSO，在 4°C 条件下振荡孵育 48 小时。孵育结束后，在 4°C 条件下用 P-B-S-M-T 振荡洗涤小脑组织 2 至 3 次，每次 2 至 3 小时，以去除未结合的一抗。

随后在含有5% DMSO的P-B-S-M-T溶液中加入二抗，4°C条件下孵育组织过夜。次日，在4°C条件下用P-B-S-M-T溶液振荡洗涤小脑，方法同前。然后在PBT溶液中振荡洗涤1至2小时，4°C条件下完成最终洗涤步骤。

此步骤可去除多余的牛奶并增强染色的清晰度。最后，将组织在DAB溶液中孵育，直至达到最佳染色强度，最好在避光条件下使用DAB。

由于光照会导致发色原沉淀，从而增加背景染色。当达到最佳染色强度时，棕色反应产物应在10分钟内清晰可见。将小脑置于含0.4%叠氮化钠的PBS中以终止反应。

组织可在该溶液中长期保存。全 mount 染色组织应在浸入 PBS 或其他可提供最佳折射率的介质中时进行成像。为便于在成像时准确定位全 mount 样品，可在塑料培养皿中制备 1% 琼脂凝胶。

接着，在凝胶中切出小孔，然后将小脑组织以期望的成像方向楔入这些孔中，并用 PBS 覆盖小脑组织。染色后的组织现已准备好用于光学显微镜成像。ZEIN two Adelaide c.

免疫组织化学显示小脑横切面中的矢状带。图中标记了第四、第五和第三唇部结构。为便于定位，比例尺代表500微米。

ZEIN 2。Adelaide 的 C 仅在 kinji 细胞 sata 及其树突的亚群中表达。在此图像中，比例尺代表 150 微米。

该图像显示了经zein two和Adela C染色的全脑切片小脑，图中可见小脑前区、中央区和后区的比基尼细胞条带。罗马数字表示小脑叶。LS为小叶简单部。

PML 代表旁正中唇部。COP 表示联合部参数及标签。crust one 和 crust two 表示两个半球 LOE 的名称，P one 和 P three 的命名基于用于指示特定 BR two 条带的标准命名法。

更多细节请参见 Sillitoe 和 Hawks 2002 年的研究。比例尺代表 1 毫米。此处小脑经可卡因和安非他明调节转录肽抗体免疫染色。

可以观察到，该载体在攀爬纤维的亚群中表达，这些纤维穿过标记为PCL的蒲肯野细胞层，并终止于标记为ml的分子层。此处，比例尺代表100微米。

从该图像中可以看出，Cart阳性纤维在小脑皮层的分子层中投射出条纹状的比基尼细胞树突，包括标记为PFL的Oculus区域以及标记为fl的Oculus区域。在进行此操作时，重要的是要注意避免划伤小脑，任何外部损伤都会影响复杂染色模式的观察。

观看本视频后，您应能充分理解如何在完整大脑的神经元及其相接触的纤维中揭示复杂而有趣的基因表达模式。