单卵母细胞的亚硫酸氢钠诱变

该程序的总体目标是分析单个卵母细胞中的 DNA 甲基化。这是通过首先从收集的卵母细胞中去除卵丘细胞和肥皂 palita 来实现的。第二步是将卵母细胞包埋在 2：1 的 aros 裂解溶液中，以保护微量的 DNA 不丢失或降解。

接下来进行亚硫酸氢盐诱变，然后通过巢式聚合酶链反应进行扩增。最后一步是连接和克隆 PCR 产物。然后挑选克隆，进行 PCR 扩增并送去测序。

最终，亚硫酸氢盐诱变和测序用于显示磷酸胞嘧啶 guine 或单个卵母细胞中感兴趣区域的 CPG 二核苷酸的 DNA 甲基化。与现有方法（如大量细胞的亚硫酸氢盐诱变）相比，该技术的主要优点是可以从单个卵母细胞获得数据，而不会混合细胞 PCR 偏差和化疗细胞污染。在卵母细胞采集当天，在制备溶液时新鲜制备书面方案中列出的溶液，通过经常更换手套来减少 DNA 污染的机会，并使用过滤头在打开时保持试管倾斜，并在不使用时重新盖上所有试管。

通过将解剖的小鼠卵子放入 M 两种培养基中并撕裂 M 滑轮以提取卵丘细胞复合物来开始 OSI 收集。然后在 30 微升 M 2 培养基中，使用 0.3 毫克/毫升透明质酸酶溶液将细胞与卵丘细胞复合物分离。仅在去除卵丘细胞所需的时间内将细胞保存在溶液中，因为长时间暴露可能会损坏它们。

通过将卵母细胞从一滴转移到另一滴，在 30 微升 M 2 培养基中洗涤卵母细胞。定期去除卵丘细胞，总共洗涤 3 次。使用酸性 tyro 溶液去除 LUCITA 的 Z。

首先将卵母细胞放入一滴 30 微升的溶液中，然后转移到另一滴 30 微升的溶液中。因为随身携带的任何介质都会稀释酸并降低其效率。仅在去除带所需的时间内将细胞保存在溶液中，因为长时间暴露可能会损坏它们。

去除带后，在 30 微升 M 2 培养基中再次洗涤细胞以进行 agros 包埋，首先将裂解溶液放在 70 摄氏度的热块上。将预热的低熔点或 LMP Agros 添加到裂解液中，产生 AGROS 与裂解液的二比一。然后将单个卵母细胞放在干净的载玻片上，溶于最少的 M 两种培养基中。

下一步是将单个细胞包埋到 Agros 和裂解溶液中。这必须迅速完成，因为 agros 会在低于 65 摄氏度的温度下变硬。在显微镜下将 10 微升 Agros 裂解液加入移液器吸头中。

轻轻将大约 1 微升或更少的 agros 裂解液喷到载玻片上，使其与最少的培养基混合。轻轻地将卵母细胞吸入移液器吸头中。然后将所有 10 微升物质放入装有 300 微升矿物油的 einor 管中，使所得珠子呈球形。

将试管在冰上孵育 10 分钟以进行裂解。去除 300 微升矿物油，加入 500 微升 SDS 裂解缓冲液。第二天将样品在设置为 50 摄氏度的水浴中孵育过夜。

按照书面方案中的说明准备新鲜的硫化氢诱变溶液。通过完全去除 500 μL SDS 裂解缓冲液开始诱变。请记住，任何剩余的裂解缓冲液在加热时都会稀释 agros，并且珠子在后续步骤中更容易溶解。

完全去除裂解缓冲液后，加入 300 μL 矿物油。将样品在 90 摄氏度的加热块上孵育 2 分半钟。取克拉混合或搅拌、延长或波动温度。

两分半钟后。将样品在冰上孵育 10 分钟。要进行变性，请去除矿物油，在试管中加入 1 毫升 0.1 摩尔氢氧化钠，然后将试管倒置 5 到 6 次。

将样品孵育 15 分钟。在设置为 37 摄氏度的水浴中，每 3 到 4 分钟倒置一次，珠子应漂浮在氢氧化钠中。请注意，拉延筋不再位于管的底部。

要进行亚硫酸盐处理，首先在去除氢氧化钠后轻轻旋转管子。加入 300 微升矿物油和 500 微升 BIS 亚硫酸盐溶液。注意避免暴露在光线下，并将试管在 50 摄氏度的水浴中孵育三个半小时。

现在执行 desination。首先将样品在冰上孵育 3 分钟，然后去除矿物油和 BIS 亚硫酸盐溶液。轻轻旋转后，加入 1 毫升 0.3 摩尔氢氧化钠，将试管倒置 5 到 6 次。

将样品孵育 15 分钟。在 37 摄氏度的水浴中，每 3 到 4 分钟倒置一次，同样，在开始 PCR 之前，微珠应漂浮在氢氧化钠中。首先轻轻旋转洗涤样品。

然后除去氢氧化钠，加入 1 毫升 1 xte pH 7.5。在室温下摇晃 5 到 10 分钟。第二次轻轻旋转后，取出一个 XTE。

重复此洗涤过程两次。然后加入 1 毫升高压灭菌器，双蒸水。在室温下摇晃 5 到 10 分钟，轻轻旋转第三次，然后除去水分。

重复双蒸水洗涤两次。最后，去除所有上清液，只留下 aros 珠子。检查上清液的 pH 值为 5.0。

如果上清液仍然太碱性，请再次用双蒸水洗涤珠子。同时，按照书面方案中的说明将第一轮 PCR 混合物添加到 PCR 管中。将固体 agro speed 滑到气瓶管的边缘。

然后小心地将农速转移到 PCR 管中，加热至 70 摄氏度 1 分钟并混合，然后在书面方案中建议扩增。第一轮扩增后，使用 5 μL 第一轮产物作为模板制备第二轮 PCR 反应。确保在矿物油层下方进行 bipa。

按照文本中的指示继续进行第二轮扩增作为诊断测试。第二轮样品可以用甲基化的限制性内切酶切割，或在 8% 丙烯酰胺凝胶上对消化产物进行菌株特异性电泳。产生的任何异质条带代表多个序列，以克隆第二轮产物连接到载体中，并按照本视频随附的手稿进行 TA 克隆，在 TA 克隆板之后，所有反应混合物到琼脂和 LB 板上，补充氨苄青霉素、ex gal 和 IPTG，并在 37 摄氏度下孵育板过夜。

然后按照书面方案中列出的方式将菌落 PCR 预混液添加到 PCR 管中。用移液管吸头从板中挑选一个白色细菌菌落，并将其旋转到 PCR 管中的 35 微升菌落 PCR 预混液中。在 1.5%AGROS 凝胶上对 4 μL PCR 产物进行 PCR 扩增电泳后，按照文中的说明继续扩增悬浮液。

最后，发送大约 30 μL 的 PCR 产物，对每个细胞的 5 个菌落 PCR 进行测序。一旦获得测序结果，就可以读取甲基化模式，任何保持原样的原始胞嘧啶鸟嘌呤都被甲基化了。相反，任何现在是硫胺素鸟嘌呤的原始胞嘧啶鸟嘌呤在使用亚硫酸氢盐转化引物进行巢式 PCR 扩增后被解甲基化。

可以通过在 aros 凝胶单个中期上可视化正确的片段大小来确认转化成功。两个卵母细胞代表一个亲本等位基因，理论上具有一个印记甲基化模式，因此。第二轮 PCR 产物可以检测是否有意外污染。

对 DNA 甲基化敏感的限制性内切酶可用于消化第二轮 PCR 产物，以评估其是否包含甲基化或未甲基化等位基因。在这里，酶识别序列中的甲基化胞嘧啶被切割。当转化为胸腺嘧啶的未甲基化胞嘧啶不再被酶识别并且未切割时，任何包含甲基化和未甲基化等位基因的中期二卵母细胞样品应丢弃，因为它表明卵丘细胞污染或极性体包涵体连接和转化后。

可以在 AROS 凝胶上观察成功的菌落 PCR 扩增，以确保将具有正确产品大小的样品送去测序。在本例中，连接后的预期扩增子大小为 100 个 56 个碱基对。在这里，克隆 5 的扩增子大小不正确，不应送去测序。

来自中期 2 卵母细胞的 5 个独立克隆的序列应产生 5 个相同的甲基化模式和相同的非 CPG 转化率。任何包含多个模式的样本都应丢弃。由于排卵的中期两个细胞具有两个染色体拷贝或一个附着的极体，因此有可能获得两个相似的序列模式。

应丢弃任何具有高度不同甲基化模式的细胞的数据。由于不能排除卵丘细胞污染 尝试此程序时，重要的是要记住首先在新鲜培养基中多次洗涤卵母细胞，然后在 HI IDE 处理后去除尽可能多的卵丘细胞。其次，低熔点 agros 会在低于 65 摄氏度的温度下硬化，因此请小心但快速地工作。

最后，硫酸钠和对苯二酚对光敏感，因此反应管和溶液应用铝箔包裹。