Name: 冷冻干燥细菌及其影响细胞生存的配方 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 了解冷冻干燥配方对细菌细胞存活率的影响，探索不同物理和结构特性如何影响细胞在脱水过程中的生存能力。该方法为优化微生物保存技术提供了重要框架。

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本工作由瑞典战略环境研究基金会（MISTRA）通过DOM项目以及欧盟共同体第七框架计划资助项目211684（BACSIN）资助。我们感谢J. Engstrand在X射线分析拍摄过程中提供的协助，以及L. Tang在概念叙述方面给予的帮助。

1. P. putida 的培养与收获
<ol>
	<li>通过将一株在添加胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基上培养的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）菌落接种至100 ml胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，制备恶臭假单胞菌（P. putida）的种子培养物。将培养物置于30 °C、130 rpm的摇床上培养。</li>
	<li>7小时后，取相当于主培养最终体积1/10的种子培养物等分试样，转接到新鲜的TSB培养基中。将细胞在30 °C、130 rpm的摇床上继续培养16小时。</li>
	<li>培养16小时后，将细胞培养物在室温下以1,500 × g离心20分钟收集细胞。倒去上清液，并用与培养基等渗的NaCl溶液重悬细胞沉淀进行洗涤。本实验中使用150 mM NaCl溶液。随后再次离心，弃去上清液，再将细胞重悬于配方培养基中，参见步骤3.2。</li>
</ol>
2. 其他物种的培养
<ol>
	<li>若要将该方案适用于其他细菌种类，应根据该物种的需求调整培养和收获步骤。在收获及洗涤步骤中处理细胞时，为避免渗透压休克，所用溶液的渗透压需与收获时培养基的渗透压相匹配。</li>
</ol>
3. 细胞的制备
<ol>
	<li>称取相应的基质组分，溶于水中，制备配方溶液。为达到等渗条件，可通过调整辅料用量，或添加 NaCl 或其他细胞相容性溶质，使渗透压达到目标值。对于蔗糖等低分子量物质，可直接调节其用量以实现等渗；而对于聚合物等高分子量物质，则需使用细胞相容性溶质调节渗透压。 例如 NaCl 或二糖。需要注意的是，任何物质的添加都会影响制剂的物理性质，进而可能影响冻干行为和细胞存活率。</li>
	<li>弃去洗涤液（此处为 NaCl），并将细胞重新悬浮于相应的制剂培养基中。</li>
	<li>确保细胞均匀分散。低黏度制剂通过涡旋混合，而较高黏度制剂则通过添加并混合的方式进行操作。 例如，一个搅拌子，并通过摇动容器直至均匀混合。</li>
	<li>将制剂分装至冻干小瓶中。小瓶需在空瓶状态、加入样品后以及冻干后分别称重，以计算冻干过程中去除的水分含量。</li>
	<li>如果要将小瓶密封在冻干机内，请在小瓶上加上橡胶塞，参见步骤 4.3。</li>
	<li>在冻干前对每种配方中的细胞进行计数，参见步骤6。</li>
</ol>
4. 冷冻干燥
<ol>
	<li>冻干条件必须根据配方的物理特性进行调整。在此情况下，最重要的参数是配方的玻璃化转变温度，对于冷冻浓缩样品，以 Tg' 表示，以表明其中仍含有水分。可通过差示扫描量热法（DSC）轻松测定冷冻浓缩配方的 Tg'，参见步骤 7。</li>
	<li>调整冻干工艺参数，确保样品温度始终低于其玻璃化转变温度（Tg），且腔室压力能够实现冰的快速升华。，即 初级干燥，以及配方中的残留水分， 即 二次干燥。若干燥过程中样品温度高于Tg'，则样品结构坍塌的风险显著增加，可能导致细胞存活率大幅降低。</li>
	<li>为保护冻干后的产品，需对样品所处的气体环境进行控制。若条件允许，应在冻干循环结束、真空解除之前，于冻干机内对样品进行密封。或者，可将样品瓶充入理想的气体环境。应避免将样品暴露于环境条件下，因为储存环境中存在的任何水分或氧气均会影响细胞的存活率。</li>
	<li>称量小瓶。</li>
</ol>
5. 重悬
<ol>
	<li>用去离子无菌水重悬样品。加入的水量应与冻干过程中去除的水量相同，可通过空瓶重量、冻干前及冻干后含样品瓶的重量计算得出。间歇涡旋振荡样品，直至溶液呈现均匀状态。</li>
</ol>
6. 计数
<ol>
	<li>从每个样品中吸取 100 μl，进行 10 倍系列稀释。取 100 μl 目标稀释液涂布于 TSA 平板上。将平板在所需温度和时间下进行培养。</li>
</ol>
7. 冷冻行为制剂的表征
<ol>
	<li>取少量样品（5 - 10 mg），将其密封于DSC铝坩埚中并盖上盖子。同时准备一个空坩埚作为参比。</li>
	<li>设定DSC温度扫描程序。冷却程序应模拟冻干过程中的冷冻步骤，因为冷却动力学可能影响水合制剂的Tg′。在开始升温扫描前，将温度降至待测制剂预期Tg′以下足够低的温度，通常为-100 °C。</li>
	<li>选择合适的升温速率，通常采用5 - 40 °C/min的升温速率。记录的热流信号以瓦特（watts）表示，其值受升温速率影响。较高的升温速率将产生更大的Tg′信号。</li>
	<li>设定温度范围，确保涵盖Tg′以及制剂的熔融过程。</li>
</ol>
8. 水合制剂的表面张力测定
<ol>
	<li>本实验所采用的实验装置依据杜诺伊法测量表面张力。</li>
	<li>仔细清洁铂金环和测量容器。用丙酮冲洗容器，再用无绒纸巾擦拭，然后用无色火焰从内侧灼烧。铂金环在无色火焰中灼烧至发红。</li>
	<li>将溶液注入容器中，并在测量前让液面静置稳定。对于需要较长时间才能达到平衡状态的溶液， 例如 聚合物，此处使用的简易装置将提供定性数据。</li>
	<li>对于高粘度的制剂， 例如 2%（w/w）HEC 或 HPMC 溶液的表面张力需在较低浓度溶液中进行测量，然后外推得出。可通过利用表面张力在浓度低于 0.5%（w/w）时趋于稳定的特性来实现。</li>
</ol>
9. 干燥制剂的X射线分析
<ol>
	<li>取少量基质/细菌样品，加载到样品托上。</li>
	<li>将样品托安装至X射线衍射仪中。</li>
	<li>为分析样品中任何存在的结晶相，可使用布鲁克公司的EVA程序包。</li>
</ol>
10. 电子显微镜
<ol>
	<li>从样品瓶中取出少量基质/细菌，并将其固定在扫描电镜样品台（SEM stub）上。</li>
	<li>将扫描电镜样品台放入溅射镀膜仪（本研究使用 Thermo VGScientific Polaron SC7640）中，用几纳米厚的 Au/Pd 或 Pt 对样品进行镀膜。本实验的溅射参数为：1,900 V、20 mA、20 秒，获得约 5–10 nm 的 Au/Pd 镀层。镀膜可减少图像采集过程中的电荷积累。建议先进行薄层镀膜，若仍存在电荷积累并导致图像伪影，则应对样品再次镀膜。</li>
	<li>将扫描电镜样品台装入扫描电镜腔室。选择合适的成像参数。对于 图2 所使用的仪器（FEI Strata DB235），我们采用 5 kV 的加速电压、束斑大小为 3、工作距离为 5 mm，并使用二次电子探测器。</li>
	<li>可选地，可使用聚焦离子束（Focused Ion Beam）对嵌入聚合物中的细菌进行截面切割，以揭示更多细节。</li>
</ol>

<ol><li>Wessman, P., Mahlin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+matrix+properties+on+the+survival+of+freeze-dried+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sci.+Food+Agric%22%5BJournal%5D)">Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria.</a> J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).</li>
<li>Ablett, S., Izzard, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Scanning+Calorimetric+Study+of+Frozen+Sucrose+and+Glycerol+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Chemical+Society-Faraday+Transactions%22%5BJournal%5D)">Differential Scanning Calorimetric Study of Frozen Sucrose and Glycerol Solutions.</a> Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. 88 (6), 789-794 (1992).</li>
<li>Knopp, S. A., Chongprasert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+type+TMDSC+curve+of+frozen+sucrose+solutions+and+collapse+during+freeze-drying%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Analysis+and+Calorimetry%22%5BJournal%5D)">The relationship between type TMDSC curve of frozen sucrose solutions and collapse during freeze-drying.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 54 (2), 659-672 (1998).</li>
<li>Crowe, J. H., Leslie, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Vitrification+Sufficient+to+Preserve+Liposomes+during+Freeze-Drying%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Is Vitrification Sufficient to Preserve Liposomes during Freeze-Drying.</a> Cryobiology. 31 (4), 355-366 (1994).</li>
<li>Jain, P., Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glass-forming+biopreservatives+on+head+group+rotational+dynamics+in+freeze-dried+phospholipid+bilayers%3A+A+P-31+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Effect of glass-forming biopreservatives on head group rotational dynamics in freeze-dried phospholipid bilayers: A P-31 NMR study.</a> Journal of Chemical Physics. 131 (2), (2009).</li>
<li>Stock, J. B., Rauch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+Space+in+Salmonella-Typhimurium+and+Escherichia-Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Periplasmic Space in Salmonella-Typhimurium and Escherichia-Coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 252 (21), 7850-7861 (1977).</li>
<li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anhydrobiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Anhydrobiosis.</a> Annual Review of Physiology. 54, 579-599 (1992).</li>
<li>Leslie, S. B., Israeli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+and+Sucrose+Protect+Both+Membranes+and+Proteins+in+Intact+Bacteria+during+Drying%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61 (10), 3592-3597 (1995).</li>
<li>Nesarikar, V. V., Nassar, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cations+and+anions+on+glass+transition+temperatures+in+excipient+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Development+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effect of cations and anions on glass transition temperatures in excipient solutions.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 12 (3), 259-264 (2007).</li>
<li>You, Y., Ludescher, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sodium+chloride+on+molecular+mobility+in+amorphous+sucrose+detected+by+phosphorescence+from+the+triplet+probe+erythrosin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of sodium chloride on molecular mobility in amorphous sucrose detected by phosphorescence from the triplet probe erythrosin B.</a> Carbohydr. Res. 343 (2), 350-363 (2008).</li>
<li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Nguyen, K. H. N., Crowe, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+vitrification+involved+in+depression+of+the+phase+transition+temperature+in+dry+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids.</a> Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1280, 187-196 (1996).</li>
</ol>

声明无利益冲突。

本研究的目的是探讨一些可能对细胞在冻干过程中存活有重要意义的配方特性。尽管不同物种固有的干燥耐受性存在差异（如图1A所示），但不同配方对细胞存活的支持效果总体趋势相似。首先比较蔗糖和菲可尔（Ficoll）具有参考意义。人们认为，配方成分能否在脱水过程中替代水分子，从而在干燥状态下维持细胞内蛋白质和膜结构的完整性，是决定其是否能够支持细胞存活的关键因素。二糖类物质（如蔗糖以及海藻糖）具有这种特性，而多糖类聚合物（如淀粉）则不具备5,11。由于聚合物分子过大，无法像二糖那样与膜脂发生有效相互作用。另一个对微生物成功冻干至关重要的特性是支撑基质在冻干过程中形成玻璃化状态（即转变为非晶态固体）的能力。非晶态结构有利于屏蔽外界影响并保持细胞彼此分离。有趣的是，只要冻干操作得当，二糖和聚合物均能容易地实现玻璃化。我们的结果表明，基于蔗糖和菲可尔的配方在冻干后均形成非晶态结构（见表1），且对细胞存活的支持效果相当。然而，这两种糖类之间仍存在显著差异。与蔗糖不同，菲可尔分子量高达400 kDa，体积过大，无法在冻干过程中与脂质膜相互作用时替代水分...

<table><tbody><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>GE-healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>HEC（Natrosol-M 药用级）</td><td>Ashland</td><td></td><td>由 Ashland 赠送</td></tr><tr><td>HPMC（Methocel F4M）</td><td>Dow</td><td></td><td>由乌普萨拉大学药学系赠送</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2395</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr><tr><td>Lyostar II</td><td>FTS Kinetics</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Pyris Diamond DSC</td><td>Perkin-Elmer</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Bruker AXS SMART CCD 1k 衍射仪</td><td>Bruker</td><td>N.A</td><td></td></tr><tr><td>Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM</td><td>FEI</td><td>N.A</td><td></td></tr><tr><td>Kr&amp;#252;ss 教学用张力计</td><td>Kr&amp;#252;ss</td><td>N.A.</td><td></td></tr></tbody></table>

细菌冻干制剂及其对细胞存活率的影响

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

细胞中的水分可以被去除，以可逆地使微生物失活，从而便于储存。其中一种脱水方法是冷冻干燥，被认为是一种温和的脱水方式。为了提高细胞在干燥过程中的存活率，通常需要预先对细胞进行配方处理。该配方形成一种基质，将细胞包埋其中，从而在冷冻和干燥过程中保护细胞免受多种有害应力的影响。本文介绍了一种评估细胞冷冻干燥后存活率的通用方法，并通过比较四种不同配方对两种细菌菌株——P. putida KT2440 和 A. chlorophenolicus A6 的影响来加以说明：分别为二糖蔗糖、由蔗糖衍生的聚合物Ficoll PM400，以及相应的多糖羟乙基纤维素（HEC）和羟丙基甲基纤维素（HPMC）。本研究展示了如何制备用于冷冻干燥的配方，并通过差示扫描量热法（DSC）、表面张力测定、X射线分析和电子显微镜对配方进行表征，将这些数据与细胞在复水后的存活率相关联，以探究细胞存活的机制。所选用的聚合物旨在使其单体结构在不同程度上模拟蔗糖对应的多糖结构。通过该实验体系，我们证明，只要控制配方的某些物理特性，聚合物对细胞存活的保护效果可与二糖相媲美1。

表1展示了配方组成的数据、DSC在加热冷冻制剂过程中记录的热事件、干燥样品的结构以及配方溶液的表面张力。Tg'（玻璃化转变温度）对于蔗糖已被确定为-40 °C2, 3，且当蔗糖浓度低于20% w/w时，该温度可能难以检测。-35 °C处的热事件可能与冰开始溶解有关2。通过X射线在HEC和HPMC样品中检测到的结晶结构，以及在SEM中观察到的结构（见图2b和2c），与NaCl的正常晶体形态重叠。
图1A展示了革兰氏阴性菌P. putida和革兰氏阳性菌A. chlorophenolicus在不同基于糖类的制剂中的存活数据。请注意，两种细菌在不同制剂中存活能力的趋势相同。图1B中的图表说明了冻干存活率与制剂表面张力之间的相关性。
图2展示了干燥制...

冷冻干燥通常是获得可存活细菌细胞干燥产物的一种简便且有效的方法。该过程的一个问题是细胞存活率。本文详细阐述了一种用于研究冻干过程中细胞存活率如何受到所用配方特性影响的实验方案。

细胞中的水分可被去除，以可逆地使微生物失活，从而便于储存。一种去除水分的方法是冷冻干燥，该方法是……

以下实验的目的是观察不同类型的冻干制剂对细胞存活率的影响。首先，制备用于冻干细胞培养物的不同制剂。然后将每种制剂与细胞培养物混合，进行冻干，随后复水，并测定其存活率。结果显示，存活率的差异可与所表征的特性相关联。该方法可帮助您理解在脱水过程中，配方的哪些物理和结构特性对细胞存活具有重要意义。要制备假单胞菌（Pseudomonas putter）的种子培养物，首先在含有胰蛋白胨大豆琼脂（aga）并补充了胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的培养基上培养单个菌落，然后将其接种至100毫升胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，在30°C、130 RPM振荡条件下培养7小时。取一份培养物转移至新鲜的TSB培养基中，培养16小时。在室温下以1,500 × g离心20分钟收集细胞。用重悬液洗涤细胞沉淀，将其悬浮于150毫摩尔氯化钠溶液中。离心收集细胞并重悬。将细胞悬浮于冻干用配制培养基中，以制备用于冷冻干燥细胞的配制溶液。称取相应的基质组分并溶于水中，以达到等渗条件。使用辅料氯化钠或其他细胞相容性溶质调节溶液。为在低黏度溶液中均匀重悬细胞，需涡旋混匀；对于高黏度溶液，同样进行涡旋处理。加入搅拌子并摇动混合物。接着，将制剂分装至预先称重的冻干小瓶中，并称量小瓶重量。从每个样品中吸取 100 µL，进行十倍系列稀释，接种所需稀释度的样品，并在室温下培养。若小瓶将在冻干机内密封，则在已接种细胞的小瓶上放置橡胶塞。对每种配方中的细胞进行计数。采用杜诺法（dune, we method）测定干燥后细菌混合物的表面张力。将铂金环置于无色火焰中灼烧至发红，以进行清洁。使用丙酮和无绒布清洁测量容器，并用火焰灼烧内壁。对于需要较长时间达到平衡的溶液，应先将溶液注入容器，待液面稳定后再进行测量。本实验装置适用于高黏度配方的定性数据分析。使用较低浓度的溶液测量表面张力，并外推冻干条件，这些条件必须根据配方的物理性质进行调整。最重要的参数是配方的玻璃化转变温度，即TG，对于冻干浓缩样品用TG'表示，表明仍有水分存在。为确定配方的冻结行为，将5至10毫克样品密封于带盖的差示扫描量热法（DSC）铝坩埚中。准备一个空坩埚作为参比。将DSC温度扫描程序设置为模拟冻干程序中的冷冻步骤。这样做的原因是，在加热扫描开始之前，冷却动力学可能会影响未冻干制剂的玻璃化转变温度（Tg′）。将温度降至远低于预期玻璃化转变温度（tg）的水平。针对所研究的配方，选择合适的升温速率。记录的热流信号以瓦特（W）表示，其数值会受到升温速率的影响。较高的加热速率将使玻璃化转变温度（Tg'）信号更明显，设定温度范围时应涵盖Tg'以及制剂的熔融过程。确定冷冻行为后，调整冻干工艺参数，确保样品温度始终低于样品的玻璃化转变温度（Tg），同时使腔室压力有利于制剂中冰和残留水分的快速升华。为保护冻干后的产品。在冻干循环结束、释放真空之前，通过将样品在冻干机中密封，以控制样品所处的气体环境。或者，也可将小瓶填充为所需的气体环境。应避免让样品暴露于环境条件下，因为储存气氛中存在的任何水分或氧气都会影响细胞的存活率。最后，称量小瓶，通过X射线分析样品。将少量细菌基质加载到样品台上，并将样品台安装至X射线折射仪中。使用与X射线设备兼容的软件分析样品中任何存在的结晶相。为了通过电子显微镜分析细菌基质，取少量样品置于固定在扫描电镜样品台上的导电胶带上。将电镜样品台放入喷镀仪中，用金-钯或铂对样品进行镀膜，以用于成像。将电镜样品台装入电镜腔室，并选择合适的成像参数。例如，在该仪器上我们采用 5 kV 的加速电压、3 的束斑尺寸、5 mm 的工作距离以及二次电子探测器。此表格列出了不同制剂的相关数据，包括差示扫描量热法（DSC）在加热冷冻制剂过程中记录的热事件、干燥样品的结构以及制剂溶液的表面张力。蔗糖的玻璃化转变温度（Tg'）为 -40 °C，当蔗糖浓度低于 20%（重量/重量）时，检测较为困难。在零下35摄氏度时出现的热事件可能与此处所示的冰溶解开始有关。针对革兰氏阴性菌P putter和革兰氏阳性菌a CHLOROPHYL cus，在不同基于糖类的配方中的存活数据。请注意，两种细菌在不同配方中对细胞存活的支持效果趋势相似。该图展示了冻干后存活率与配方表面张力之间的相关性，表明较高的表面张力可带来更高的存活率。此处展示的 SEM 图像代表了四种不同聚合物的干燥配方，其基质形态类似于脆性纸张或相互连接的光滑薄片，其中嵌有呈波纹状排列的细菌。这些薄片厚度约为 1 微米，宽度为 10 至 20 微米，其中 fi、ccal 和蔗糖形成的薄片结构更为明显；HPMC 和 HEC 则形成更薄的薄片，且 fi ccal 表面更为光滑。并且细菌更易于观察，可能是因为这些以纤维素为基础的配方中聚合物与细菌的比例较低。此外，HEC和HPMC中均观察到盐晶体析出，其中HPMC在聚合物膜表面析出的沉淀物更多。观看本视频后，您应能充分理解如何利用本视频中展示的技术，通过制剂特性来评估细胞存活情况。

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