细菌冻干制剂及其对细胞存活率的影响

以下实验的目的是观察不同类型的冻干制剂对细胞存活率的影响。首先，制备用于冻干细胞培养物的不同制剂。然后将每种制剂与细胞培养物混合，进行冻干，随后复水，并测定其存活率。

结果显示，存活率的差异可与所表征的特性相关联。该方法可帮助您理解在脱水过程中，配方的哪些物理和结构特性对细胞存活具有重要意义。要制备假单胞菌（Pseudomonas putter）的种子培养物，首先在含有胰蛋白胨大豆琼脂（aga）并补充了胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的培养基上培养单个菌落，然后将其接种至100毫升胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，在30°C、130 RPM振荡条件下培养7小时。

取一份培养物转移至新鲜的TSB培养基中，培养16小时。在室温下以1,500 × g离心20分钟收集细胞。用重悬液洗涤细胞沉淀，将其悬浮于150毫摩尔氯化钠溶液中。

离心收集细胞并重悬。将细胞悬浮于冻干用配制培养基中，以制备用于冷冻干燥细胞的配制溶液。

称取相应的基质组分并溶于水中，以达到等渗条件。使用辅料氯化钠或其他细胞相容性溶质调节溶液。为在低黏度溶液中均匀重悬细胞，需涡旋混匀；对于高黏度溶液，同样进行涡旋处理。

加入搅拌子并摇动混合物。接着，将制剂分装至预先称重的冻干小瓶中，并称量小瓶重量。从每个样品中吸取 100 µL，进行十倍系列稀释，接种所需稀释度的样品，并在室温下培养。若小瓶将在冻干机内密封，则在已接种细胞的小瓶上放置橡胶塞。

对每种配方中的细胞进行计数。采用杜诺法（dune, we method）测定干燥后细菌混合物的表面张力。将铂金环置于无色火焰中灼烧至发红，以进行清洁。

使用丙酮和无绒布清洁测量容器，并用火焰灼烧内壁。对于需要较长时间达到平衡的溶液，应先将溶液注入容器，待液面稳定后再进行测量。本实验装置适用于高黏度配方的定性数据分析。

使用较低浓度的溶液测量表面张力，并外推冻干条件，这些条件必须根据配方的物理性质进行调整。最重要的参数是配方的玻璃化转变温度，即TG，对于冻干浓缩样品用TG'表示，表明仍有水分存在。为确定配方的冻结行为，将5至10毫克样品密封于带盖的差示扫描量热法（DSC）铝坩埚中。

准备一个空坩埚作为参比。将DSC温度扫描程序设置为模拟冻干程序中的冷冻步骤。这样做的原因是，在加热扫描开始之前，冷却动力学可能会影响未冻干制剂的玻璃化转变温度（Tg′）。

将温度降至远低于预期玻璃化转变温度（tg）的水平。针对所研究的配方，选择合适的升温速率。记录的热流信号以瓦特（W）表示，其数值会受到升温速率的影响。

较高的加热速率将使玻璃化转变温度（Tg'）信号更明显，设定温度范围时应涵盖Tg'以及制剂的熔融过程。确定冷冻行为后，调整冻干工艺参数，确保样品温度始终低于样品的玻璃化转变温度（Tg），同时使腔室压力有利于制剂中冰和残留水分的快速升华。为保护冻干后的产品。

在冻干循环结束、释放真空之前，通过将样品在冻干机中密封，以控制样品所处的气体环境。或者，也可将小瓶填充为所需的气体环境。应避免让样品暴露于环境条件下，因为储存气氛中存在的任何水分或氧气都会影响细胞的存活率。

最后，称量小瓶，通过X射线分析样品。将少量细菌基质加载到样品台上，并将样品台安装至X射线折射仪中。使用与X射线设备兼容的软件分析样品中任何存在的结晶相。

为了通过电子显微镜分析细菌基质，取少量样品置于固定在扫描电镜样品台上的导电胶带上。将电镜样品台放入喷镀仪中，用金-钯或铂对样品进行镀膜，以用于成像。将电镜样品台装入电镜腔室，并选择合适的成像参数。

例如，在该仪器上我们采用 5 kV 的加速电压、3 的束斑尺寸、5 mm 的工作距离以及二次电子探测器。此表格列出了不同制剂的相关数据，包括差示扫描量热法（DSC）在加热冷冻制剂过程中记录的热事件、干燥样品的结构以及制剂溶液的表面张力。蔗糖的玻璃化转变温度（Tg'）为 -40 °C，当蔗糖浓度低于 20%（重量/重量）时，检测较为困难。

在零下35摄氏度时出现的热事件可能与此处所示的冰溶解开始有关。针对革兰氏阴性菌P putter和革兰氏阳性菌a CHLOROPHYL cus，在不同基于糖类的配方中的存活数据。请注意，两种细菌在不同配方中对细胞存活的支持效果趋势相似。

该图展示了冻干后存活率与配方表面张力之间的相关性，表明较高的表面张力可带来更高的存活率。此处展示的 SEM 图像代表了四种不同聚合物的干燥配方，其基质形态类似于脆性纸张或相互连接的光滑薄片，其中嵌有呈波纹状排列的细菌。这些薄片厚度约为 1 微米，宽度为 10 至 20 微米，其中 fi、ccal 和蔗糖形成的薄片结构更为明显；HPMC 和 HEC 则形成更薄的薄片，且 fi ccal 表面更为光滑。

并且细菌更易于观察，可能是因为这些以纤维素为基础的配方中聚合物与细菌的比例较低。此外，HEC和HPMC中均观察到盐晶体析出，其中HPMC在聚合物膜表面析出的沉淀物更多。观看本视频后，您应能充分理解如何利用本视频中展示的技术，通过制剂特性来评估细胞存活情况。