Name: 复透皮电化学传感的空心微针为基础的传感器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学习利用空心微针阵列与激光微加工技术制备多路复用电化学传感器，实现多种分析物的经皮同步检测。该方法为生物医学工程中的微创诊断与实时健康监测提供了创新平台。

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桑迪亚是一个多项目实验室，由洛克希德·马丁公司旗下的桑迪亚公司为美国能源部国家核安全管理局根据合同DE-AC04-94AL85000运营。作者感谢桑迪亚国家实验室实验室主导研究与开发（LDRD）项目提供的资助。

1. 微针制备
<ol>
	<li>使用三维建模软件 Solidworks（Dassault Systemes SA，Velizy，法国）设计一个金字塔形状的中空微针阵列（图1）。3-5</li>
	<li>使用 Magics RP 13 软件（Materialise NV，Leuven，比利时）为微针阵列设计支撑结构。该支撑结构可在制造过程中使树脂从装置中排出，并为微针的构建提供基底。示例支撑结构如图1所示。</li>
	<li>将关联的支撑结构与微针阵列文件上传至 Perfactory RP 软件（EnvisionTEC GmbH，Gladbeck，德国），该软件用于控制制造过程。在该软件中选择需制造的微针阵列数量，并确定装置在制造板上的位置。</li>
	<li>对 Perfactory 快速成型制造系统在紫外模式下以 180 mW 进行校准，并确认能量偏差在 ±2 mW 范围内。</li>
	<li>制造完成后，将微针阵列从基板上取下，并在异丙醇中清洗 15 分钟。用压缩空气吹干阵列，并在 Otoflash Postcuring System（EnvisionTEC GmbH，Gladbeck，德国）中于室温下固化 50 秒，以确保完全聚合。</li>
	<li>通过显微镜验证微针的制造质量，确认每根微针的孔道均为中空且无堵塞。完全制造完成的微针如图2所示。</li>
</ol>
2. 碳糊电极阵列的制备
<ol>
	<li>使用60 W的Model 6.75 CO2光栅/矢量激光系统（Universal Laser Systems, Inc., Scottsdale, AZ），在从商业来源（Molex Connector Corp., Lisle, IL）获得的扁平柔性电缆（21039-0249）上切割出孔洞，以暴露其下方可独立寻址的连接铜线（图3 (A和B)）。将扁平柔性电缆放置于夹具中，以在激光烧蚀板上实现准确定位。采用光栅扫描方式在柔性电缆的绝缘部分加工出直径为500 μm的腔体。烧蚀图案在CorelDraw（Corel, Ottawa, Ontario）中设计，并传输至激光系统。</li>
	<li>使用在40 psi压力下喷射丙酮的喷枪清洁经改造的扁平柔性电缆。随后用异丙醇和去离子水冲洗，完成最终清洗。在显微镜下确认暴露的铜条表面无残留绝缘膜。</li>
	<li>下一步是创建用于填充碳糊的容纳腔。将单面涂有压敏丙烯酸胶粘剂、厚度为0.002英寸的Melinex胶带，按照电极条带的相同图案进行烧蚀，覆盖在已烧蚀的电极条带上，并在3000 psi压力下压合2分钟，以确保良好连接。此步骤中腔体直径为750 μm。</li>
	<li>随后，使用双面涂有压敏丙烯酸胶粘剂、厚度为0.004英寸的另一层Melinex胶带，以与单面胶带相同的图案进行烧蚀，经对准后用于将微针阵列与碳糊电极阵列键合。</li>
</ol>
3. 功能性碳糊的合成与电极腔体的填充
<ol>
	<li>葡萄糖敏感型碳糊基于先前的配方，通过将10 mg葡萄糖氧化酶与2.2 mg聚乙烯亚胺混合，直至形成均匀混合物而制得。16 向该混合物中加入60 mg负载量为5%的碳载铑粉末，再加入40 mg矿物油并充分混匀。将所得糊状物置于 4 °C 直至使用；制备后的糊剂可在一周内使用完毕。</li>
	<li>pH 敏感型碳糊通过混合 30%（w/w）矿物油和 70%（w/w）石墨粉制得。按照第 3.4 节所述方法将糊状物填入电极腔。配制 10 mM 快速蓝 RR 重氮盐（4-苯甲酰氨基-2,5-二甲氧基苯重氮氯化物半（氯化锌）盐）的 0.5 M 磷酸溶液。17，放置一个 20 μl 将该溶液一滴加至压实的糊状电极上，静置30分钟，使Fast Blue PR重氮盐自发发生化学吸附。用去离子水冲洗，不使用时存于缓冲液或去离子水中。</li>
	<li>乳酸敏感型碳糊基于先前的配方制备，通过将2.5 mg载铑碳粉与2.5 mg乳酸氧化酶混合，交替进行超声处理5分钟和涡旋振荡5分钟，重复五个循环获得。18</li>
	<li>将改性浆料填充至制备好的平面柔性电缆时，需将相应的浆料涂覆于电极腔内。使用一小片塑料（例如塑料称量皿的边缘）作为抹刀，将浆料压实直至表面光滑。再用第二个洁净的称量皿重复操作，以去除多余的浆料。随后用去离子水清洗。图示展示了激光烧蚀形成腔体、碳浆料填充以及微针集成（见第2和第3节）的示意图。 图3.</li>
</ol>
4. 检测与传感器校准
<ol>
	<li>通过在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH=7.5）中，于-0.15 V电位下测量传感器的计时安培响应，并在15秒后记录电流，实现乳酸的检测。图4(a)展示了乳酸检测的电催化反应示意图。</li>
	<li>葡萄糖检测以类似方式进行，即在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，于-0.05 V电位下测量传感器的计时安培响应，并在15秒后记录电流。图4(b)展示了葡萄糖检测的电催化反应示意图。</li>
	<li>pH值通过在-0.7 V至0.8 V范围内以100 mV/s的扫描速率进行循环伏安扫描，并记录氧化峰电位的位置来进行监测。pH检测所涉及的氧化还原反应示意图见图5。</li>
	<li>葡萄糖和乳酸传感器的校准曲线可通过依次加入相应分析物来建立；每次加入分析物后，按照5.1和5.2节所述进行计时安培测量。或者，可在搅拌条件下进行固定电位的计时安培测量，每次加入分析物之间留出足够时间（约10–100秒），以确保电流稳定。</li>
	<li>pH校准曲线可通过在pH值从5到8、以1.0 pH单位递增的一系列已知pH缓冲液中，测量氧化峰电位的位置，并按照5.3节所述记录循环伏安图来建立。</li>
</ol>
5. 代表性结果
在静止溶液中使用修饰碳糊填充微针获取计时安培曲线（例如用于葡萄糖或乳酸检测）时，施加相应的检测电位后，电流会立即下降，并最终衰减至稳态值。图6展示了一个典型结果，该数据来自对乳酸微针依次加入2 mM乳酸并进行记录。每次加入乳酸后，必须短暂搅拌溶液。15秒时的电流随乳酸浓度增加而上升；该电流响应可用于测定未知溶液中乳酸的浓度。或者，可在搅拌溶液（或流动溶液）中进行连续监测，如在葡萄糖浓度逐步升高溶液中的示例所示（图5）。同样，随着葡萄糖浓度增加而产生的电流上升可用于对未知溶液的葡萄糖响应进行校准。每次浓度突增后，必须留出足够时间使溶液达到稳定状态。图6显示了在0.1 M磷酸盐缓冲液中，pH敏感微针对pH值从5到8（以1个pH单位递增）四种不同pH溶液测得的循环伏安图。氧化峰电位随pH升高发生偏移；该现象被用作pH值的指示依据。
<img alt="微加工示意图；三角形微结构；三维设计概念；模拟分析。" src="/files/ftp_upload/4067/4067fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 在Solidworks中创建的微针阵列STL文件图像（A），以及显示支撑结构的屏幕截图（B）。
<img alt="北卡州立大学拍摄的微加工结构的扫描电镜图像，锥形阵列（A）和单个锥形细节（B）" src="/files/ftp_upload/4067/4067fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 微针阵列（A）及该阵列中单个微针（B）的扫描电子显微照片。
<img alt="柔性扁平电缆传感器示意图；显示激光烧蚀、碳浆、微针阵列步骤。" src="/files/ftp_upload/4067/4067fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 柔性扁平电缆组装示意图。步骤包括改造柔性扁平电缆（A），烧蚀出图案化圆圈（B），添加最初烧蚀的Melinex层并填充碳浆（C），以及添加第二层烧蚀的Melinex层并与微针阵列对接（D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4067/4067fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="用于浓度分析的电流-时间电化学动力学图，显示六条曲线。" src="/files/ftp_upload/4067/4067fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 在 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH = 7.5）中，于 -0.15 V 下进行 15 秒计时电流扫描，对乳酸敏感糊剂进行校准。每次电流增加对应加入 2 mM 乳酸。
<img alt="葡萄糖浓度对电流的影响；图表显示随着2 mM葡萄糖的逐步加入，电流逐步下降。" src="/files/ftp_upload/4067/4067fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 在-0.05 V电位下对葡萄糖敏感糊剂进行计时安培扫描校准。每次响应信号的下降对应加入2 mM葡萄糖。校准过程中使用搅拌的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）。本研究中采用外部Ag/AgCl电极作为参比电极，并使用Pt电极作为对电极。
<img alt="循环伏安法图；电流-电位关系；pH 影响：5.0、6.0、7.0、8.0；电化学。" src="/files/ftp_upload/4067/4067fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 0.1 M 磷酸盐缓冲液中 pH 敏感型碳糊电极在 pH 5–8 范围内以 1 pH 单位递增的循环伏安图（CV）（青色 = pH 8.0，绿色 = pH 7.0，紫色 = pH 6.0，红色 = pH 5.0）。第五条 CV 曲线用于相对于 Ag/AgCl 参比电极和 Pt 丝对电极的分析。

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</ol>

无利益冲突声明。

在器件制备之前，已综合考虑了该基于微针的传感器设计的多个方面。为了实现实时检测，传感器的响应时间必须较短；在本方案中，每个测试的传感器响应时间均低于十五秒。本方案所采用的糊剂还考虑了其在体内环境中的选择性，因为体内环境含有可干扰电极响应的电活性生物分子。除了糊剂成分外，还通过选择合适的工作电位以最大限度地减少干扰性电活性物质的影响。成功制备微针阵列需要选择合适的微针结构设计和微针材料。这两个因素将决定微针是否能够穿透皮肤、保护电极免受物理损伤，并避免电极与组织直接接触。需要注意的是，测量过程中使用了外部的Ag/AgCl参比电极和Pt对电极；若将该器件用于人体或动物的体内实验，则需将这些电极集成于器件内部。
基于微针的传感器的每个组件都具有需要验证的特性，以确保其正常功能。在平面柔性电缆修饰过程中的质量控制（图3 B）包括确保激光烧蚀后镀锡铜线表面的绝缘层被完全去除（图3）。若激光烧蚀后未能完全去除铜线表面的绝缘层，可能导致因电接触不完全而产生不规则响应。激光烧蚀后的Melinex胶带需通过显微镜检...

基于中空微针的多通道透皮电化学传感传感器

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

开发一种用于快速分析生物学相关分子的微创多重监测系统，可为患有慢性疾病的人群提供便捷的即时生理状态评估。此外，该系统还可作为研究复杂、多因素医学状况的工具。要实现这种多分析物传感器，必须满足以下条件：具备微创性，能够无痛且安全地采集组织间液，并实现快速且高选择性的分析。
微针最初被开发用于无痛药物递送，现已用于通过皮肤递送疫苗和药理学制剂（例如胰岛素）1-2。由于这些装置可进入皮下组织间隙，集成微电极的微针可作为经皮电化学传感器使用。已有研究证实，利用集成微针-电极装置，结合碳纤维、修饰碳糊以及镀铂聚合物微针作为换能元件，可实现对葡萄糖、谷氨酸、乳酸、过氧化氢和抗坏血酸的选择性检测3-7,8。
这种微针传感器技术为原位同时检测多种分析物提供了一种新颖且复杂的分析方法。多重检测使得监测复杂的微环境成为可能，而这些微环境通常难以通过快速且微创的方式进行表征。例如，该技术可用于同时监测细胞外葡萄糖、乳酸和pH水平9，这些是疾病状态7,10-14（如癌症增殖）和运动诱发性酸中毒15的重要代谢指标。

本文详细介绍了基于微针的多重传感器的构建方法。该装置正在被开发用于对多种分析物进行原位采样和电化学分析，具有快速且选择性高的特点。我们预期这类基于微针的传感器将在临床医学和生物医学研究中得到应用。

开发一种用于快速分析生物学相关分子的微创多重监测系统，可为个体提供……

本实验的总体目标是制备一种基于多重微针的传感器，用于经皮电化学检测多种可同时测定的目标分析物。第一步是采用神秘光刻技术制备中空微针阵列，并利用激光微加工技术构建电极阵列腔体。随后配制独立的碳糊材料，并将电极阵列腔体填充完毕。接下来，在一系列生理相关浓度范围内校准每种碳糊电极。最终，构建出一种经皮体内电化学装置，能够同时在复杂的生理微环境中检测多种分析物，适用于多种生物医学应用。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够以微创方式实现多重检测。该设备可作为研究工具，用于测量急性医学反应，深入了解身体运动过程中的适应性变化，并监测影响皮肤的疾病。这种活体微针传感器的应用前景包括皮肤肿瘤的诊断，因为肿瘤微环境可作为肿瘤增殖和转移的指示指标。我们研发该设备的目标是利用微针阵列作为一种微创机制，获取真皮层间质液，以进行电化学分析。首先在三维建模软件 SolidWorks 中开始，设计一个参数化的空心微针阵列。然后使用 Magic's RP 13 软件设计支撑结构，为微针的构建提供基础。接下来，使用 refactory RP 软件控制 fabrication（制造）过程。上传关联的支撑结构文件和微针阵列文件。然后选择需要制备的微针阵列数量，并确定微针装置在快速原型制造系统构建板上的放置位置。选择100毫瓦的紫外模式，并执行校准程序。确认能量偏差在正负2毫瓦范围内。微针阵列制备完成后，将微针阵列从基板上取下。用异丙醇显影15分钟。然后用压缩空气干燥阵列，以确保完全聚合。在室温下固化微针50秒。通过光学显微镜检查微针。验证每个完全制备的微针针孔均为中空且无堵塞。暴露扁平柔性电缆中可单独寻址的连接铜线。创建激光烧蚀图案，并将这些图案发送至激光系统。现在，将电缆放置于夹具中，通过抬升方式精确定位在激光烧蚀板上，于柔性电缆的绝缘部分制备直径为 500 微米的孔洞。使用喷射丙酮的喷枪清洗经改造的扁平柔性电缆，压力为 40 PSI，随后在光学显微镜下用异丙醇和去离子水冲洗。确认暴露的铜条上无任何绝缘膜残留。下一步是为碳糊制作固定腔室，使用之前电极条所用图案的ABL melanox胶带，该胶带含有单面丙烯酸压敏胶。现在将胶带对准置于烧蚀后的电极条上方。按压胶带以确保连接牢固。然后烧蚀双面Melin X胶带，并对齐胶带，使微针阵列与碳糊电极阵列之间实现键合。将10毫克葡萄糖氧化酶和2.2毫克聚乙烯胺混合，制成均匀的葡萄糖敏感型碳糊。然后加入60毫克碳载铑粉末，并混入40毫克矿物油。将糊状物于4°C保存，用于pH敏感型碳糊电极。混合30%矿物油和70%石墨粉末。使用一小片塑料作为抹刀，将糊状物压入电极腔体，直至形成光滑表面。用第二个干净的称量皿重复操作，直至去除多余的糊状物。然后用去离子水冲洗。接着，在压实的糊状电极上放置一滴20 µL新配制的快蓝溶液。经过30分钟的孵育后，用去离子水冲洗乳酸敏感型碳糊。将2.5毫克负载在碳粉上的铑与2.5毫克乳酸氧化酶混合。交替进行超声处理5分钟和涡旋振荡5分钟，共重复5个循环。继续将糊状物填充到电极腔中。最后，用去离子水冲洗以检测乳酸。测量传感器的计时和参数响应，并在15秒后记录电流以检测葡萄糖。测量传感器对乳酸和葡萄糖的计时安培响应，依次建立乳酸和葡萄糖传感器的校准曲线。在进行计时安培和参数测量前，加入相应的分析物。或者，可在搅拌条件下进行固定电位的计时安培和参数测量。每次添加分析物之间需留出足够时间，以确保电流稳定。为监测pH值，需进行循环伏安扫描，并记录氧化峰电位的位置，通过测量一系列已知pH值条件下记录的循环伏安图中氧化峰电位的位置，绘制pH校准曲线。构建基于多重微针的传感器的过程始于在SolidWorks中设计微针阵列，随后在magic's RP 13中设计支撑结构。这些扫描电子显微镜图像展示了一个微针阵列以及该阵列中的单个微针。基于微针的传感器的检测平台是通过激光烧蚀技术在扁平柔性电缆上制备电极阵列，随后将碳糊填充至这些阵列中而形成的。文中同时展示了葡萄糖和乳酸的电催化反应，以及检测所用的操作参数。这种典型的乳酸敏感糊剂校准采用15秒的计时电流扫描，显示每次电流的增加对应于添加2毫摩尔的乳酸。在监测葡萄糖校准时，采用单次连续的计时电流扫描，通过向溶液中加入不同浓度的葡萄糖，然后等待电流稳定来完成传感器的校准。该示意图展示了酸度检测的电催化反应过程，其中在pH敏感微针上，于0.1摩尔磷酸盐缓冲液中测得的循环伏安图显示了四种不同溶液的结果，其pH值从5到8，以1个单位递增。由于氧化峰电位随pH值升高而发生偏移，该现象可作为pH值的指示依据。一旦掌握，该装置可在两天内正确制备完成。在进行此操作时，需注意不同类型的碳材料若相互混合，将无法保持其原有的选择性。通过该方法，可向电极阵列中添加其他选择性碳电极，以监测皮肤中的其他分析物。该装置的开发可为可穿戴传感器领域的研究人员进行医学诊断并探索基础生物医学科学问题铺平道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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