Name: 转换到一个点阵仪XMAP含量，使用多重抗体筛查方法的捕获ELISA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 学习将ELISA检测转换为Luminex xMAP平台，通过多重抗体筛选方法同时评估多种抗体对，用于TNF Alpha细胞因子检测。该技术可提高灵敏度、动态范围并降低成本。

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本工作由 Luminex Corporation 资助。

<ol><li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li>
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<li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li>
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<li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li>
<li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA%3A+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li>
<li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li>
<li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li>
</ol>

本工作在 Luminex Corporation 完成，所用设备由 Luminex Corporation 生产。
R&amp;D Systems 与 EMD Millipore 是 Luminex Corporation 的战略合作伙伴，获授权开发和商业化基于多重 xMAP 技术的检测方法。

将ELISA检测转换为Luminex xMAP平台可以非常简单，只需将典型ELISA试剂盒中的链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）替换为链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE），并进行性能优化即可。对于希望从头构建xMAP免疫检测方法的研究者，可通过一个简洁的实验方案实现，该方案还能快速、多重地评估抗体配对效果。xMAP检测所用试剂可通过xMAP抗体偶联试剂盒，将指定的捕获抗体偶联至MagPlex低浓度微球上而轻松制备。使用低浓度微球可在保持与高浓度微球相同检测性能的同时，降低检测开发成本。制备偶联型MagPlex微球所需时间约为3小时，远快于ELISA板孔包被所需的22至24小时，以及后续对包被孔的处理步骤。在检测灵敏度（&lt;4 pg/mL 对比 &gt;31 pg/mL）和动态范围（&lt;4 pg/mL 至 &gt;8000 pg/mL 对比 16 pg/mL 至 1000 pg/mL）方面，xMAP检测的性能也优于ELISA。酶标仪的光密度（OD）检测范围有限，通常为3或4个OD单位，这限制了检测方法动态范围的上限。
毫无疑问，并非所有抗体都适用于ELISA实验体系，也并非所有在ELISA中表现良好的抗体都能直接适用于xMAP检测体系。然而，由于xMAP检测具有多重检测能力（即可以同时进行），因此可同时评估多种捕获抗体与检测抗体的组合，以筛选出最适合用于检测的最佳配对。与只能逐对评估的ELISA开发流程相比，该方法可显著节省时间和试剂。若两种或多种抗体对的表现相当，则可进一步考虑检测的其他参数来确定其适用性（例如可获得性、成本等）。
除了 xMAP 检测在检测性能和灵活性方面有所提升外，该方法还能显著节约成本。包被一块 ELISA 板单个孔所需的推荐抗体用量为 400 ng，而用于 xMAP 检测一个孔的微球所需抗体用量仅约为 7.5 ng。因此，用于一个 ELISA 孔的抗体用量若用于 xMAP 检测，可提供超过 50 次的检测结果。对于涉及珍贵样本的应用，xMAP 同样具有显著优势。ELISA 推荐的样本体积为 100 μL，而 xMAP 检测所需的样本体积可减半，甚至更少。
总之，将ELISA检测转换为Luminex xMAP平台操作简便、高效且节省成本，同时可获得动态范围更宽、灵敏度更高的检测方法。

<table><tbody><tr><td>人 TNF-&amp;alpha;TNFSF1A DuoSet ELISA 试剂盒</td><td>R&D Systems</td><td>DY210</td><td>包含单克隆抗体、生物素偶联的多克隆抗体以及重组TNF-&amp;alpha; 蛋白标准品</td></tr><tr><td>抗肿瘤坏死因子单克隆抗体&amp;alpha;</td><td>Abcam</td><td>Ab18696</td><td>捕获抗体，克隆 CH8820</td></tr><tr><td>抗肿瘤坏死因子单克隆抗体&amp;alpha;</td><td>Abcam</td><td>Ab16166</td><td>生物素偶联检测抗体，克隆 AS1</td></tr><tr><td>TNF-α 蛋白</td><td>Abcam</td><td>Ab9642</td><td>重组 TNF-&amp;alpha; 蛋白标准品</td></tr><tr><td>抗肿瘤坏死因子单克隆抗体&amp;alpha;</td><td>Novus</td><td>NBP1-50115</td><td>捕获抗体，克隆 4H31</td></tr><tr><td>抗TNF单克隆抗体&amp;alpha;</td><td>Novus</td><td>NB100-78162</td><td>生物素偶联检测抗体，克隆 MAb11</td></tr><tr><td>TNF-α 蛋白</td><td>Novus</td><td>NBC1-18460</td><td>重组 TNF-&amp;alpha; 蛋白标准品</td></tr><tr><td>抗肿瘤坏死因子单克隆抗体&amp;alpha;</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1141</td><td>捕获抗体，克隆 3C7.2</td></tr><tr><td>多克隆抗体抗TNF-&amp;alpha;</td><td>EMD Millipore</td><td>654250</td><td>兔多克隆检测抗体</td></tr><tr><td>链霉亲和素-藻红蛋白&amp;#8211;rythrin</td><td>苔藓</td><td>SAPE-001</td><td>Luminex xMAP 检测用荧光报告试剂</td></tr><tr><td>MAGPIX 配 xPONENT 软件</td><td>Luminex Corporation</td><td>MAGPIX-XPONENT</td><td>Luminex 仪器</td></tr><tr><td>xMAP 抗体偶联（AbC）试剂盒 </td><td>Luminex Corporation</td><td>40-50016</td><td>包含 EDC 试剂、Sulfo-NHS 试剂、活化缓冲液、洗涤缓冲液、1.5 mL 反应管和一次性移液管</td></tr><tr><td>MagPlex 微球，低浓度</td><td>Luminex Corporation</td><td>MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID</td><td>低浓度磁珠（@ 2.5 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 珠/毫升</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PI-21335</td><td>未修饰检测抗体生物素化试剂盒</td></tr><tr><td>Tecan Infinite F200 读板仪</td><td>Tecan</td><td></td><td>ELISA 酶标仪</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3688</td><td>1% PBS-BSA，检测缓冲液</td></tr><tr><td>一品脱小型超声波清洗机，115 VAC</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-08849-00</td><td>产生55 kHz的有效工作频率</td></tr><tr><td>磁力管分离器</td><td>Luminex Corporation</td><td>CN-0288-01</td><td>用于偶联洗涤步骤中的单个1.5 mL离心管磁分离</td></tr><tr><td>磁力板分离器</td><td>Luminex Corporation</td><td>CN-0269-01</td><td>用于检测洗涤步骤中96孔板的磁分离</td></tr></tbody></table>

将捕获elisa转换为使用多重抗体筛选方法的luminex xmap检测

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

酶联免疫吸附测定法（ELISA）长期以来一直是生命科学研究和临床诊断中检测生物样本中目标分析物的主要工具。然而，ELISA存在一些局限性。该方法通常在96孔微孔板中进行，每个孔需包被捕获抗体，因而需要相对大量的样本才能捕获目标抗原。孔的表面积较大，且捕获抗体以疏水方式结合，可能导致非特异性结合并增加背景信号。此外，大多数ELISA依赖酶介导的信号放大以达到可接受的灵敏度，但这种放大作用并不总是线性的，因此可能使结果产生偏差。
在过去的15年中，出现了一项新技术，它兼具ELISA的优点，同时实现了更高的通量、更强的灵活性、更少的样本用量和更低的成本，且实验流程相似1, 2。Luminex xMAP技术是一种基于微球（微珠）阵列的平台，可支持单重和多重检测，适用于蛋白质和核酸分析3-5。与ELISA相比，该技术将捕获抗体共价固定在更小的表面积上，因而所需捕获抗体更少，样本用量也更小，同时显著降低了非特异性结合。在处理脑脊液、滑膜液等样本量有限的样本时，较小的样本用量尤为重要6。通过检测的多重化，可进一步减少对样本量的需求，从而利用单一样本获得多个检测结果。
Luminex 近期推出了多项改进，包括：新型 MAGPIX 系统，这是一款体积更小、成本更低、更易于使用的分析仪；低浓度磁性 MagPlex 微球，无需昂贵的滤板，且其工作浓度更适用于检测方法开发和低通量应用；以及 xMAP 抗体偶联（AbC）试剂盒，该试剂盒包含将微球与目标捕获抗体偶联所需的方案、试剂和耗材。（详见材料部分中关于试剂盒内容的详细列表。）
在本实验中，我们将一种预优化的TNF-α细胞因子ELISA检测方法转换至xMAP平台，并比较两种方法的性能7-11。TNF-α是一种生物标志物，用于评估自身免疫性疾病患者体内的炎症反应。
首先，将四种候选捕获抗体分别偶联到四种不同的微球集合或区域。当这四组微球混合在一起时，可同时使用四种不同的检测抗体对全部四种候选抗体进行测试，从而确定最佳的抗体配对组合，节省试剂、样本和时间。随后，根据筛选出的两组最优抗体配对构建两个 xMAP 检测体系，并将其性能与原始 ELISA 检测在信号强度、动态范围和灵敏度方面进行比较。

酶联免疫吸附试验（ELISA）可轻松转化为Luminex xMAP检测，通过多重检测的优势，可同时筛选多种抗体以确定最佳抗体组合，从而提高检测灵敏度和动态范围，同时降低检测成本。

将捕获ELISA转换为使用多重抗体筛选方法的Luminex xMAP检测

酶联免疫吸附测定（ELISA）长期以来一直是生命科学和临床研究中用于检测生物样本中目标分析物的主要工具……

以下实验的总体目标是将一种预先优化的用于TNF Alpha细胞因子的Eliza检测方法转换至Xap平台，同时评估替代的抗体配对方案。该目标通过将ELIZA试剂盒中的捕获抗体与另外三种候选捕获抗体分别偶联至四种不同的微球或微珠集合来实现，这些微球集合混合后可同时测试四种候选抗体与四种独立的检测抗体的组合，从而确定最优的抗体配对。接下来使用两对最优的抗体组合构建两个Xap检测方法。然后从信号强度、动态范围和灵敏度等方面将这些检测方法的性能与原始EISA检测方法进行比较。结果表明，在相同条件下，相似的抗体可能表现出显著不同的性能，并且利用Luminex Xap检测方法可同时筛选多种抗体，揭示该方法相较于EISA具有更高的灵敏度和更宽的动态范围。该技术相较于现有方法（如酶联免疫吸附试验）的主要优势在于，基于xap的免疫测定法可使研究人员同时检测多个靶标，或如本例所示，同时检测多种抗体，以确定表现最佳的抗体。该实验操作将由Luminex公司的副科学家Erica Lopez完成。按照书面实验方案所述，首先选择并制备四种针对人TNF alpha的捕获抗体和四种检测抗体。同时，准备一种针对捕获抗体宿主物种的确认抗体。将抗体偶联试剂盒中的试剂恢复至室温。用选定的偶联反应微球区域编号标记四个反应管。将四瓶磁性plex微球的内容物分别转移至已标记的四个反应管中。每种微球分别用500 µL活化缓冲液洗涤两次，并按照抗体偶联试剂盒说明书，使用磺基ONHS和EDC溶液对每种微球进行活化。在旋转仪上孵育20分钟后，使用已活化的磁珠，用500微升活化缓冲液重复之前的洗涤步骤，共进行三次。每次洗涤时，配制四份独立的500微升溶液，每份溶液中含有7.5微克捕获抗体的灭活缓冲液。将这四种捕获抗体溶液分别加入对应的反应管中。立即涡旋振荡每根试管，并在旋转仪上孵育两小时。使用抗体偶联试剂盒中提供的洗涤缓冲液，对已偶联的磁珠进行洗涤步骤，共重复三次，每次使用500 µL洗涤缓冲液。最后一次洗涤步骤后，向每个反应管中加入 500 微升洗涤缓冲液，使最终储存浓度为每毫升 500 万个抗体偶联磁珠，涡旋混匀，然后对反应管进行超声处理以分散磁珠。使用细胞计数器或血细胞计数板计数偶联反应后回收的磁珠数量。偶联反应的回收率通常超过 90%。通过制备每组偶联磁珠储备液的测试溶液来确认偶联反应是否成功，测试液中磁珠终浓度为每微升 100 个，使用检测缓冲液稀释，并制备 FICO 红细胞标记的抗物种抗体稀释液。在测定缓冲液中加入每毫升4微克的IgG确认抗体，将每种待测溶液各50微升分装至圆底96孔板的4个孔中，共16个孔。然后向其中8个孔各加入50微升测定缓冲液以检测背景值，向其余8个孔各加入50微升稀释后的确认抗体。使用多通道移液器轻轻吹打数次，使反应液充分混匀。用封板膜覆盖，于室温下在平板振荡器上孵育30分钟。将平板置于磁力板分离器上1至2分钟，使磁珠脱离溶液。然后将平板倒置于废液容器上方，用力倒掉液体。每次加入 100 µL 检测缓冲液，重复洗涤每孔两次，并以类似方式从板中移除 SANE。使用磁力板分离器，用多通道移液器轻轻吹打上下五次，将磁珠重悬于 100 µL 检测缓冲液中。在 Luminex xMAP 仪器（如 Magpix 仪器）上进行分析。该反应的荧光信号强度与磁珠表面的蛋白量成正比，可快速评估偶联到磁珠上的相对蛋白量。为了确定 xap 检测中最有效的抗体配对，通过将每种磁珠各取 10 微升加入至 0.96 毫升检测缓冲液中，制备包含全部四种磁珠的初始混合液。通过将每种检测抗体用检测缓冲液稀释至每毫升含一微克，制备检测抗体溶液。同时也是一种检测缓冲液。将r和d系统TNFα蛋白标准品配制为2000皮克/毫升，并将链霉亲和素R-藻红蛋白稀释至8微克/毫升。在CoStar圆底96孔板中，向筛选检测的16个孔每孔加入50微升抗体偶联微球混合液。然后向16个孔中的8个孔加入50 µL检测缓冲液，以测定背景值。接着将50 µL TNF-α标准品加入其余8个孔，以测定反应信号。将板置于酶标板振荡器上，室温避光振荡孵育1小时。然后向四个孔中分别加入 50 µL 的四种检测抗体，其中两个为背景孔，另两个为反应孔。向所有孔中加入 50 µL SAPE 试剂后，在相同条件下孵育 30 分钟。随后在相同条件下再次孵育 15 分钟。将平板置于磁力板分离器上静置一分钟。然后将平板在废液容器上方迅速倒置，以去除液体。向16个孔中的每一个孔加入100 µL的检测缓冲液。然后使用磁力分离法从磁珠中去除液体。接着，向16个孔中的每一个孔加入100 µL检测缓冲液。参照仪器用户手册操作，使用Luminex mag picks仪器读取酶标板。选择一对能够满足所需信号强度的抗体。在选定最佳捕获抗体后，用10毫升检测缓冲液将100微升该抗体偶联的磁珠储备液稀释。将50微升稀释后的磁珠加入两块CorStar圆底96孔板的78个孔中。每块板将用于评估不同检测抗体的性能。接下来，使用r和d系统制备12点标准曲线，起始浓度为8,000 皮克/毫升，终止浓度为4 皮克/毫升。将每种稀释液分别取50微升加入6个复孔中，并在每个板上设置6个孔，每孔加入50微升检测缓冲液作为背景对照，每个板共78个孔。将板在室温下避光孵育1小时，同时在检测板振荡器上振荡。然后向第一块板的全部78个孔中各加入50微升第一检测抗体。对第二块板上的第二种检测抗体重复上述步骤。在相同条件下孵育30分钟。然后向每块板的所有孔中加入50 µL SAPE试剂。将两块板在避光条件下振荡15分钟后，将板置于磁力板分离器上1分钟。将板倒置在废液容器上方，用力甩去液体。随后，在移除磁珠上的液体之前，向每块板的78个孔中各加入100 µL的检测缓冲液。向每块板上78个孔中的珠子各加入100 µL检测缓冲液后，参照用户手册中的操作说明，使用Mag Picks仪器分析各板。根据R&D Systems提供的说明书操作人TNF-α（TNFSF1A）DUOSET ELISA试剂盒。检测R&D试剂盒中提供的标准品所产生的反应。用其他供应商的 r 和 d 系统捕获抗体与检测抗体，重复 ELI a 测定三次。为简化操作，按供应商配对抗体，并根据 EISA 格式要求，将每对抗体分别与三种 TNF Alpha 蛋白标准品进行评估。Luminex Xap 测定采用多重检测方式，通过将四组 TNF alpha 抗体偶联至 Mag PLX 微球，混合后同时评估全部四种捕获抗体；每种生物素标记的检测抗体分别与四种捕获抗体单独反应，从而可同时确定一种检测抗体与四种捕获抗体之间的相互作用。结果表明，r 和 d systems DUO 试剂盒中的抗体配对效果最佳，在 XAP 检测中产生的反应信号达到 6,183 中位荧光强度（MFI）单位。同时观察到，当 Millipore 和 ABAM 的检测抗体与 RD systems 的捕获抗体配对时，在 XAP 检测中也能产生较为理想的信号；而 Millipore、ACAM 和 Novus 的捕获抗体在 XAP 检测中表现较差。随后采用 r 和 d systems DUO 试剂盒的实验方案，以 EISA 形式对这四对抗体进行了比较。所有抗体对均采用r和d系统方案，因为该方案反映了当前广泛使用的典型EIA方案，并且类似于xap技术所使用的方案。EISA检测结果显示，来自r和d系统的抗体对再次给出了最佳结果。Acam的抗体对未产生任何反应，而Millipore和Novas的抗体对仅产生微弱反应，以此评估抗体反应性可能存在的差异。使用标准品，采用来自三家不同供应商的三种不同重组TNFα蛋白标准品，对全部四对抗体对进行了检测。数据显示，三家供应商提供的重组TNFα蛋白标准品结果相当。来自r和d系统的TNFα蛋白被用于ELSA和XAP检测中生成标准曲线。尽管ELISA检测使用了R&D Systems的抗体配对，但Xap检测采用了R&D Systems的捕获抗体，以及来自R&D Systems或Millipore的检测抗体。R&D Systems的TNF-α蛋白被稀释，仅产生从8,000至4皮克/毫升的浓度梯度。如图所示，R&D Systems的抗体配对在Xap检测中产生了预期结果，其信号响应超过20,000 MFI。当使用Millipore的检测抗体替代R&D Systems的检测抗体用于Xap检测时，其检测信号约为使用R&D Systems检测抗体时的30%。本图中的绿色线条代表ELA的标准曲线，其制造商推荐的TNF-α检测范围为每毫升16至1000皮克。由于分光光度计的限制，无法扩大ELISA检测的检测范围。此外，当以对数尺度作图时，两种方法的动态范围和灵敏度能够更清晰地展现出来。EISA反应与xap检测方法的响应斜率之间存在明显差异，进一步表明在高浓度和低浓度条件下，EL iza检测TNF alpha的能力均更为受限。两种功能性TNF alpha xap检测方法的检测限（LOD）是通过确定可观察到的响应信号高于背景值且超过六次重复实验背景标准差（SD）三倍时的最低TNF alpha浓度来估算的。在此可以观察到，使用R&D系统配对时，最低浓度为3.91皮克/毫升的TNFα产生了66 MFI的信号响应，该值高于背景信号加3倍标准差的阈值，符合此标准。当使用Millipore检测抗体与R&D系统捕获抗体配对时，检测下限低于7.81皮克/毫升。在此情况下，第二低浓度的 TNF alpha 产生的响应值比最低浓度 TNF alpha 的响应值高出至少 17 MFI，且超过其标准差的三倍，达到了可接受的响应水平。类似地，r 和 d 系统 duo set Eliza 的检测下限估计为每毫升 63 至 31 皮克。按照此流程，还可进行其他步骤，如测试不同的样本基质或报告抗体的不同浓度，以进一步优化 xap 检测。

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鉴于迫切需要对1型糖尿病、乳糜泻以及2019冠状病毒病进行筛查，我们开发了一种高通量6重电化学发光检测法，可同时检测全部四种胰岛自身抗体、组织转谷氨酰胺酶自身抗体以及针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2的受体结合域抗体。...

一种用于1型糖尿病、乳糜泻和新冠肺炎的高通量多重筛查方法

采用三通道双报告荧光流式分析系统，建立了一种基于微球的多重免疫测定方法，可同时检测血清样本中针对多种引起欧洲和北美莱姆病的Borrelia物种抗原所产生的IgG和IgM抗体。...

多重血清学检测中不同抗体类别同时检测

学习将ELISA检测转换为Luminex xMAP平台，通过多重抗体筛选方法同时评估多种抗体对，用于TNF Alpha细胞因子检测。该技术可提高灵敏度、动态范围并降低成本。

将捕获ELISA转换为使用多重抗体筛选方法的Luminex xMAP检测

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