转换到一个点阵仪XMAP含量，使用多重抗体筛查方法的捕获ELISA
2012年7月6日
ELISA方法可以很容易地转换到一个点阵仪XMAP法，通过复用，几种抗体的好处，可以同时进行筛选，以确定最佳的抗体对，导致更高的灵敏度和动态范围，同时降低检测成本。
以下实验的总体目标是将 TNF α 细胞因子的预优化 Eliza 测定转换为 Xap 平台，同时评估替代抗体对。这是通过将 ELIZA 试剂盒中的捕获抗体与其他三种候选捕获抗体混合在一起时与四种不同的微球或微珠组偶联来实现的。这四组抗体允许使用四种单独的检测抗体同时测试所有四种候选抗体，以确定最佳抗体对。
接下来，用两个最佳抗体对构建两个 Xap 测定。然后将分析的性能与原始 EISA 分析在信号强度、动态范围和灵敏度方面的性能进行比较。结果表明，在相同条件下，相似抗体的性能可能非常不同，并且使用 Luminex Xap 检测可以同时筛选多种抗体，这表明与 EISA 相比，该检测具有更高的灵敏度和动态范围。
与 EIS A 等现有方法相比，该技术的主要优点是，基于 xap 的免疫测定允许研究人员测试多个靶标，或者在这种情况下，同时测试多个抗体。确定证明的最佳抗体。该程序将由 Luminex Corporation 的副科学家 Erica Lopez 负责。
如书面方案中所述，从选择和制备四种捕获抗体和四种对人 TNF α 具有特异性的检测抗体开始该方案。此外，准备一种对捕获抗体的宿主物种具有特异性的确认抗体。将抗体偶联试剂盒中的试剂置于室温。
用为偶联反应选择的微珠区域编号标记四个反应管。将 4 小瓶 mag plex 微球的内容物转移到 4 个标记的反应管中。在 500 μL 活化缓冲液中洗涤每个微珠组两次，并按照抗体偶联试剂盒中的说明用 sulf ONHS 和 EDC 溶液激活每个微珠组。
用户手册 在旋转器上孵育 20 分钟后，用 500 μL 活化缓冲液对现在激活的磁珠重复之前的洗涤步骤，总共 3 次。对于每次洗涤，准备四个单独的 500 μL 溶液。每个含有 7.5 μg 捕获抗体灭活缓冲液。
将这四种捕获抗体溶液添加到各自的反应管中。立即涡旋每根试管，并在旋转器上孵育 2 小时。使用抗体偶联试剂盒中包含的 500 μL 洗涤缓冲液，用现在对偶的珠子重复洗涤步骤总共 3 次。
在最后的洗涤步骤后，向每个反应管中加入 500 μL 洗涤缓冲液，以提供每毫升涡旋 500 万个抗体偶联微珠的最终储备浓度，然后对反应管进行超声处理以分散微珠。使用细胞计数器或血细胞计数器计算偶联反应后回收的珠子数量。偶联反应的回收率通常超过 90%通过在检测缓冲液中制备每组偶联珠原液的测试溶液（终浓度为 100 个珠子/微升）来确认偶联反应成功，制备 FICO erything 标记的抗物质的稀释液。
在检测缓冲液中以每毫升 4 μg 的浓度将 50 μL 每种测试溶液分装到圆底 96 孔板的四个孔中，总共 16 个孔。然后将 50 μL 检测缓冲液加入 8 个孔中以测量背景，并将 50 μL 稀释的确认抗体加入其余 8 个孔中。用多通道移液器上下吹打数次，轻轻混合反应。
盖上板，在室温下在平板摇床上孵育 30 分钟。将板放在磁板分离器上 1 到 2 分钟，以将磁珠从溶液中吸出。然后，在废物容器上方的分离器上用力倒置板以去除液体。
通过添加 100 μL 检测缓冲液并以类似的方式从板中去除 SANE，将每个孔洗涤两次。使用磁板分离器，用多通道移液器轻轻上下吹打 5 次，将磁珠重悬于 100 μL 检测缓冲液中。在 luminex xap 仪器（如 magix 仪器）上进行分析。
该反应的荧光信号强度与磁珠表面的蛋白质量成正比，从而可以快速评估偶联到磁珠上的蛋白质的相对量。为了确定 xap 检测中最有效的抗体对，通过在 0.96 毫升检测缓冲液中加入 10 μL 每种微珠来制备所有四个微珠组的初始混合物。通过在检测缓冲液中将每种抗体稀释至 1 μg/mL 来制备检测抗体溶液。
也是一种检测缓冲液。以 2000 pg/mL 的浓度制备 R and d Systems TNF α 蛋白标准品，并将链霉亲和素 R FICO eryn 稀释至每毫升 8 μg。将 50 μL 抗体偶联珠混合物添加到 CoStar 圆底 96 孔板的 16 个孔中，用于筛选测定。
然后将 50 微升测定缓冲液添加到 16 个孔中的 8 个孔中以测量背景。接下来，将 50 微升 TNF α 标准品移液到其他 8 个孔中以测量响应。在室温下避光孵育 1 小时，同时在测定板振荡器上摇动。
然后将四种检测抗体中的每种 50 μL 添加到四个孔中，其中两个是背景孔，两个是反应孔。向所有孔中加入 50 μL SAPE 试剂后，在相同条件下孵育 30 分钟。在相同条件下再次孵育 15 分钟。
将板放在磁板分离器上 1 分钟。然后，在废物容器上方的分离器上用力倒置板以去除液体。将 100 微升测定缓冲液移液到 16 个孔中的每一个孔中。
然后使用磁分离从珠子中去除液体。接下来，向 16 个孔中的每个孔中加入 100 微升测定缓冲液。使用 Luminex 磁镐仪器阅读板，参考用户手册以正确作。
选择符合所需信号强度的抗体对。选择最佳捕获抗体后，用检测缓冲液将 100 μL 抗体偶联的节拍原液稀释至 10 mL。将 50 微升稀释的珠子添加到两个 CoStar 圆底 96 孔板的 78 个孔中。
每个板将用于评估不同检测抗体的性能。接下来，准备一条 12 点标准曲线，从 8， 000 皮克/毫升开始，到 4 皮克/毫升结束。随着研发系统的发展。
TNF Alpha 标准品向每个板中加入 6 个 50 μL 的稀释液重复，并添加 6 个孔，每个孔加入 50 μL 检测缓冲液作为背景，每个板总共 78 个孔。将板在室温下避光孵育 1 小时，同时在检测板振荡器上摇动。然后将 50 μL 第一检测抗体添加到第一板的所有 78 个孔中。
对第二块板上的第二种检测抗体重复上述步骤。在相同条件下孵育板 30 分钟。然后将 50 微升 SAPE 试剂添加到每个板的所有孔中。
避光摇动两块板 15 分钟后，将板放在磁板分离器上 1 分钟。在废物容器上方的分离器上用力倒置板以去除液体。接下来，在从磁珠中取出液体之前，将 100 微升检测缓冲液移液到板上的 78 个孔中。
在板上 78 个孔中的每一个孔中向磁珠中加入 100 微升检测缓冲液后，参考用户手册分析磁棒挑选仪器上的板以正确作。按照研发系统随附的说明，人 TNF Alpha T NF SF one a DUO set ELI A 试剂盒。测量 r 和 d 试剂盒随附的标准品生成的响应。
再重复 ELI a 检测 3 次，用其他供应商的抗体替换 R 和 D Systems 捕获和检测抗体。为简单起见，按供应商将抗体配对，根据 EISA 格式的要求，将每对抗体与三种 TNF α 蛋白标准品中的每一种独立评估。Luminex Xap 检测作为多重进行，通过将四组 TNF α 抗体与 Mag PLX 微球偶联来评估所有四种捕获抗体作为混合物，捕获抗体与四种生物素化检测抗体中的每一种分别进行评估，以便可以同时确定一种检测抗体与四种捕获抗体中的每一种的相互作用。
结果表明，来自 r 和 d 系统 DUO 组的抗体对表现最佳，在 6， 183 个中位荧光强度或 MFI 单位处产生反应。还观察到，当与 RD 系统捕获抗体联合使用时，来自 Millipore 和 ABAM 的检测抗体在 XAP 检测中提供了合理的响应，来自 Millipore、ACAM 和 Novus 的捕获抗体在 XAP 检测中产生了不太理想的反应。使用 r 和 d 系统 DUO 套装方案以 EISA 格式比较四种抗体对。
所有抗体对都使用了 R 和 D 系统方案，因为它反映了当今广泛使用的典型 EIA 方案，并且类似于 xap 技术使用的方案。EISA 测试表明，来自 r 和 d 系统的抗体对再次给出了最佳结果。来自 Acam 的抗体对未产生反应，而来自 Millipore 和 Novas 的抗体对产生适度反应，以评估抗体反应性的任何变化。
使用该标准品，所有四种抗体对都使用来自三个不同供应商的三种不同重组 TNF α 蛋白标准品进行了测试。数据显示，来自三家供应商的重组 TNF α 蛋白标准品给出了相同的结果。使用 r 和 d 系统的 TNF α 蛋白通过 ELSA 和 XAP 分析生成标准曲线。
ELI A 检测是使用 r 和 d 系统抗体对进行的，而 xap 检测则使用 r 和 d 系统的捕获抗体以及来自 r 和 d 系统或 Millipore 的检测抗体。将来自 r 和 d 系统的 TNF α 蛋白稀释以产生浓度范围为 8， 000 至 4 pg/mL。来自 r 和 d 系统的抗体对在 Xap 测定中产生了预期结果，响应大于 20， 000 MFI，如图所示。
当 Millipore 的检测抗体与 Xap 检测代替 R 和 d Systems 检测抗体一起使用时，反应约为使用 RD 系统的检测抗体获得的反应的 30%。此图表上的绿线代表 ELA 的标准曲线，其制造商推荐的 TNF α 范围为 16 至 1000 pg/mL。由于分光光度计的限制，无法增加 Eliza 测定的范围。
此外，当以对数刻度绘制时，两种方法的动态范围和灵敏度可以更好地说明。可以看到 EISA 反应的斜率与 xap 测定的反应之间的明显区别，并进一步表明在较高和较低浓度下，EL iza 检测 TNF α 的能力更加有限。两种功能性 TNF α xap 检测的检测限或 LOD 是通过确定观察到的反应水平大于背景的最低 TNF α 浓度加上其标准偏差或 SD 的三倍来近似的 6 次重复。
在这里可以观察到，当使用 r 和 d 系统对时，最低 TNF α 浓度为 3.91 pg/mL，产生了 66 MFI 的响应，这大于背景加上 3 个 SD 会议的响应。此标准。当 millipore 检测抗体与 r 和 d Systems 捕获抗体一起使用时，检测限小于 7.81 pg/mL。
在这种情况下，在可接受响应 17 MFI 中产生的第二低 TNF α 浓度大于最低 TNF α 浓度的响应加上其标准偏差的三倍。同样，r 和 d 系统二组 Eliza 的检测限估计在 63 至 31 pg/mL 之间。在此程序之后，可以执行其他步骤，如测试、各种样品基质或报告基因中抗体的浓度，以进一步优化 xap 检测。
概览
本研究展示了将预优化的TNF Alpha细胞因子ELISA检测方法转换到Luminex xMAP平台。通过同时评估多对抗体，该方法在提高灵敏度和动态范围的同时降低了成本。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫检测
- 细胞因子检测
- 多重技术
背景
- ELISA检测方法广泛用于蛋白质检测。
- Luminex xMAP技术允许多重检测，可以同时测试多个目标。
- 识别最佳抗体对可以提高检测方法的性能。
- 在研究环境中，成本效益至关重要。
研究目的
- 将ELISA检测方法转换到Luminex xMAP平台。
- 评估用于TNF Alpha检测的替代抗体对。
- 比较新检测方法与原始ELISA的性能。
使用的方法
- 准备特定于TNF Alpha的捕获和检测抗体。
- 将抗体与微球偶联以实现多重检测。
- 在单一检测中测试多对抗体。
- 对信号强度、动态范围和灵敏度进行比较分析。
主要结果
- 在相同条件下，相似的抗体表现不同。
- 多重检测允许同时筛选多个抗体。
- Luminex xMAP检测方法比ELISA展示了更高的灵敏度和动态范围。
- 为TNF Alpha检测确定了最佳抗体对。
结论
- Luminex xMAP平台是传统ELISA检测方法的可行替代方案。
- 多重检测可以显著提高检测方法的效率和有效性。
- 未来的研究可以利用这种方法在细胞因子检测中应用更广泛。
常见问题
Executive Industry Relevance
Converting ELISA to Luminex xMAP enables higher throughput, reduced sample volume, and improved sensitivity for cytokine biomarker detection in drug discovery. This multiplex-capable approach supports target validation and assay development by allowing simultaneous screening of antibody pairs, reducing reagent consumption and accelerating lead identification. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts for TNF-alpha, a key inflammatory biomarker in autoimmune disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by screening multiple capture antibody candidates simultaneously to identify optimal pairs for TNF-alpha detection.
- Operational Value: Reduces sample and reagent requirements through microsphere-based coupling, preserving limited biological samples for downstream analysis.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by comparing antibody performance under identical conditions, revealing functional differences not apparent in ELISA.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative median fluorescence intensity (MFI) readouts that enable direct comparison of signal strength and dynamic range across antibody pairs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through coupled bead stocks with >90% recovery, ensuring reproducible immobilization of capture antibodies.
- Scientific Value: Increases sensitivity and dynamic range versus ELISA, demonstrated by lower limits of detection (LOD) for TNF-alpha (3.91 pg/mL vs. 31–63 pg/mL in ELISA).
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system compatibility by detecting TNF-alpha in inflammatory contexts, supporting mechanistic de-risking in autoimmune disease models.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical work through standardized antibody coupling and detection protocols adaptable to various sample matrices.
- Scientific Value: Supports predictive confidence in biomarker alignment by demonstrating equivalent TNF-alpha protein standard responses across vendors.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by positioning antibody screening prior to lead identification, where multiplexed xMAP assays inform selection of high-performing pairs for downstream ELISA or functional validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous evaluation of antibody specificity and affinity for TNF-alpha.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized bead coupling, wash, and detection steps that yield quantitative, multiplexed outputs.
- Analytics: Provides MFI-based measurements and LOD calculations that allow teams to compare antibody pairs and define sensitivity thresholds.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of TNF-alpha, a translational biomarker in autoimmune disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable antibody screening platform applicable to other cytokines or biomarkers beyond TNF-alpha.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through improved sensitivity and dynamic range, reducing false negatives in low-abundance cytokine detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized antibody coupling kit and magnetic separation workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by multiplexing antibody screening, reducing runs, sample use, and reagent costs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions by identifying high-performing antibody pairs early, minimizing late-stage assay failure risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay design, antibody coupling, and Luminex xMAP instrumentation.
- Dependent on access to Luminex MAGPIX or compatible analyzer, antibody coupling kit, and magnetic separation tools.
- Necessitates cross-team standardization of bead coupling protocols, wash buffers, and detection antibody titration.
- Involves adaptation considerations when transferring antibody pairs to different sample matrices (e.g., serum, CSF) or species.
- Limited by the need for optimized titration of capture and detection antibodies to minimize background and maximize signal-to-noise ratio.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Coupling Antibodies to MagPlex Microspheres, using the xMAP Antibody Coupling Kit
4:58
Antibody Screening
7:20
xMAP Functional Assay
9:07
ELISA Assay
9:44
Results: Comparison of an ELISA Assay for TNF-alpha Cytokine to the Converted Assay using the xMAP Platform
14:28
Conclusion
