Name: 立体定向颅内植入和 em在体内 /em生物发光成像的肿瘤异种移植的小鼠模型系统的多形性胶质母细胞瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 了解立体定向颅内植入技术，用于建立多形性胶质母细胞瘤小鼠异种移植模型，并通过生物发光成像和磁共振成像进行无创监测，为神经肿瘤学研究提供可靠的临床前研究工具。

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我们感谢 Andrew Hollander 博士、Sara Davis、Lee Shuman、Tim Jenkins 以及 Xiangsheng Xu 博士提供的专业帮助。我们感谢 Ann Kennedy 博士给予的支持。B.C.B. 获得了放射生物学培训项目（C5T32CA009677）的资助。J.F.D. 获得了 Burroughs Wellcome 医学科学家职业奖（1006792）的支持。J.L.B. 获得了 SUPERs 项目（5 R25 CA140116-03）的资助。我们谨向 Steve Hahn 博士致以谢意，他的鼓励与支持使我们的研究得以实现。我们还要感谢宾夕法尼亚大学纳米-生物界面中心（NBIC）以及 Dennis Discher 博士提供的鼓励和有益建议。我们感谢宾夕法尼亚大学小型动物影像设施（SAIF）提供其磁共振成像及光学/生物发光核心设施的使用权限。这些技术的开发是多个项目的组成部分，相关项目获得了美国国立卫生研究院（RC1 CA145075 和 K08 NS076548-01）的资助。

A. 术前肿瘤细胞制备
<ol>
 <li>使用慢病毒表达载体（pGreenFire，System Biosciences）转导U251多形性胶质母细胞瘤细胞，以稳定表达萤火虫荧光素酶基因。</li>
 <li>将这些细胞培养于10 ml完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，该培养基由DMEM添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1%非必需氨基酸组成，置于T75组织培养瓶中，在5% CO2、37 °C条件下孵育。</li>
 <li>进行标准细胞培养操作，首先用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后进行胰蛋白酶消化。</li>
 <li>用完全DMEM终止胰蛋白酶反应，将溶液转移至50 ml锥形瓶中，并使用库尔特计数器测定细胞浓度。</li>
 <li>将收获的细胞在完全DMEM中以约3,000转/分钟离心3分钟。</li>
 <li>离心后，吸除上清液，仅保留50 ml锥形瓶底部的细胞沉淀。</li>
 <li>操作需迅速，防止细胞干燥，将细胞重悬于适量新鲜完全DMEM中，使细胞浓度达到50,000个细胞/μl，并转移至置于冰上的2 ml无菌小瓶中。</li>
 <li>置于冰上的细胞应每隔约20分钟在低速下短暂涡旋振荡，以防止细胞黏附。细胞置于冰上后两小时内可用于颅内植入实验。</li>
</ol>
B. 原位异种移植植入
<ol>
 <li>称重裸鼠（athymic NCr小鼠，nu/nu）以确定植入前的基础体重。我们通常选择6至10周龄、体重在17至24克之间的小鼠。</li>
 <li>植入前1小时，通过皮下注射给予小鼠5 mg/kg的非甾体抗炎药美洛昔康，以预防术后疼痛和炎症。</li>
 <li>以每公斤体重140 mg的氯胺酮和10 mg的赛拉嗪混合物进行腹腔注射，使动物麻醉。</li>
 <li>通过脚趾夹捏测试动物的自发反应，确认小鼠已充分麻醉。若动物对脚趾夹捏有反应，应延迟手术操作，直至麻醉起效，或考虑追加麻醉剂注射&lt;原始量的25%）。</li>
 <li>将麻醉后的小鼠固定于Stoelting Digital Just for Mouse立体定位仪（Stoelting Inc.）中：将小鼠门齿钩挂于鼻部固定器的咬合杆上，收紧鼻部夹固定鼻部，同时确保小鼠头部处于水平平面。</li>
 <li>将固定好的小鼠转移至Stoelting立体定位仪平台，调整动物体位，使耳杆尖端位于外耳道尾侧末端。待动物头尾方向位置调整完毕后，将门齿杆固定于立体定位仪框架上。小鼠应置于一块牢固的塑料加热板（Harvard Apparatus）上，该加热板用胶带固定在Stoelting平台上，用于手术期间提供反馈控制的温度调节。</li>
 <li>根据需要调整耳杆高度，然后将耳杆推进至外耳道的尾端，固定耳杆，使小鼠头部处于水平平面，并在手指触碰时保持固定不动。放置耳杆后，密切监测动物是否出现呼吸困难的迹象。若动物出现不适，应松开耳杆并重新调整位置。</li>
 <li>将连接至TCAT-2DF温度控制器（Harvard Apparatus）的直肠温度探针的润滑探头插入动物体内，以监测其体温，并为置于小鼠下方的加热板提供反馈控制，维持动物体温在 36 °C 在操作过程中。</li>
 <li>涂抹眼用软膏以防止眼睛干燥。</li>
 <li>用碘伏溶液涂抹小鼠头部顶部以消毒切口部位，注意避免接触眼睛。</li>
 <li>通过脚趾挤压确认小鼠无意识，必要时追加少量氯胺酮/赛拉嗪（ketamine/xylazine）&lt;必要时（初始剂量的25%）。</li>
 <li>使用酒精垫清洁连接在钻机（Foredom Microdrill）上的0.45 mm钻头（Stoelting），然后将钻头浸入玻璃珠灭菌器（Germinator 500, CellPoint Scientific）中灭菌15秒，仅将钻头部分插入灭菌珠中。</li>
 <li>使用无菌手术刀，在头顶中部从眼睛水平位置向尾侧做一长度为0.75 cm的纵向切口。确认可观察到前囟。</li>
 <li>将钻头夹具连接至 Stoelting 平台，并将装有 0.45 mm 钻头（Stoelting）的 Foredom Microdrill 钻机放入钻头夹具中，固定到位。</li>
 <li>将钻头精确置于前囟上方，然后将数字立体定位仪的 x、y、z 坐标归零。将钻头尖端移至前囟后方 2 mm、右侧大脑半球外侧 1.5 mm 的位置，使用 Foredom 钻头钻开动物颅骨，仅穿透骨质。可使用无菌棉签轻轻牵拉切口边缘，以利于观察颅骨表面。</li>
 <li>从立体定位平台中取出钻头和钻头夹持器。</li>
 <li>将Nanomite注射泵（Harvard Apparatus）连接至立体定位平台。</li>
 <li>将细胞从冰上取出，轻轻涡旋含有肿瘤细胞的离心管，使用短暂脉冲，或轻轻弹击离心管，以重新悬浮细胞。吸取 7 μl 通过连接在1英寸长、30号扁斜面针头上的细胞悬液 10 μl 注射器（Hamilton 注射器）。避免注射器中产生较大的气泡。确保初始阶段无气泡存在 6 μl 注入小鼠体内的液体体积，即为总注射量。残留液体中的微小气泡 1 μl 无需担心。应尽量避免重复吸取细胞悬液，以减少对细胞的损伤。</li>
 <li>将装有细胞悬液的注射器放入注射器推进器中。使用酒精棉片擦拭针尖处出现的细胞悬液，以防止癌细胞污染切口部位，避免导致颅外空间形成肿瘤。</li>
 <li>将注射泵设置为输送 6.0 μl 以……的速率 0.5 μl/min。该 1 μl 注射后确保细胞悬液完全排出，避免常积聚在注射器内的气泡注入动物体内。注入气泡可能导致致命的空气栓塞。</li>
 <li>将注射器针头插入颅骨钻孔处，保持针头与颅骨垂直（90度）。当针头穿过颅骨后，将立体定位仪数字显示屏上的坐标归零，随后在4分钟内缓慢推进针尖，直至达到2.5 mm的深度。针头将穿过大脑皮层及部分后部海马结构。立体定位植入的x、y、z坐标选择旨在使肿瘤位于大脑半球侧方，同时避免损伤丘脑等关键脑结构，并远离脑室，从而降低肿瘤细胞播散至脑脊液并引发不期望的脊髓肿瘤的风险。选择相对于前囟后方的位置，以减少大型局部进展性肿瘤侵入眼眶并形成溃疡的可能性。针头到达目标深度后停留2分钟，随后开始接种细胞。</li>
 <li>植入过程中，使用显微外科海绵棒反复擦干颅骨，以清除可能在钻孔植入期间反流至外的含肿瘤液体。注意避免海绵接触针头。清除该液体可降低肿瘤在颅外空间生长的可能性。</li>
 <li>注射完成后，将针头留在脑内约 2 分钟，然后在 3-4 分钟内缓慢撤出针头。</li>
 <li>松开耳杆和鼻夹，将小鼠从立体定位仪中取出。</li>
 <li>使用无菌棉签的木柄端来回涂抹无菌骨蜡，封闭颅骨上的钻孔。持续涂抹骨蜡直至钻孔完全封闭，且封闭钻孔的骨蜡与周围颅骨表面齐平。</li>
 <li>用无菌棉签将切口边缘对合，并涂抹兽用组织胶以闭合伤口，注意避免胶水接触动物的眼睛。</li>
 <li>最后，将小鼠置于设定为 37 °C 直到动物恢复意识。当小鼠清醒并有反应后，将其放回原来的笼子。</li>
</ol>
C. 生物发光成像（BLI）用于监测肿瘤生长及对治疗的反应
以下是生物发光成像的简要操作说明。
<ol>
 <li>用2%异氟烷和氧气麻醉先前在腔室内植入肿瘤的小鼠。</li>
 <li>在小鼠麻醉状态下，对其进行皮下或腹腔注射 60 μl PBS 中稀释的 D-荧光素钾盐，浓度为 50 mg/ml。</li>
 <li>打开生物发光成像扫描仪中向鼻罩输送麻醉气体的开关，并迅速将小鼠转移至扫描仪内，使其鼻部进入鼻罩中。</li>
 <li>在小鼠之间放置黑色隔板，以限制高信号强度肿瘤的生物发光信号扩散至相邻的低信号强度肿瘤。</li>
 <li>使用 Living Image 软件，在注射 D-荧光素后最多持续 30 分钟内进行频繁的连续曝光。我们建议将曝光时间设置为“自动”，以降低图像曝光不足或过度曝光的可能性。单次曝光不应 &gt;5 min.</li>
 <li>以适当的时间间隔重复进行生物发光成像。对于许多检测治疗反应的纵向实验，每周连续成像是一种合理的选择。</li>
 <li>成像完成后，使用 Living Image 软件通过在每次生物发光成像过程中获取的每张图像中围绕每个肿瘤绘制感兴趣区域（ROI），以分析肿瘤。在每张图像中每只小鼠的下侧 flank 区域应用第二个较小的感兴趣区域，作为背景感兴趣区域，用于根据背景生物发光信号强度对肿瘤的生物发光信号进行校正。我们倾向于使用“Radiance”而非“Counts”作为生物发光信号的输出值。</li>
 <li>将 ROI 结果导出至 Excel，并确定每只小鼠的最大背景校正后生物发光信号。</li>
 <li>根据实验需要重复进行生物发光成像，以连续监测肿瘤生长。在我们的实验中，每周进行一次生物发光成像（BLI）。我们倾向于在注射D-荧光素后5至30分钟内进行多次曝光，以获取单次成像过程中最强的BLI信号。</li>
</ol>
D. 代表性结果
该立体定向植入技术的肿瘤成瘤率可达90-100%，围手术期死亡率较低，通常低于5%。采用该技术发生非预期副作用的风险也较低，包括因将肿瘤细胞植入脑室而导致脊髓种植，或因切口被肿瘤细胞种植或骨窗封闭不全，使颅内肿瘤通过颅骨开口向外生长至颅外等并发症。
离体分析肿瘤异种移植组织显示了预期的缺氧区域、VEGF 表达增加以及坏死现象。通过对我们的胶质母细胞瘤（GBM）细胞系稳定表达的绿色荧光蛋白（GFP）进行荧光显微镜观察，揭示了这些异种移植瘤的浸润性特征。
图1展示了将胶质母细胞瘤（GBM）细胞立体定向植入小鼠脑内后一次典型成功实验的结果。该图像为采用9.4特斯拉磁体在细胞植入后21天对小鼠脑部进行的T2加权脑部MRI扫描。 图1显示右侧半球存在单一肿瘤病灶（以粉红色轮廓标出），体积为19 mm3，且病灶位置精确位于植入位点的预定坐标处。
图2展示了采用本方法对10只经立体定位接种肿瘤的小鼠进行生物发光成像的结果。这些小鼠根据最大生物发光信号强度被均匀分层，分别接受颅部照射（4 Gy × 4次每日分割照射）或完全不予治疗。本实验中，生物发光成像显示，放射治疗抑制了移植肿瘤的增殖，导致检测到的生物发光信号未见增加；而在假照射的对照组肿瘤中，由于癌细胞不受抑制地增殖，生物发光信号显著增强。
图1（视频）。 含有U251胶质母细胞瘤的鼠脑冠状MRI切片，显示肿瘤体积的轮廓（粉红色）。该扫描使用9.4特斯拉磁共振成像仪，采用自旋回波T2加权序列完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4089/4089movie1.m4v" target="_blank"> 点击此处观看视频</a>。
<img alt="生物发光图表；对照组与放疗组随时间变化的肿瘤生长测量分析。" src="/files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 10只经立体定位植入多形性胶质母细胞瘤肿瘤的小鼠，分别接受分4次给予总剂量为16 Gy的外照射放射治疗或不予治疗。在治疗前及治疗开始后每周对小鼠进行生物发光成像。该图显示的是相对生物发光强度，以中位倍数变化表示，其中倍数变化定义为当前最大生物发光成像（BLI）值与治疗前最大BLI值的比值。

<ol><li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).</li>
<li>Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+review+of+in+vivo+GBM+rodent+models%3A+emphasis+on+the+CNS-1+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro%22%5BJournal%5D)">Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model.</a> ASN Neuro. 3, e00063(2011).</li>
<li>Shelton, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pre-clinical+in+vivo+mouse+model+for+malignant+brain+tumor+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion.</a> J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).</li>
<li>Brehar, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+xenograft+glioblastoma+implants+in+nude+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Life%22%5BJournal%5D)">The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain.</a> J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).</li>
<li>Radaelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistopathological+and+neuroimaging+characterization+of+murine+orthotopic+xenograft+models+of+glioblastoma+multiforme+recapitulating+the+most+salient+features+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease.</a> Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).</li>
<li>Baumann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+efficacy+of+drug-loaded+nanocarriers+against+brain+tumors+by+targeted+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Baumann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+method+for+reproducible+and+accurate+image-guided+stereotactic+cranial+irradiation+of+brain+tumors+using+the+Small+Animal+Radiation+Research+Platform+%28SARRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP).</a> Transl. Oncol. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Park, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPET%2FCT+imaging+of+an+orthotopic+model+of+human+glioblastoma+multiforme+and+evaluation+of+pulsed+low-dose+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Oncol.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroPET/CT imaging of an orthotopic model of human glioblastoma multiforme and evaluation of pulsed low-dose irradiation.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 80, 885-892 (2011).</li>
<li>Szentirmai, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+of+luciferase+expressing+intracranial+U87+xenografts%3A+correlation+with+magnetic+resonance+imaging+determined+tumor+volume+and+longitudinal+use+in+assessing+tumor+growth+and+antiangiogenic+treatment+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging of luciferase expressing intracranial U87 xenografts: correlation with magnetic resonance imaging determined tumor volume and longitudinal use in assessing tumor growth and antiangiogenic treatment effect.</a> Neurosurgery. 58, 365-372 (2006).</li>
<li>Dinca, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+monitoring+of+intracranial+glioblastoma+xenograft%3A+response+to+primary+and+salvage+temozolomide+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述的小鼠立体定向肿瘤细胞植入方法能够稳定地生成肿瘤，较好地模拟临床多形性胶质母细胞瘤的浸润性生长和快速增殖特征2, 6-8。该技术特别适用于需要将小鼠均匀分组进行不同治疗干预的实验，尤其在需要肿瘤大小、生物学特性以及解剖位置均具可重复性和可比性的情况下。采用本文所描述的技术进行肿瘤细胞的立体定向植入，大多数转化医学研究实验室均可顺利实现7,9-11。

<table><tbody><tr><td>小鼠立体定位仪数字专用装置</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td>用于小鼠植入的立体定位平台</td></tr><tr><td>氯胺酮/赛拉嗪</td><td></td><td></td><td>注射用麻醉剂</td></tr><tr><td>普拉露宝兽用眼膏（眼科用）</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>防止小鼠眼睛干燥</td></tr><tr><td>立体定位平台用钻头夹持器</td><td>Stoelting</td><td>51681</td><td></td></tr><tr><td>电动显微钻机</td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td>用于钻开颅骨</td></tr><tr><td>0.45 mm 碳化钨钻头</td><td>Stoelting</td><td>514551</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠干式灭菌器（Germinator 500）</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER-5287</td><td>用于灭菌金属外科器械</td></tr><tr><td>小鼠直肠探头</td><td>Braintree Scientific</td><td>RET-3-ISO</td><td>与温度控制器兼容</td></tr><tr><td>温度控制器（TCAT-2DF）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>727561</td><td>手术期间维持动物体温的温度控制器</td></tr><tr><td>小型加热板</td><td>Harvard Apparatus</td><td>727617</td><td>与温度控制器配合使用，在手术期间为小鼠保温。加热板置于立体定位平台上的小鼠下方。</td></tr><tr><td>一次性手术刀片</td><td>BD Bard-Parker</td><td>2015-11</td><td>#10 手术刀</td></tr><tr><td>10 微升注射器</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td>用于注射肿瘤细胞</td></tr><tr><td>30 号针头，1&quot; 长，带平头</td><td>Hamilton</td><td>Various</td><td>必须与 10 &amp;mu;l 注射器兼容</td></tr><tr><td>Nanomite 可编程注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704507</td><td>用于立体定位装置的数字化电动注射器</td></tr><tr><td>纤维素无菌手术尖头海绵</td><td>Ultracell</td><td>40410</td><td>用于干燥手术区域</td></tr><tr><td>骨蜡</td><td>Ethicon</td><td>W31</td><td>封闭骨窗孔</td></tr><tr><td>Tissumend II 合成可吸收组织粘合剂</td><td>Veterinary Products Laboratories</td><td>3002931</td><td>封闭切口</td></tr><tr><td>带加热垫的热水循环泵</td><td>Gaymar</td><td>TP-650</td><td>用于术后小鼠保温</td></tr><tr><td>IVIS Lumina II</td><td>Caliper Life Science</td><td></td><td>生物发光成像仪</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td>用于生物发光成像的荧光素</td></tr></tbody></table>

立体定向颅内植入与 体内 多形性胶质母细胞瘤小鼠模型系统中肿瘤异种移植的生物发光成像

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种高级别的原发性脑癌，尽管采用手术切除、术后放疗和替莫唑胺化疗的标准三联治疗，人类患者的中位生存期仅为14.6个月 1显然需要新的治疗策略来提高患者的生存率和生活质量。开发更有效的治疗方案需要借助能够模拟人类疾病的胶质母细胞瘤（GBM）动物模型，同时允许通过连续影像学监测肿瘤生长及治疗反应。本文中，我们描述了一种精确的立体定向技术，可将可用于生物成像的GBM癌细胞植入裸鼠脑内，从而建立能重现GBM关键临床特征的肿瘤异种移植模型。 2该方法可产生可重复且精确定位于解剖位置的肿瘤，同时允许 体内 利用生物发光成像连续监测颅内异种移植瘤的生长及对治疗的反应 3-5该方法对动物的耐受性良好，围手术期发病率和死亡率较低。

我们介绍一种集成方法，用于将人多形性胶质母细胞瘤细胞精确、立体定向地植入裸鼠脑内，并进行后续系列 体内 成像以监测所形成异种移植瘤的生长及对治疗的反应。

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种高级别的原发性脑癌，尽管采用标准的三模式治疗，人类患者的中位生存期仅为14.6个月……

本实验的总体目标是通过将可生物成像的多形性胶质母细胞瘤细胞精确地立体定位植入裸鼠脑内，建立能够重现多形性胶质母细胞瘤关键临床特征的肿瘤异种移植模型。首先，需制备稳定表达荧光素酶的多形性胶质母细胞瘤细胞，以实现连续无创的生物发光成像；第二步是麻醉小鼠并将其固定于立体定位仪中。接下来，在皮肤上做切口，并根据B bgma的精确坐标钻出颅骨孔。最后一步是利用立体定向技术将肿瘤细胞缓慢植入脑内，随后拔出针头并缝合切口。最终，通过生物发光成像和磁共振成像进行系列无创成像，以监测肿瘤的生长情况及对试验性治疗的反应。与现有的非立体定位手动植入癌细胞方法相比，本技术的主要优势在于，此处所述的立体定位颅内肿瘤细胞植入小鼠方法能够产生更具可重复性的肿瘤，且能较好地模拟临床多形性胶质母细胞瘤的浸润性生长和快速增殖特征。该手术的围手术期发病率和死亡率极低，肿瘤成瘤率非常高。该技术特别适用于需要将小鼠均匀分组进行不同治疗干预的实验，以便在解剖位置上获得大小、生物学特性相似且可重复的肿瘤。用氯胺酮-赛拉嗪混合物麻醉小鼠后，将其置于Stulting Digital小鼠立体定位平台上，将门齿钩在鼻部固定器的咬杆上，然后拧紧鼻部夹以固定鼻部。同时，确保小鼠头部处于水平平面。接下来，将固定好的小鼠转移至立体定位仪平台。调整动物的位置，使耳杆的尖端位于耳道的耳杯末端。然后将门齿固定杆固定到立体定位仪框架上。应将小鼠置于固定在平台上的坚固塑料加热板上，并用胶带固定，以便在手术期间提供反馈控制的温度调节。然后，将耳杆推进至耳道的耳窝部分，并固定好，使小鼠头部处于水平平面并保持不动。接下来，将润滑过的直肠温度探针插入动物直肠，以监测其体温，并将信号反馈至加热板，从而在手术过程中维持动物体温在36摄氏度。然后将眼用软膏涂抹于眼睛表面，防止角膜干燥。随后，将聚维酮碘溶液涂抹于小鼠头部顶端。通过脚趾夹捏确认小鼠失去意识后，使用无菌手术刀在颅顶正中纵向做一处0.75厘米的切口，切口从前眼水平位置开始延伸。确保骨髓腔（BMA）可见。然后将钻头固定器连接至固定平台。然后将装有0.5毫米钻头的钻具放入钻具 holder 中并固定到位。现在将钻头精确放置在 rema 的正上方。使用无菌棉签轻轻牵拉切口边缘，以利于观察颅骨，将钻头尖端移至右侧大脑半球中位于 bgma 后方2毫米、外侧1.5毫米的位置，并使用 Fordham 钻具在动物颅骨上钻孔，仅穿透骨组织。然后将钻孔装置从立体定位平台上取下。接下来，将螨虫注射器泵连接到立体定位平台上。将细胞从冰上取出，用短暂脉冲轻轻涡旋含有肿瘤细胞的管子，或轻轻弹击管子，以重新悬浮细胞。然后用一支10微升注射器，通过其上安装的30号、一英寸长平斜面针头，吸取7微升细胞悬液。注射器内应避免产生大气泡，并确保前6微升液体中无任何气泡，这6微升即为将注入小鼠体内的总体积。将装好液体的注射器放入注射器推进器中。使用酒精棉片清除针尖处出现的任何细胞悬液，以防止癌细胞污染切口部位，避免导致颅外空间肿瘤生长。现在将注射泵设置为以每分钟 0.5 微升的速度注入 6.0 微升。植入后，注射器中残留的 1 微升细胞悬液可确保经常在注射器中聚集的气泡不会被注入动物体内，否则气泡注射可能导致致命的空气栓塞。接下来，将注射器针头推进颅骨钻孔中，同时保持针头与颅骨垂直。一旦针头穿过颅骨，将立体定位数字显示器上的坐标归零。然后在四分钟内缓慢推进针头尖端，直至达到 2.5 毫米的深度。注射完成后，暂停两分钟，然后开始细胞植入，将针头在脑内保留约两分钟。随后在三到四分钟的时间内缓慢撤出针头。松开耳杆和鼻部固定器。随后，将小鼠从立体定位仪中取出。用无菌骨蜡在颅骨钻孔处来回摩擦，封闭颅骨上的钻孔。持续涂抹骨蜡，直至钻孔完全封闭，且封闭后的钻孔与邻近颅骨表面齐平。接下来，使用兽用组织胶封闭伤口，并用无菌棉签将切口边缘对合，确保动物的眼睛不接触任何胶水。最后，将小鼠置于设定为37摄氏度的加热垫上，直至动物恢复意识。随后将动物放回其原始笼具中。当小鼠恢复清醒并有反应时，将其用60微升D-荧光素钾盐进行皮下或腹腔注射，该溶液已用PBS稀释至50毫克/毫升的浓度。开启生物发光成像扫描仪中向鼻罩输送的麻醉气体，并迅速将小鼠转移至扫描仪中，使其鼻部进入鼻罩内。将黑色分隔板放置在小鼠之间，以限制信号强度较高的大肿瘤人为地增强相邻微小肿瘤的测量信号强度。最后，在荧光素注射后，使用活体成像软件进行连续多次曝光，每次曝光时间少于五分钟，总时长可达30分钟。此处显示的是在小鼠脑内成功进行立体定位移植多形性胶质母细胞瘤细胞的结果。植入后21天使用9.4特斯拉磁体进行的T2加权脑部MRI扫描显示，右侧半球存在单一肿瘤病灶，体积为19立方毫米，位置精确对应于植入位点。图中周围正常的脑组织以灰色勾勒。在本研究中，10只通过立体定位法植入多形性胶质母细胞瘤的实验小鼠，分别接受分4次给予总剂量为16戈瑞的外照射放射治疗或不予治疗。生物发光成像结果显示，放射治疗抑制了植入肿瘤的增殖，导致检测到的生物发光信号未见增加；而对照组中未接受放射的肿瘤由于癌细胞不受控制地增殖，其信号显著增强。使用同一批细胞，每只小鼠的操作可在约25分钟内完成。在开始手术前，必须确保动物已充分麻醉，对用力捏压脚趾无反应；同时应注意避免麻醉过深。根据我们的经验，大多数围手术期死亡似乎与麻醉引起的呼吸抑制有关。观看本视频后，您应能充分掌握如何将癌细胞精确地立体定位植入裸鼠脑内，以及如何对由此产生的颅内异种移植瘤进行系列活体生物发光成像，以监测其在治疗过程中的生长变化。

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医学

立体定向颅内植入和<em在体内</em生物发光成像的肿瘤异种移植的小鼠模型系统的多形性胶质母细胞瘤

可通过颅内接种在裸鼠体内建立表达荧光素酶的人脑肿瘤异种移植模型，并利用生物发光成像技术对肿瘤生长及治疗反应进行后续监测。结合生存分析，生物发光监测是针对脑肿瘤治疗方案开展临床前研究的重要工具。...

建立颅内脑肿瘤异种移植模型并利用生物发光成像分析肿瘤生长及治疗反应

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颅内植入及后续三维成像 体内 小鼠胶质瘤的生物发光成像

来源：Clark, A.J., 等. 胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像。J. Vis. Exp.

免疫活性小鼠胶质母细胞瘤模型的生物发光成像

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一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

大脑是一个具有独特特性的部位，其特性无法通过 体外 或异位分析。通过使用立体定位固定仪和低压注射泵进行颅内注射，可可靠地建立具有可重复位置和生长特征的原位小鼠模型。...

创建解剖学上精确且可重复的人脑肿瘤颅内异种移植模型

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胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像

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荧光分子断层成像技术 在体 内 胶质母细胞瘤异种移植瘤的成像

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多形性胶质母细胞瘤的转化性原位模型

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小鼠脑内立体定向接种胶质母细胞瘤患者来源异种移植细胞系

了解立体定向颅内植入技术，用于建立多形性胶质母细胞瘤小鼠异种移植模型，并通过生物发光成像和磁共振成像进行无创监测，为神经肿瘤学研究提供可靠的临床前研究工具。

立体定向颅内植入与体内多形性胶质母细胞瘤小鼠模型系统中肿瘤异种移植的生物发光成像

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立体定向颅内植入与 体内 多形性胶质母细胞瘤小鼠模型系统中肿瘤异种移植的生物发光成像

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