Name: 分离的CD4 +从小鼠淋巴节点使用美天旎MACS纯化的T细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:34:55.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习使用美天旎MACS试剂盒从小鼠淋巴结中分离高纯度CD4+ T细胞。本方法采用阴性选择技术，可获得纯度≥96%的淋巴细胞，适用于免疫学研究和下游细胞培养实验。

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我们感谢 Rebecca Paquett 为制备 MACS 缓冲液所做的工作。

请阅读并遵循 Miltenyi 试剂盒中包含的实验方案，或访问在线网址 <a href="http://www.miltenyibiotec.com/">http://www.miltenyibiotec.com/</a>。

<ol><li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li>
<li>Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+IA+phosphoinositide+3-kinase+modulates+basal+lymphocyte+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node.</a> J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

从原始来源中分离细胞是许多更复杂实验方案中的必要步骤。Miltenyi 提供了可用于多种生物体（包括人类、非人灵长类动物、大鼠，以及本文所述的小鼠）的细胞分离试剂盒。基于磁珠的细胞分离技术可用于阳性筛选（或细胞耗竭），也可用于阴性筛选。本文中，我们演示了对未接触或初始型 CD4+ 辅助性 T 细胞的阴性筛选。采用此标准方案，通常可获得纯度 ≥ 96% 的 CD4+/CD3+ 细胞。尽管本视频方案中未展示流式细胞术（FACS）分析，但仍强烈建议通过 FACS 并使用适当的抗体检测所分离细胞的整体纯度。此外，我们演示的是非无菌条件下的 T 细胞分离方法。如果您的具体应用需要无菌细胞，请务必在组织培养超净台内、在标准无菌条件下完成所有操作步骤。

<table><tbody><tr><td>MACS 缓冲液</td><td>试剂</td><td>无</td><td>无</td><td>按 Miltenyi 的说明进行配制。</td></tr><tr><td>CD4+ T 细胞分离试剂盒：非接触式分离</td><td>试剂</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-860</td><td>与 Miltenyi 系统配合使用。</td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>用于 MACS 缓冲液的配制。</td></tr><tr><td>Corning 35 mm 未经组织培养处理的培养皿</td><td>其他</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>用于制备单细胞悬液。</td></tr><tr><td>70 微米细胞滤网</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td>用于制备单细胞悬液。</td></tr><tr><td>6 mL 注射器</td><td>工具</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>8881516051</td><td>用于制备单细胞悬液。</td></tr><tr><td>10× Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>14200-075</td><td>用于红细胞裂解。</td></tr><tr><td>无菌水</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td>用于红细胞裂解。</td></tr></tbody></table>

使用 miltenyi macs 分离法从小鼠淋巴结中分离 cd4+ t 细胞

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

从原始来源分离细胞是许多更复杂实验方案中的必要步骤。Miltenyi 提供了可用于多种生物体（包括人类、非人灵长类动物、大鼠，以及本文所述的小鼠）的细胞分离试剂盒。基于磁珠的细胞分离技术可用于阳性选择（或细胞耗竭）以及阴性选择。本文中，我们演示了对未接触或初始状态的 CD4+ 辅助性 T 细胞进行阴性选择。采用此标准方案，通常可获得纯度 ≥ 96% 的 CD4+/CD3+ 细胞。本方案与 JoVE 第 7 期发表的《小鼠外周淋巴结的解剖与双光子成像》方案联合使用，用于纯化 T 细胞及其他细胞类型，以进行过继性转移并用于成像研究。尽管本视频方案中未展示流式细胞术（FACS）分析，但仍强烈建议通过 FACS 并使用适当的抗体检测所分离细胞的整体纯度。此外，我们演示的是非无菌条件下的 T 细胞分离方法。如果您的具体应用需要无菌细胞，请务必在组织培养超净台内、在标准无菌条件下完成所有操作步骤。感谢观看，祝您实验顺利！

使用 Miltenyi MACs 试剂盒分离淋巴细胞是从全淋巴组织匀浆中纯化细胞的一种可靠方法。利用 Miltenyi 系统纯化的细胞纯度通常 ≥ 96%。本文中，我们演示了分离 CD4+ T 细胞的步骤，这是 Miltenyi 提供的多种试剂盒之一。

使用 Miltenyi MACS 分离法从小鼠淋巴结中分离 CD4+ T 细胞

从原始来源中分离细胞是许多更复杂实验方案中的必要步骤。Miltenyi 提供多种试剂盒，可用于从不同组织或样本中分离细胞。

这是一个 Max MIDI 磁铁。上面写着：注意，具有极强的磁场。大家好，我是来自加州大学尔湾分校生理学与生物物理学系 Mike Collins 实验室的 Melanie Matthew。今天我们将向您展示如何使用Milton Biotechnology试剂盒，通过阴性筛选法分离制备CD4阳性T细胞。这里我们有Minimax和Minimax磁铁装置，Minimax用于较大体积的细胞分离，可在适配于Minimax的分选柱中处理多达10的9次方个细胞，而Minimax则适用于细胞数量较少的小体积样本。因此，根据您是进行阳性分离还是阴性分离，您需要使用相应的抗体标记您的细胞。这些抗体带有磁珠，可与磁铁结合。在阴性选择的情况下，您感兴趣的细胞将流经色谱柱，您可以收集流出液，其中含有您感兴趣的细胞。需要说明的是，我今晚向您展示的技术并非无菌操作。因此，如果您希望将这些细胞用于细胞培养，应使用无菌器械并在组织培养罩内完成所有操作。尽管我向您演示的是CD4阳性T细胞的制备过程，但其中许多技术同样适用于利用美天旎生物技术试剂盒分离纯化其他类型的细胞。好的，我已经从小鼠体内取出淋巴结，并在 JoVE 第七期视频“双光子成像用淋巴结制备”中详细演示了该操作步骤。接下来，我将把淋巴结在70微米细胞筛中研磨成单细胞悬液。好的，现在我将使用一个6毫升注射器的末端，将淋巴结研磨成单细胞悬液。淋巴结位于滤器内的RPMI培养基中，制备单细胞悬液至关重要。使用滤器的原因是确保没有细胞团块残留。因此，当我完成研磨后，将把滤器从培养基中取出，收集滤过筛网的液体，从而获得单细胞悬液。研磨时，需确保尽可能充分破坏所有组织。这种单细胞悬液将用于后续分离纯化的 CD4 阳性 T 细胞。好的，现在我已完成组织研磨，可以看到大部分淋巴结组织已基本消失。我们这里仍然有一些小块的脂肪组织，以及来自六个淋巴结的淋巴结被膜碎片，还带有一些结缔组织，它们全都粘连在一起。现在我移除细胞滤筛。你们可以看到，培养基非常浑浊。加入单细胞悬液中的细胞，以确保从滤膜上获得最大数量的细胞，其中部分细胞会黏附在滤膜上。我用几毫升培养基洗涤滤膜，然后将所有培养基用移液器转移至15毫升Falcon管中，随后离心，使细胞沉淀，以便后续纯化。因此，这是我得到的单细胞悬液，已在300 × g离心10分钟，细胞已沉淀。如果你认为单细胞悬液中死细胞的比例较高，建议使用 Miltenyi 的死细胞去除试剂盒。现在我已经将细胞沉淀下来，接下来我会倒掉上清液，进行红细胞裂解，然后对细胞进行计数，再对这些特定细胞使用 CD4 阳性 T 细胞阴性筛选试剂盒。好的，现在我将进行红细胞裂解。我们将通过降低溶液的渗透压来裂解已沉淀的红细胞以及淋巴细胞，首先加入水，然后通过添加10倍浓度的D-B-P-S将溶液恢复至1倍浓度。我们的淋巴细胞对渗透压变化的耐受性比红细胞更强，但我们仍需快速操作，否则也会裂解淋巴细胞，而这并非我们所希望的。快速操作的一部分是，我会在实际向体系中加水之前，预先准备好裂解过程所需的各种体积的溶液。因此，在加入水后几秒钟内，我需要加入10倍浓度的D-B-P-S，以确保不会裂解淋巴细胞，同时有效裂解红细胞。具体操作是：取900微升水和100微升10倍浓度的D-B-P-S。我已经准备好两根移液管。在裂解过程中，我先加入水，等待几秒钟，可能轻轻摇动一下离心管，然后加入10×DBPS，再稍微多摇动几次。如果你裂解的样本中含有大量红细胞，你会看到大量无定形的团块形成，这些是破裂的细胞膜聚集而成的。我们这里有一点，可以看到存在一些破碎的细胞膜。因此，在完成裂解后，以防移液过程中出现任何误差，我喜欢向细胞中加入几毫升培养基，以确保渗透压正确，从而不再继续发生裂解。好的，现在我的淋巴细胞已经处于单细胞悬液状态。再次进行红细胞裂解后，我将离心样品以沉淀细胞。在进行这一步之前，我需要使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定在CD4阳性T细胞阴性筛选试剂盒中需要加入多少抗体。好的，现在我已将细胞在Max缓冲液中离心，可以看到，经过红细胞裂解后，沉淀物明显变得更白了。我将对 CD4 阳性 T 细胞进行阴性筛选。因此，我会倒掉所有培养基以及用于沉淀细胞的 Max Buffer，并使用生物素标记的抗体混合物进行标记，这是 CD4 阳性 T 细胞阴性筛选的第一步。然后我在冰箱中孵育10分钟。好的，我的细胞已完成初始孵育。现在我将抗生素加入微珠中，并将它们放回冰箱中继续孵育15分钟。对于此次特定的细胞分离，我们使用 Miltenyi Biotec 的 LS 分离柱。首先，将其置于磁力架上，并用 3 mL 的 MACS 缓冲液冲洗分离柱以进行预处理。接下来，打开分离柱并将其放置在磁力架上，使柱体的卡脚朝内插入磁铁中。现在，我将向分离柱中加入 MACS 缓冲液，您会看到液体流经 LS 分离柱，并开始从底部滴出。无需担心分离柱是否会流干。液体的表面张力会防止其流干，直到您加入细胞。在加入细胞之前，必须让max缓冲液完全通过柱子。好的，在与生物素磁珠孵育15分钟后，这些磁珠已结合到细胞和max缓冲液中，接下来我将倒掉缓冲液，并用适量缓冲液重悬细胞，缓冲液的体积需根据细胞数量进行调整。因此，您需要查阅相应的微量实验方案。然后，我将把细胞悬液加入到刚刚用Max缓冲液冲洗过的层析柱中。现在，我们将细胞悬液加入层析柱。由于这是一个负向筛选柱，我们将收集流穿的细胞，这些细胞在此情况下应全部为CD4阳性T细胞。接下来，我将用12毫升MACS缓冲液洗涤柱子，同样收集流出液，其中应仅含有CD4阳性T细胞。现在，我将离心沉淀CD4阳性T细胞，重悬细胞，然后用适用于tau成像的相应染料进行标记。我还将取少量已纯化的细胞样本，用抗CD3和抗CD4抗体进行标记，并上机进行流式分析，以确认获得的是纯净的CD4阳性T细胞群体。以下是我们刚刚离心后的细胞，这应该是一群纯度较高的CD3、CD4阳性T细胞。刚才我向您展示了针对 CD4 阳性 T 细胞的阴性筛选。使用 Miltenyi Biotec 的试剂盒，我们将把这些细胞过继转移至小鼠体内，并用于我们自身的 T 光子与机器实验之一。祝您自己的实验顺利成功。

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从小鼠小肠免疫系统中分离淋巴细胞

本文介绍了一种通过磁性细胞分选法从小鼠脾脏中分离树突状细胞，并将其过继转移至未致敏小鼠的实验方案。选用高盐激活的树突状细胞模型，以详细说明过继转移及流式细胞术的各个操作步骤。...

高盐处理抗原提呈树突状细胞的分离与过继性转移

双光子成像已揭示了在基础状态及免疫应答过程中淋巴结内淋巴细胞的运动性及细胞间相互作用1。本文中，我们展示了T细胞的过继转移、淋巴结的分离，以及离体淋巴结中CD4+...

小鼠外周淋巴结的解剖与双光子成像

学习使用美天旎MACS试剂盒从小鼠淋巴结中分离高纯度CD4+ T细胞。本方法采用阴性选择技术，可获得纯度≥96%的淋巴细胞，适用于免疫学研究和下游细胞培养实验。

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