使用 Miltenyi MACS 分离法从小鼠淋巴结中分离 CD4+ T 细胞

这是一个Max MIDI磁铁，上面写着：注意，磁场极强。大家好，我是来自加州大学欧文分校生理学与生物物理学系Mike Collins实验室的Melanie Matthew。

今天我们将向您展示如何使用Milton Biotechnology试剂盒，通过阴性筛选法分离制备CD4阳性T细胞。这里我们有minimax和minimax磁铁装置，其中minimax用于较大体积的细胞分离，可在minimax装置中使用适配的分选柱处理多达10的9次方个细胞，而minimax则适用于细胞数量较少的小体积样本。

因此，根据您是进行阳性分离还是阴性分离，您需要使用相应的抗体标记您的细胞。这些抗体带有磁珠，可与磁铁结合。在阴性筛选的情况下，您感兴趣的细胞将流过柱子，您可以收集流出液，其中将含有您感兴趣的细胞。

我需要说明的是，今晚向您展示的技术并非无菌操作。因此，如果您希望将这些细胞用于细胞培养，应使用无菌器械并在组织培养罩内完成所有操作。因此，尽管我向您展示的是CD4阳性T细胞的制备方法，但其中许多技术同样适用于利用美天旎生物技术公司的试剂盒分离其他类型的细胞。

好的，我已经从小鼠体内取出淋巴结，并在JoVE第七期“双光子成像用淋巴结制备”中详细演示了该操作步骤。现在，我将把淋巴结在70微米细胞筛中研磨成单细胞悬液。好的，接下来我将使用一个6毫升注射器的末端，将淋巴结研磨成单细胞悬液。

淋巴结位于滤器内的RPMI培养基中，制备合适的单细胞悬液非常重要。使用滤器的原因是确保没有细胞团块。因此，当我完成研磨后，将把滤器从培养基中取出，收集滤过筛网的液体，从而获得单细胞悬液。

研磨时，需确保尽可能充分破坏所有组织。这种单细胞悬液将用于后续分离纯化CD4阳性T细胞。好的，现在我已经完成组织研磨，可以看到大部分淋巴结组织已基本消失。

我们这里仍然有一些小块的脂肪组织，以及来自六个淋巴结的淋巴结被膜碎片，还带有一些结缔组织，它们全部粘连在一起。现在我移除细胞滤网。你们可以看到，培养基非常浑浊。

加入单细胞悬液中的细胞，以确保从滤膜上获得最大数量的细胞，其中部分细胞会黏附在滤膜上。我用几毫升培养基洗涤滤膜，然后将所有培养基用移液器转移至15毫升Falcon管中，随后离心以沉淀细胞，用于后续纯化。因此，这是我得到的单细胞悬液，已在300 × g离心10分钟，细胞已沉淀。

如果你认为单细胞悬液中死细胞比例较高，建议使用 Miltenyi 的死细胞去除试剂盒。现在我已经将细胞沉淀下来，接下来会弃去上清液，进行红细胞裂解，然后对细胞进行计数，并对这些特定细胞使用 CD4 阳性 T 细胞阴性筛选试剂盒。好的，现在我将进行红细胞裂解。

我们将通过降低溶液的渗透压来裂解已沉淀的红细胞以及淋巴细胞，首先加入水，然后通过添加10倍浓度的D-B-P-S将溶液恢复至1倍浓度。我们的淋巴细胞对渗透压变化的耐受性比红细胞更强，但我们仍需快速操作，否则也会裂解淋巴细胞，而这并非我们所希望的。快速操作的一部分是，我会在实际向体系中加水之前，预先准备好裂解过程所需的各种体积液体。

因此，在加入水后几秒钟内，我需要加入10倍浓度的D-B-P-S，以确保不会裂解淋巴细胞，同时选择性地裂解红细胞。我取900微升水，几乎达到1毫升，再加入100微升的10倍浓度D-B-P-S。

我已经准备好两根移液管。在裂解过程中，我先加入水，等待几秒钟，可能轻轻摇动一下离心管，然后加入10×DBPS，再稍微多摇动几次。如果你裂解的样本中含有大量红细胞，你会看到由破碎的细胞膜聚集形成的较大块状无定形沉淀物。

我们这里有一点，可以看到存在一些破碎的细胞膜。因此，在完成裂解后，以防移液过程中出现任何误差，我喜欢向细胞中加入几毫升培养基，以确保渗透压正确，从而不再继续发生裂解。好的，现在我已经获得了单细胞悬液的淋巴细胞。

再次进行红细胞裂解后，我将离心样品以沉淀细胞。在进行这一步之前，我需要使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定在CD4阳性T细胞阴性筛选试剂盒中需要加入的抗体用量。好的，现在我已将细胞在Max缓冲液中离心，可以看到，经过红细胞裂解后，沉淀物明显变得更白。

我将对CD4阳性T细胞进行阴性筛选。因此，我会倒掉所有培养基以及用于沉淀细胞的Max缓冲液，然后使用生物素标记的抗体混合物进行标记，这是CD4阳性T细胞阴性筛选的第一步。

然后我在冰箱中孵育10分钟。好的，我的细胞已完成初始孵育。现在我将抗生素加入微珠中，并将它们放回冰箱中继续孵育15分钟。

对于此次特定的细胞分离，我们使用 Miltenyi Biotec 公司的 LS 分离柱。首先，将其置于磁力架上，并用 3 mL 的 MACS 缓冲液冲洗分离柱以进行预处理。接下来，打开分离柱并将其放置在磁力架上，使柱体的卡脚朝内插入磁铁中。现在，我将向分离柱中加入 MACS 缓冲液，您会看到液体沿 LS 分离柱流下，并开始从底部滴出。无需担心分离柱是否会流干。

液体的表面张力会防止其流干，直到您加入细胞为止。在加入细胞之前，必须让MAX缓冲液完全通过柱子。好的，在与生物素磁珠共同孵育15分钟后，这些磁珠已结合到细胞和MAX缓冲液中，接下来我将倒掉缓冲液，并用适量缓冲液重悬细胞，缓冲液的体积需根据细胞数量进行调整。

因此，您需要查阅相应的微量实验方案。然后，我将把细胞悬液加入到刚刚用Max缓冲液冲洗过的层析柱中。现在，我们将细胞悬液加入层析柱。

由于这是一个负向筛选柱，我们将收集流穿的细胞，这些细胞在此情况下应全部为CD4阳性T细胞。接下来，我将用12毫升MACS缓冲液洗涤柱子，同样收集流出液，其中应只含有CD4阳性T细胞。现在，我将离心沉淀CD4阳性T细胞，重悬细胞，然后用适合tau成像的相应染料进行标记。

我还将取少量已纯化的细胞样本，用抗CD3和抗CD4抗体进行标记，并通过流式细胞术分析，以确认获得的是高纯度的CD4阳性T细胞。以下是刚刚离心沉淀后的细胞情况，应为一群高纯度的CD3、CD4阳性T细胞。

刚才我向您展示了如何对 CD4 阳性 T 细胞进行阴性筛选。接下来，我们将使用 Miltenyi Biotec 的试剂盒，将这些细胞过继性地转移至小鼠体内，并用于我们自身的 T 光子与机器实验之一。祝您自己的实验顺利成功。