Name: 突触荧光自动定量 C。线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 学习使用共聚焦成像和自动化分析技术对秀丽隐杆线虫突触荧光信号进行三维定量。该方法可在单样本中快速表征数百个突触，最大限度减少Z轴投影失真，为神经科学研究提供高效工具。

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作者感谢 A. Benham 在本实验方案开发过程中的协助。本研究由 NIH 基金项目 NS06747 资助，授予 B. A. B.。

1. 成像用线虫的制备
本实验方案的这一部分基于已发表的 C. elegans 培养技术1,2，并在图1中进行了概述。
<ol>
	<li>在接种了NA22的大肽胨NGM琼脂平板（10 cm）上培养线虫 E. coli 细菌直至几乎耗尽营养。若进行免疫染色，一个培养板通常可提供足够用于单次染色的线虫数量，此估算已考虑实验过程中的损耗以及为成像而筛选线虫所采用的严格标准（见第2部分）。</li>
	<li>通过倒入几毫升 ddH₂O 收集线虫20 接种到平板上，轻轻涡旋，将液体倒入 15 ml 圆锥管中（如有必要，重复操作以转移大部分线虫）。在临床离心机中以 1000 × g 离心 3 分钟，收集沉淀。用 ddH₂O 洗涤沉淀 1–3 次2O，直至上清液澄清，以去除残留细菌。使用聚丙烯移液管移除上清液，因为线虫会黏附于玻璃表面（从这一步开始，必须尽量减少各步骤之间的时间，以避免卵活力下降）。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将线虫沉淀重悬于5 ml碱性次氯酸盐溶液中，以裂解线虫并释放虫卵。轻轻摇动，并每隔约1分钟在体视显微镜下观察试管。当约50%的线虫被裂解（表现为弯曲且破裂打开）时，立即用卵缓冲液（Egg Buffer）加满试管，反复倒置数次，于1000×g离心3分钟，终止裂解反应。裂解时间不得超过5分钟。</li>
	<li>用移液管吸除上清液，并用卵缓冲液将沉淀洗涤3次。</li>
	<li>用去离子水配制的30%蔗糖溶液作为垫层，使卵漂浮以分离杂质2O：步骤1.4最后一次洗涤后，小心移除上清液，并将沉淀重悬于5 ml ddH₂O中。20. 加入5 ml无菌60%蔗糖溶液至ddH₂O中2O，并充分混匀。在临床离心机中以1000×g离心6分钟。虫卵将聚集在液面弯月面处（呈浑浊外观），而杂质则形成沉淀。</li>
	<li>使用塑料移液管吸取最小体积的卵，并转移至未接种的NGM琼脂平板上。附着在管壁上的卵可轻轻用液体冲洗下来并一同转移。每种品系分析使用一个10 cm的未接种平板即可。</li>
	<li>将未接种的培养板与卵在约16小时（过夜）内于 20 °C将培养皿盖略微打开数小时以通风干燥，最初几小时内需注意通风，但过夜时务必盖好。</li>
	<li>孵化后，将L1幼虫转移至含有S Basal的15 ml锥形管中（向培养板中加入几毫升S Basal，轻轻旋转混匀，然后倒入管中）。在临床离心机中离心沉淀（3分钟，1000×g），用少量S Basal重悬，转移至接种了NA22细菌的10 cm NGM琼脂平板。步骤1.1中的每块原始平板对应使用此处的2块平板。培养至线虫达到所需年龄。</li>
	<li>每天观察培养物一至两次。若发现线虫有饥饿风险，应转移至新鲜的NA22平板。对于野生型N2线虫，饥饿发生前会出现一条线状或波浪状的群体迁移现象，即大量个体成群结队地从食物耗尽区域向边缘移动。一旦出现此现象，数小时内食物将被完全耗尽。</li>
	<li>线虫现已准备好进行免疫染色或活体成像。在悬浮状态下固定和染色线虫是最佳方法，因为可轻松地对大量完整的线虫进行成像。染色步骤基于Finney和Ruvkun实验方案。3-6 优于冷冻裂解法，因为成像需要大量线虫。</li>
</ol>
2. 共聚焦成像
<ol>
	<li>将线虫固定在载玻片上进行共聚焦成像。调整线虫密度至每微升数百条。在S-basal溶液中制备2%琼脂糖垫，并在其周围用细圈凡士林密封（通过连接剪去针尖的25号针头的3 ml注射器涂抹），以防止成像过程中液体蒸发。取数微升线虫悬液滴加到盖玻片上（若对活体线虫成像，需加入麻醉剂），然后将琼脂糖垫轻轻盖在盖玻片上，使线虫在垫上均匀分散。</li>
	<li>选择用于成像的线虫。应挑选目标突触朝向物镜方向、径向偏移角度不超过±45°的个体（0°表示完全正对物镜）。评估过程应迅速完成（数秒内），以避免光漂白。初始培养规模已优化，以确保有足够数量的线虫满足此类几何条件。</li>
	<li>完成样本的共聚焦成像。对于较为扁平的样本，若其厚度可在约14层、每层0.4 μm的Z轴切片范围内覆盖，则可获得最佳成像效果。高速、低分辨率图像（512 × 512像素）已足以实现快速且准确的数据采集。避免因信号过强导致探测器饱和，否则将低估荧光信号强度。</li>
</ol>
3. 突触簇的自动识别与分析
<ol>
	<li>使用 Volocity 4.0（或更高版本）软件（PerkinElmer）打开共聚焦显微镜的多通道 TIF 输出文件。</li>
	<li>裁剪掉图像中不包含目标结构的区域（图像 -> 扩展焦面 -> 使用“自由手选区”工具选择感兴趣区域 -> 操作 -> 裁剪至选区；图 2A）。注意：扩展焦面功能会在计算机屏幕上生成一个 z 平面投影以辅助分析，但不会影响底层数据；亮度和对比度的调整（如有必要）也是如此。</li>
	<li>使用线条工具测量所分析区域的长度。线条的长度将被自动计算并添加到数据表中（图 2B）。</li>
	<li>使用“基于强度的对象”滤波器（测量模式）识别对象。设定阈值，使突触簇被高亮显示，而非突触背景不被包含（图 2C）。若使用另一种颜色标记的独立突触标志物，可能有助于明确识别突触。典型的突触大小范围为几个至几百个体素。应首先使用对照样本设定一次阈值，并在所有后续样本中保持一致。不得对每个样本单独进行阈值设定，以免引入实验者偏差。对象将被自动选中并列入表格（图 2D）。</li>
	<li>整理并导出数据。剔除体积为2个或更少体素的对象，因其通常为背景噪点。这些对象可通过进一步过滤或在后续分析中去除。为便于下游处理时清除，可按“对象大小”对数据文件重新排序，使此类对象集中排列。将数据导出为 CSV 格式，可用 Microsoft Excel 或其他电子表格程序打开。每幅图像生成一个输出文件。</li>
	<li>若无法使用 Volocity 软件，也可采用其他方法分析共聚焦数据的 z 平面投影（例如参考文献7，或使用 ImageJ 进行手动分析），但会丢失三维信息（见讨论部分）。</li>
</ol>
4. 代表性结果
所介绍的定量方法应能够区分不同亮度和不同体积的簇状群体。图3中展示的代表性图像及相应的定量数据，说明了基于这些参数进行区分的示例。通常情况下，结果应与肉眼观察到的现象一致。以秀丽隐杆线虫（C. elegans）腹神经索中UNC-49 GABA受体免疫染色为例，所有个体通常在大小和成熟度上非常相似，对五条线虫群体的总突触荧光值（归一化至所分析神经索的长度）进行统计，其标准误约为均值的10%4。基因突变及其他实验处理（如药物暴露）不仅可能改变突触簇的体积和强度值及其频率分布，还可能影响线虫的发育时间进程和同步性，从而导致变异性升高。然而，定量结果应始终反映肉眼可识别的观察结果；若不一致，则应通过检查图像以及Volocity软件识别出的对象，定位错误来源，并采取相应的纠正措施，例如重新设定阈值或剔除人为假象对象。
<img alt="秀丽隐杆线虫生命周期实验流程图：培养、卵收集、生长、显微镜样品制备。" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 同步化 C. elegans 培养物的制备。 通过该流程可获得同步化培养物，因为 C. elegans 在缺乏食物时发育停滞于L1幼虫阶段，而在提供食物后发育恢复。
<img alt="神经索分析示意图；步骤包括选择、阈值设定、长度测量、数据整理。" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 突触斑点的定量分析。
<ol class="ualpha">
	<li>裁剪图像的无关区域以减小文件大小并提高特异性。左侧图显示原始图像，中间图显示选定区域，右侧图显示裁剪后的图像。红色信号为UNC-49 GABA受体免疫荧光信号，绿色信号为在突触前GABA能神经元中表达的突触小泡相关蛋白synaptobrevin-GFP（一种突触前标记物）4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。</li>
	<li>沿待分析的神经索片段长度绘制一条线，其长度将自动记录在结果表中。该信息对于标准化突触数据至关重要，因为可分析神经索的长度在染色过程中若线虫发生断裂可能会有数倍差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。</li>
	<li>应用阈值以识别单个突触簇。左侧面板显示阈值处理前的图像；不同阈值水平的示例分别显示在不同面板中（绿色信号已省略）。每个被识别的对象在图像上以彩色区域标出。请注意最左侧面板中肉眼可见的突触簇与最右侧面板中彩色区域之间的一致性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。</li>
	<li>每个被识别的对象在结果表中单独列出。可根据需要选择并高亮显示图像上的各个对象以便检查。请注意，表格中包含红色（“罗丹明”）和绿色（“EGFP”）通道的信息；但由于对象的识别完全基于红色荧光，绿色通道的信息可能具有误导性。该分析也可在单色图像上进行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。</li>
</ol>
<img alt="神经元荧光比较；蝇蕈醇处理；柱状图、累积图；突触分析。" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 代表性结果。 野生型 C. elegans 在使用蝇蕈醇（一种GABA受体激动剂）处理前后，对UNC-49 GABA受体进行染色所获得的代表性显微图像（A为处理前，B为处理后）。长时间暴露于该激动剂会导致受体下调。图中显示的是在阈值化处理并去除微小背景斑点前后裁剪过的图像（左侧为处理前，右侧为处理后）。（C）展示（A）和（B）中样本的定量突触参数图：总荧光强度标准化至神经索长度（左图），以及单个突触荧光含量（中图）和突触体积（右图）的累积概率直方图，结果表明激动剂暴露显著降低了突触含量和体积（未处理组 n = 60 个突触，蝇蕈醇处理组 n = 115 个突触；p &lt; 0.001，Kolmogorov-Smirnov 检验 <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html</a>）。

<ol><li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li>
<li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li>
<li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li>
<li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent%2C+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li>
<li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2%2B+entry+into+the+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述方法旨在从秀丽隐杆线虫（C. elegans）的大群体突触中提取定量的多参数数据，同时最大限度地提高处理组内的实验一致性。该目标的实现依赖于三个关键特征。首先，免疫染色在同步发育的线虫群体中进行，以确保所有个体处于相同的发育年龄。这一步骤至关重要，因为发育过程中表达水平的调控可能会掩盖实验处理的实际效应（例如，UNC-49 GABA受体的免疫荧光信号在发育过程中可变化数倍（K. Davis 等，正在准备中））。此外，固定和通透处理的效果可能存在高度变异性，从而影响定量比较的可靠性。使用同步培养的线虫可显著降低这种固有的变异性，提高技术的可重复性。其他应对该变异性的方法包括使用针对无关靶标的第二抗体作为独立可视化的内部对照，以评估通透效率，或在活体线虫中成像GFP标记的蛋白，从而完全避免通透步骤。然而，后一种方法会引入新的问题，因为不再直接测量内源性蛋白，需考虑由转基因表达水平或拷贝数不一致、GFP融合导致的结构改变，或非生理性的转基因表达水平所引起的潜在假象。目前尚无任何单一方法是完美的；理想情况下，应通过多种方法获得相互支持的数据。在本实验方案中，起始培养物的规模已优化，以获得足够数量的固定...

<table><tbody><tr><td>Volocity v4.0 或更高版本</td><td>PerkinElmer/Improvision</td><td></td><td>请查询您所在单位的影像核心设施是否提供该软件。PerkinElmer 官网提供演示版软件。本方法仅需使用 Volocity 的定量分析模块。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;表 2. &lt;/strong&gt; 特异性试剂与设备&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;卵缓冲液&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;NaCl&lt;br/&gt; KCl&lt;br/&gt; CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; HEPES&lt;br/&gt; （调节 pH 至 7.3）&lt;/td&gt; &lt;td&gt;118 mM&lt;br/&gt; 48 mM&lt;br/&gt; 2 mM&lt;br/&gt; 2 mM&lt;br/&gt; 24 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;碱性次氯酸盐（5 ml）&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;新鲜家用漂白剂（开瓶后30天内使用，过期丢弃）&lt;br/&gt; 10 N NaOH&lt;br/&gt; ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.0 ml 0.25 ml&lt;br/&gt; 3.75 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;表1. &lt;/strong&gt; 溶液。&lt;/span&gt;</td></tr></tbody></table>

c. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

突触强度是指突触前神经递质释放事件在突触后膜上引发的突触后反应的幅度，对整个神经环路功能具有重要影响。突触强度在很大程度上取决于突触后膜突触部位聚集的神经递质受体的数量。受体水平在发育过程中建立，并可通过定位于细胞表面、突触下区及细胞内储存池之间的受体转运进行调节，这是突触可塑性和神经调制的重要机制。严格量化突触局部神经递质受体丰度的方法对于研究突触发育和可塑性至关重要。荧光显微镜是一种理想的方法，因为它能够保留空间信息，区分突触与非突触区域的受体池，并可分辨定位于不同类型突触的受体群体。遗传模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）特别适用于此类研究，因其神经系统体积小、结构相对简单，且具有通透性，加之拥有强大的遗传操作技术，可在完整动物体内研究天然突触。
本文介绍一种用于定量分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）中荧光标记的突触神经递质受体的方法。该方法的核心特点是对多平面共聚焦显微镜输出文件中的单个突触进行三维自动化识别与分析，为每个突触分别统计其位置、体积、荧光强度以及总荧光量。与对手动分析共聚焦数据z平面投影的方法相比，本方法具有两个主要优势：第一，由于包含了共聚焦数据集的每一个成像平面，避免了基于像素强度平均值或最大值的z平面投影所导致的数据丢失；第二，突触的识别过程实现了自动化，同时实验人员可在数据分析过程中随时检查识别结果，从而实现从大量突触中快速而准确地提取数据。每份样本可轻松获得数百至数千个突触的数据，生成大规模数据集以最大限度提高统计效能。本文还讨论了在制备用于分析的 C. elegans 样本以及进行共聚焦成像时需注意的因素，以尽量减少同一处理组内个体之间的变异。尽管该方法最初用于分析 C. elegans 的突触后受体，但它普遍适用于任何定位于突触部位的蛋白质，或实际上任何定位于离散簇状结构、点状结构或细胞器中的荧光信号。
该实验分为三个步骤进行：1）样品制备，2）共聚焦成像，3）图像分析。步骤1和2针对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的具体操作，而步骤3可普遍适用于共聚焦显微图像中任何点状荧光信号的分析。

突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C. elegans）中荧光标记的神经递质受体进行三维定量，从而在单个样品中快速表征数百个突触，且避免了z平面投影所引入的畸变。

C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

突触强度是指突触前神经递质释放事件所引发的突触后反应的幅度，对整体神经活动具有重要影响……

本实验的目的是高效地定量分析斑点状荧光信号在 gans 中的尺寸和亮度，从而能够对大量目标物进行统计学分析，特别是突触蛋白的成像。在本演示中，实验的第一步是制备目标秀丽隐杆线虫（ELEGANS）的高密度同步培养物。接下来，获取标记突触的共聚焦图像，尽量减少图像中一对一的变异。突触荧光斑点将被自动识别，并与背景荧光区分开来。最后一步是将数据制表并进行整理，以便高效地进行下游分析。最终结果能够准确显示实验条件如何影响突触蛋白或其他定位于高对比度点状结构的蛋白的分布。该技术相较于现有方法（如Zack投影分析）的主要优势在于，所有数据均被完整保留，包括突触体积信息，且自动化识别可实现每种条件下数百个样本的快速采集。已验证。本实验方案需要在直径10厘米的高肽NGM琼脂平板上培养的成年CL线虫高密度培养物，平板上使用NA22大肠杆菌作为食物来源，每种计划进行的免疫染色需准备一块平板。首先，用几毫升水收集线虫，转移至15毫升锥形管中，并重复此过程，直至收集到大部分线虫。离心收集线虫，并用水洗涤沉淀物，最多重复三次，直至上清液变澄清。此步骤可去除残留的细菌。始终使用塑料移液管转移可能含有或确实含有线虫或虫卵的溶液，因为线虫或虫卵会黏附在玻璃器皿上。接下来必须迅速完成后续所有步骤，以防止虫卵活力丧失。将线虫放入5 mL碱性次氯酸盐溶液中，通过反复弯曲线虫使其释放虫卵。轻轻摇动试管，每隔约一分钟在解剖显微镜下观察一次。5分钟后，或当试管中约一半线虫出现弯曲并破裂时，即可停止。用卵缓冲液将离心管加满至管口，反复倒置数次。离心后吸弃上清液，再用卵缓冲液将沉淀洗涤三次。洗涤后，Reese 将沉淀重悬于 5 mL 水中，随后加入 5 mL 无菌水中的 60% 蔗糖溶液，充分混匀。离心形成沉淀后，虫卵将位于液面弯月面处，呈浑浊状。将每次收集的卵分别转移至未接种的大肠杆菌的10厘米NGM琼脂平板上。可使用水冲洗将样品转移至平板，但应尽量减少液体的转移量。将平板在20摄氏度下孵育过夜，最初几小时需对平板进行通风处理，即将皿盖略微打开，但需确保过夜时盖好皿盖。孵化后，将L1幼虫转移至含有S basil的15毫升锥形管中。离心收集L1幼虫，并用少量S basil重悬。随后将每份L1样品分别接种到两个接种了NA22细菌的10厘米NGM琼脂平板上。每天观察培养物一至两次。如果发现其有饥饿危险，则需在培养物因饥饿而出现II型聚集线并成波浪状远离食物耗尽区域之前，将其转移至新鲜的NA22平板上；否则，这些平板上的食物将在数小时内被完全耗尽。当线虫达到所需年龄时，即可进行免疫染色或活体成像以制备样本。进行共聚焦显微成像时，使用 Antifa 封片介质将线虫密度调整至每微升数百条。随着经验的积累，可通过悬液的浑浊度来判断该密度。理想情况下，线虫在显微镜载玻片上应密集排列，但不过度重叠。在载玻片上，用ESP培养基中的2%琼脂制成一个垫状物，并在其周围用凡士林形成一圈薄环。为防止成像过程中液体蒸发，使用装有截断的25号针头的3毫升注射器涂抹凡士林。现在用剪去末端的移液枪头吸取数微升线虫悬液，滴加到盖玻片上，以避免损伤线虫，随后将琼脂糖垫轻轻放置在盖玻片上，在显微镜下使线虫均匀分散于垫上。感兴趣的突触应调整方向，使其直接朝向物镜或与物镜轴线夹角在45度以内。在此步骤停留几秒钟，以避免光漂白。培养条件应提供足够数量的线虫，以满足此处所示的严格标准，即理想方向为腹神经索正对物镜。下一个样本将被排除，因为其腹神经索方向完全背离物镜。请注意，在该样本中，背侧神经索朝向物镜，因此产生的图像聚焦更清晰。再看另一个样本，由于背侧和腹侧神经索位于蠕虫边缘，因此会被拒用。因为激发光和发射光必须穿过更多的蠕虫组织，导致图像失真。主要挑战在于尽量减少处理组内的变异性，而年龄同步化以及选择目标结构正对物镜的线虫会起到很大帮助。从较大规模的培养开始，可以增加可选的线虫数量，从而实现最大程度的一致性。为了获得最佳成像效果，应选择相对扁平的样本，使其能够包含在14层或更少的图像堆栈中。0.4 微米厚切片。高速、低分辨率图像足以实现快速准确的数据采集。避免因信号过强导致探测器饱和，否则将低估荧光信号。本演示使用 commercially available software package velocity，其版本需至少为 4.0。许多其他软件选择会丢失三维信息。打开共聚焦显微镜输出的多通道 tiff 文件后，选择图像，然后选择扩展焦面，再选择自由绘制。ROI 现在会裁剪掉图像中不包含目标结构的区域。使用激活的工具，扩展聚焦可提供 Z 平面投影，以方便 ROI 的选择。这不会影响底层数据。同样，亮度和对比度的调整不会影响底层数据。通过选择“操作”并裁剪至选定区域来完成裁剪。接下来，测量所分析区域的长度。使用线条工具，将计算线条的长度并将其添加到数据表中。现在，在测量模式下，使用基于强度的物体识别功能来识别物体。引入一种用独特颜色标记的独立突触标志物，有助于明确识别突触；设定一个阈值，使突触簇被高亮显示，而非突触的背景信号则不被标记。仅使用对照样本进行一次操作，并将此结果用于所有后续样本；对每个样本分别设置阈值是不可接受的，因为这会引入实验者偏倚的风险。对象将被自动选中并生成表格。典型的突触在导出数据前大小范围为几个至几百个体素，导出前请按对象大小对数据进行排序。这有助于后续去除通常仅为背景噪点的两个或更少体素的对象。现在，将数据导出为 CSV 格式，任何电子表格程序均可打开。每张图像生成一个输出文件，用于分类和导出显示腹神经索中 49 个 GABA 受体的 CL gans 显微图像，这些图像由所述方案生成。所有动物在体型和成熟度上均表现出高度相似。对五条蠕虫的总突触荧光值进行了归一化处理，以分析的神经索长度为基准。该数据的均值标准误约为10%。左侧图像为未经阈值处理和背景杂点去除的原始图像。突触经蝇蕈醇（muscarine）处理，这是一种GABA受体激动剂，长期暴露可导致受体下调。总荧光强度被量化后，按神经索长度进行归一化处理，并以累积概率表示。计算了单个突触荧光强度的直方图，同样也计算了突触体积的直方图。这些测量结果表明，激动剂暴露显著降低了突触内容物和突触体积。总体而言，定量结果应始终反映肉眼可观察到的内容。如果结果不符合，应通过检查图像及由速度识别出的对象来确定错误发生的位置，并提示相应的纠正措施，例如调整阈值或去除伪影。在进行该操作时，应尽可能根据线虫的几何取向而非主观判断图像质量来选择用于成像的个体，强烈推荐采用盲法评分。

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突触荧光自动定量<em&gt; C。线虫</em

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