C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

本实验的目的是高效地定量分析斑点状荧光信号在 gans 中的尺寸和亮度，从而能够对大量目标物进行统计学分析，特别是突触蛋白的成像。

在本演示中，实验的第一步是制备目标秀丽隐杆线虫（ELEGANS）的高密度同步培养物。接下来，获取标记突触的共聚焦图像，尽量减少图像中一对一的变异。突触荧光斑点将被自动识别，并与背景荧光区分开来。

最后一步是将数据制表并进行整理，以便高效地进行下游分析。最终结果能够准确显示实验条件如何影响突触蛋白或其他定位于高对比度点状结构的蛋白的分布。该技术相较于现有方法（如Zack投影分析）的主要优势在于，所有数据均被完整保留，包括突触体积信息，且自动化识别可实现每种条件下数百个样本的快速采集。已验证。

本实验方案需要在直径10厘米的高肽NGM琼脂平板上培养的成年CL线虫高密度培养物，平板上使用NA22大肠杆菌作为食物来源，每种计划进行的免疫染色需准备一块平板。首先，用几毫升水收集线虫，转移至15毫升锥形管中，并重复此过程，直至收集到大部分线虫。

离心收集线虫，并用水洗涤沉淀物，最多重复三次，直至上清液变澄清。此步骤可去除残留的细菌。始终使用塑料移液管转移可能含有或确实含有线虫或虫卵的溶液，因为线虫或虫卵会黏附在玻璃器皿上。接下来必须迅速完成后续所有步骤，以防止虫卵活力丧失。

将线虫放入5 mL碱性次氯酸盐溶液中，通过反复弯曲线虫使其释放虫卵。轻轻摇动试管，每隔约一分钟在解剖显微镜下观察一次。5分钟后，或当试管中约一半线虫出现弯曲并破裂时，即可停止。

用卵缓冲液将离心管加满至管口，反复倒置数次。离心后吸弃上清液，再用卵缓冲液将沉淀洗涤三次。

洗涤后，Reese 将沉淀重悬于 5 mL 水中，随后加入 5 mL 无菌水中的 60% 蔗糖溶液，充分混匀。离心形成沉淀后，虫卵将位于液面弯月面处，呈浑浊状。

将每次收集的卵分别转移至未接种的大肠杆菌的10厘米NGM琼脂平板上。可使用水冲洗将样品转移至平板，但应尽量减少液体的转移量。将平板在20摄氏度下孵育过夜，最初几小时需对平板进行通风处理，即将皿盖略微打开，但需确保过夜时盖好皿盖。

孵化后，将L1幼虫转移至含有S basil的15毫升锥形管中。离心收集L1幼虫，并用少量S basil重悬。随后将每份L1样品分别接种到两个接种了NA22细菌的10厘米NGM琼脂平板上。

每天观察培养物一至两次。如果发现其有饥饿危险，则需在培养物因饥饿而出现II型聚集线并成波浪状远离食物耗尽区域之前，将其转移至新鲜的NA22平板上；否则，这些平板上的食物将在数小时内被完全耗尽。

当线虫达到所需年龄时，即可进行免疫染色或活体成像以制备样本。进行共聚焦显微成像时，使用 Antifa 封片介质将线虫密度调整至每微升数百条。

随着经验的积累，可通过悬液的浑浊度来判断该密度。理想情况下，线虫在显微镜载玻片上应密集排列，但不过度重叠。在载玻片上，用ESP培养基中的2%琼脂制成一个垫状物，并在其周围用凡士林形成一圈薄环。

为防止成像过程中液体蒸发，使用装有截断的25号针头的3毫升注射器涂抹凡士林。现在用剪去末端的移液枪头吸取数微升线虫悬液，滴加到盖玻片上，以避免损伤线虫，随后将琼脂糖垫轻轻放置在盖玻片上，在显微镜下使线虫均匀分散于垫上。感兴趣的突触应调整方向，使其直接朝向物镜或与物镜轴线夹角在45度以内。

在此步骤停留几秒钟，以避免光漂白。培养条件应提供足够数量的线虫，以满足此处所示的严格标准，即理想方向为腹神经索正对物镜。下一个样本将被排除，因为其腹神经索方向完全背离物镜。

请注意，在该样本中，背侧神经索朝向物镜，因此产生的图像聚焦更清晰。再看另一个样本，由于背侧和腹侧神经索位于蠕虫边缘，因此会被拒用。因为激发光和发射光必须穿过更多的蠕虫组织，导致图像失真。

主要挑战在于尽量减少处理组内的变异性，而年龄同步化以及选择目标结构正对物镜的线虫会起到很大帮助。从较大规模的培养开始，可以增加可选的线虫数量，从而实现最大程度的一致性。为了获得最佳成像效果，应选择相对扁平的样本，使其能够包含在14层或更少的图像堆栈中。

0.4 微米厚切片。高速、低分辨率图像足以实现快速准确的数据采集。避免因信号过强导致探测器饱和，否则将低估荧光信号。

本演示使用 commercially available software package velocity，其版本需至少为 4.0。许多其他软件选择会丢失三维信息。打开共聚焦显微镜输出的多通道 tiff 文件后，选择图像，然后选择扩展焦面，再选择自由绘制。

ROI 现在会裁剪掉图像中不包含目标结构的区域。使用激活的工具，扩展聚焦可提供 Z 平面投影，以方便 ROI 的选择。这不会影响底层数据。

同样，亮度和对比度的调整不会影响底层数据。通过选择“操作”并裁剪至选定区域来完成裁剪。接下来，测量所分析区域的长度。

使用线条工具，将计算线条的长度并将其添加到数据表中。现在，在测量模式下，使用基于强度的物体识别功能来识别物体。引入一种用独特颜色标记的独立突触标志物，有助于明确识别突触；设定一个阈值，使突触簇被高亮显示，而非突触的背景信号则不被标记。

仅使用对照样本进行一次操作，并将此结果用于所有后续样本；对每个样本分别设置阈值是不可接受的，因为这会引入实验者偏倚的风险。对象将被自动选中并生成表格。典型的突触在导出数据前大小范围为几个至几百个体素，导出前请按对象大小对数据进行排序。

这有助于后续去除通常仅为背景噪点的两个或更少体素的对象。现在，将数据导出为 CSV 格式，任何电子表格程序均可打开。每张图像生成一个输出文件，用于分类和导出显示腹神经索中 49 个 GABA 受体的 CL gans 显微图像，这些图像由所述方案生成。

所有动物在体型和成熟度上均表现出高度相似。对五条蠕虫的总突触荧光值进行了归一化处理，以分析的神经索长度为基准。该数据的均值标准误约为10%。

左侧图像为未经阈值处理和背景杂点去除的原始图像。突触经蝇蕈醇（muscarine）处理，这是一种GABA受体激动剂，长期暴露可导致受体下调。总荧光强度被量化后，按神经索长度进行归一化处理，并以累积概率表示。

计算了单个突触荧光强度的直方图，同样也计算了突触体积的直方图。这些测量结果表明，激动剂暴露显著降低了突触内容物和突触体积。

总体而言，定量结果应始终反映肉眼可观察到的内容。如果结果不符合，应通过检查图像及由速度识别出的对象来确定错误发生的位置，并提示相应的纠正措施，例如调整阈值或去除伪影。在进行该操作时，应尽可能根据线虫的几何取向而非主观判断图像质量来选择用于成像的个体，强烈推荐采用盲法评分。