突触荧光自动定量 C。线虫

该程序的目的是有效地量化 gans 中点状荧光信号的尺寸和亮度。因此，可以分析大量对象。对突触蛋白进行统计成像。

在本演示中，该程序的第一步是生成目标 ELEGANS 的高密度同步培养物。接下来，获得标记突触的共聚焦图像，最大限度地减少图像的一对一变异性。突触穿刺被自动识别并与背景荧光区分开来。

最后一步是将数据制成表格并组织起来，以便进行高效的下游分析。最终，结果可以准确显示实验条件如何影响突触蛋白或定位于高对比度穿刺的任何其他蛋白质的分布。与现有方法（如 Zack 投影分析）相比，该技术的主要优点是保留了所有数据，包括突触体积和自动识别允许在每种条件下快速收集数百个样本。测试。

该方案要求在 NA 22 e 大肠杆菌上的 10 厘米高肽 NGM 琼脂平板中生长的成年 CL 伊根蠕虫的高密度培养物为计划的每种免疫染色准备了一个板。首先收获蠕虫和几毫升水。将它们转移到 15 毫升锥形管中，并重复此过程，直到收集到大部分蠕虫。

蠕虫沉淀并用水洗涤沉淀最多 3 次，直到滑沙澄清。这样可以去除残留的细菌，始终使用塑料移液器转移可能或确实含有蠕虫或虫卵的溶液，因为它们会粘在玻璃上。现在至关重要的是迅速完成其余步骤以防止种蛋活力损失。

通过将蠕虫卵重新弯曲在 5 毫升碱性次氯酸盐溶液中来释放蠕虫的卵。轻轻摇动试管，并在解剖显微镜下大约每分钟检查一次。五分钟后，或者管中大约一半的蠕虫出现弯曲和破裂。

用鸡蛋缓冲液将试管填充到顶部，并将其倒置数次。沉淀后，谎言蠕虫吸出并丢弃 sup natant。然后用鸡蛋缓冲液洗涤沉淀 3 次。

洗涤后，Reese 将沉淀悬浮在 5 毫升水中，然后加入 5 毫升无菌。60% 蔗糖的水混合均匀。沉淀悬浮液后，鸡蛋会在弯月面处出现并呈混浊状。

将每个鸡蛋收集转移到其自己的未去籽 10 厘米 NGM 琼脂板中 可以使用水冲洗 X 到板中，但尽量减少转移的液体量。将板在 20 摄氏度下孵育过夜，最初几个小时。将盖子稍微取下，让板子通风，但一定要盖上盖子过夜。

孵化后，将 L 1 幼虫转移到装满 S 罗勒的 15 毫升锥形管中。将 L 沉淀并将它们重悬于最小体积的 S 罗勒中。然后将每个 L 1 集合分装到两个接种有 NA 22 细菌的 10 厘米 NGM 琼脂平板上。

每天监测培养物一次或两次。如果他们有挨饿的危险。在饥饿之前将它们转移到新鲜的 NA 22 盘子中，同时 N 型两条收集线并像波浪一样一起远离这些盘子上的食物耗尽区，食物将在几个小时内完全耗尽。

当蠕虫达到所需的年龄时，它们就可以进行免疫染色或实时成像以安装蠕虫。用于共聚焦成像。使用 Antifa 封片剂将其密度调整为每微升几百条蠕虫。

根据经验，可以通过悬浮液的浊度来识别这种密度。理想情况下，蠕虫将密集地堆积在显微镜载玻片上，但不会过度重叠。在载玻片上，在 ESP 罗勒中制作一个 2%aros 的垫子，周围环绕着一圈薄薄的凡士林。

为防止成像过程中蒸发，请通过装有截止 25 号针头的 3 毫升注射器涂抹凡士林。现在使用末端截止的移液器吸头将几微升蠕虫悬浮液移液到盖玻片上，以防止蠕虫剪切，并将农用玫瑰垫降低到盖玻片上，在显微镜下将蠕虫均匀地分布在垫上。感兴趣的突触应定向为直接指向晶状体或仅在晶状体 45 度范围内。

花几秒钟时间以避免照片漂白。培养物和条件应提供足够的蠕虫来满足此处所示的这一严格标准，作为腹侧索直接朝向物镜的理想方向。下一个将被拒绝，因为腹侧索直接背离物镜。

请注意该标本中朝向晶状体的背索如何产生更清晰聚焦的图像。这是另一个会被拒绝的，因为背索和腹索的方向是蠕虫的边缘。因此，激发光和发射光必须穿过更多的蠕虫组织，并且会变得扭曲。

主要挑战是尽量减少治疗组年龄同步内的变异性，选择感兴趣结构直接面向物镜的蠕虫会有很大帮助。从大培养物开始会增加您对蠕虫的选择，以实现最大的一致性。为了获得最佳成像效果，请选择相对平坦的样品，这些样品可以包含在 14 个或更少的堆栈中。

0.4 微米厚的切片。高速、低分辨率的图像足以实现快速、准确的数据收集。避免在信号强度过高时使检测器饱和，因为这会导致荧光信号被低估。

此演示使用市售的软件包 velocity，该软件包至少需要为 4.0 版本。许多替代软件选择会丢失 3D 信息。从共聚焦显微镜打开多 tiff 输出文件后，选择图像，然后选择扩展焦距，然后徒手。

ROI 现在会裁剪掉图像中不包含感兴趣结构的区域。使用激活的工具，扩展焦距可提供 Z 平面投影，以简化 ROI 选择。这不会影响基础数据。

同样，亮度和对比度调整也不会影响基础数据。通过选择动作和裁剪以选择来完成裁剪。接下来，测量所分析区域的长度。

使用线条工具，将计算线条的长度并将其添加到数据表中。现在，在测量模式下使用"对象按强度"滤镜识别对象。包含用独特颜色标记的独立突触标记可能有助于明确识别突触，指定阈值，以便突出显示突触簇而不突出显示非突触背景。

使用对照样品仅执行一次，并将其用于所有后续样品，分别对每个样品进行阈值处理是不可接受的，因为它可能会引入实验者偏差。对象将被自动选择并制成表格。典型的突触范围从几个到几百个体素，在导出数据之前，按对象大小对数据进行排序。

这简化了下游删除两个或更少体素的对象，这些对象通常只是背景规范。现在，以 CSV 格式导出数据，这些格式可以由任何电子表格程序打开。每个图像生成一个输出文件，用于排序和导出 CL gans 腹侧神经索的显微照片，显示 49 个 GABA 受体是使用所述方案生成的。

所有动物的大小和成熟度看起来都非常相似。对 5 个蠕虫的总突触荧光值进行标准化，因此分析了神经脊髓的长度。该数据显示的标准误差值约为平均值的 10%。

左侧的图像是原始图像，没有阈值和背景色标删除。突触用 mus carmal 处理，mus carmal 是一种 GABA 受体激动剂，可导致受体在长时间暴露后下调。定量总荧光并归一化为神经脊髓长度累积概率。

计算个体突触荧光含量的直方图。突触体积的计算相同。这些测量表明激动剂暴露会显着降低突触内容和体积。

总体而言，定量结果应始终反映可以从视觉上欣赏的内容。如果没有，则检查图像和由速度识别的对象应揭示错误发生的位置，并建议采取纠正措施，例如阈值设置或删除伪影 尝试此过程。根据蠕虫的几何方向选择蠕虫进行成像至关重要，而不是对图像质量的主观评估，在这种情况下，强烈建议进行盲评分。