在小鼠体内的巨噬细胞的枯竭和重建

巨噬细胞发挥核心作用的动态平衡，并在许多组织的病理。这里介绍的协议描述消耗巨噬细胞的方法

以下实验的目的是确定极化巨噬细胞在体内生物过程中的作用。这是通过首先消耗小鼠的巨噬细胞来实现的。接下来，产生表达独特特征并具有不同功能的新巨噬细胞。

然后将极化巨噬细胞过继转移到小鼠中，以确定它们在感兴趣的生物过程中的作用。最终，可以测量基于临床和组织学疾病的巨噬细胞介导的炎症的差异。与现有方法（例如将小鼠杂交到 CD 11 BDTR 背景上）相比，该技术的主要优点是这种方法比繁殖小鼠更快。

用于实验。它相对简单且具有成本效益，并且可以对任何遗传背景的小鼠进行。虽然这种方法可以深入了解巨噬细胞在肠道中的作用，但它也可以应用于各种其他器官，包括肝脏、脾脏和肺。

注射前两小时，从 4 摄氏度的储存中取出脂质体和 PBS 管。当脂质体达到室温时，将试管倒置 8 到 10 次以确保分布均匀。然后将 200 微升温水到脂质体悬浮液装入 1 毫升注射器中，并连接一个 26 号针头。

双手手掌之间滚动注射器，并将其倒置六次，以便在注射前均匀分布脂质体溶液。现在用一只手捏住一只老鼠，就在耳朵下方，握住足够的皮肤来固定它的头部和四肢，然后倾斜老鼠，使其头部略微朝向地面。然后以 30 到 40 度角握住注射器。

将针头插入腹部右下象限，注入 200 微升脂质体溶液。对 8 到 12 周龄的小鼠实施安乐死并将四肢固定在伸展位置后，去除股骨和胫骨，在解剖过程中尽可能多地切除肌肉。然后在 5 毫升注射器中加入含 10% FCS 的 IMDM。

连接一根 26 号针头，从骨头冲洗骨髓。用 FCS 在 40 毫升 IMDM 中稀释骨髓抽吸物，然后将细胞转移到 75 厘米见方的组织培养瓶中。4 小时后，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育培养物。

将旋囊收集在 50 毫升锥形管中，并在 300 倍 G 和室温下将非贴壁祖细胞离心 5 分钟。计数后，将回收的细胞以 0.5 倍 10 至 6 个细胞的浓度在新鲜的 75 厘米方形烧瓶中的完全培养基中培养。第 4 天，离心非贴壁细胞并将其放回新鲜培养基中的培养瓶中。

第 7 天，丢弃不粘附的细胞，用新鲜培养基代替它们。第 10 天，丢弃培养基。然后向培养瓶中加入 5 毫升细胞解离缓冲液。

五分钟后，用一只手的脚掌用力敲打培养瓶的侧面数次。在显微镜下检查细胞，以确保它们已从培养瓶底部升起。然后将重悬的细胞移液到 15 毫升锥形管中。

再用 10 mL IMDM 加 FCS 洗涤培养瓶，然后在 300 倍 G 和室温下离心细胞 5 分钟。计数后，将回收的细胞以每毫升 10 至 7 个细胞的浓度重悬于无菌 PBS 中，保留 1 倍 10 至 6 个巨噬细胞用于巨噬细胞表型评估首先在刚刚制备的巨噬细胞悬液中配备装满 100 微升的 1 毫升注射器，配备 26 号针头。接下来，使用加热灯加热 5 到 10 分钟以扩张尾静脉。

将鼠标转移到约束装置后，将鼠标尾部旋转 90 度，使静脉朝上。用酒精棉签清洁注射部位，然后握住针头，斜面朝上。并以一个小角度，将针头几乎平行于静脉插入。

如果针头插入正确，注射后不应感觉到阻力，静脉应变得畅通，注射后，对注射部位施加轻柔的压力，直到出血停止。小鼠结肠的这些免疫组织化学切片表明，在 DSS 诱导的结肠炎期间，腹膜内注射含有脂质体的氯膦酸盐导致 F 4 80 阳性巨噬细胞减少，与对照 PBS 注射小鼠精氨酸酶 1 阳性相比，棕色 F 4 80 染色减少证明了这一点。或者，棕色活化的巨噬细胞也使用氯膦酸盐脂质体注射成功耗尽。

此图和上图中的蓝色染色代表细胞核，因为条形图显示了 F 4 个 80 阳性 MCSF 衍生的巨噬细胞和精氨酸酶 1 个阳性的定量评估。或者，活化的 MCSF 衍生的加上 IL 4 处理的巨噬细胞表明，在接受腹膜内注射氯膦酸盐脂质体的小鼠中，这两个群体都显着耗尽。这些数据证明了典型油脂分析的结果，该分析通过检测脂多糖的下游代谢物亚硝酸盐来测量响应脂多糖的一氧化氮水平。

因此，与替代活化的 MCSF 衍生加上 IL 4 处理的巨噬细胞相比，经典激活的 MCSF 衍生的巨噬细胞产生的亚硝酸盐水平明显更高。与 ELA 测量的选择性激活的巨噬细胞相比，经典活化的巨噬细胞还产生更高的 IL 12 P 70 与 IL 10 比率，这与选择性激活的表型一致。经 IL 4 处理的 MCSF 衍生巨噬细胞组成型表达 YM 1 和精氨酸酶 1，通过蛋白质免疫牙线检测。

在这里，显示了注射极化骨髓来源的巨噬细胞的小鼠的组织学切片中列举的经典激活的 M1 巨噬细胞的总数和选择性激活的 M 2 巨噬细胞的数量。C 数据栏表示接受 PBS 注射而没有巨噬细胞的对照小鼠。在 DSS 诱导的结肠炎期间，极化巨噬细胞的转移对结肠的影响由疾病活动指数表示，疾病活动指数是基于体重减轻、直肠出血和粪便稠度降低的累加评分。

请注意，M1 巨噬细胞不影响炎症，而 M 两个巨噬细胞显着降低疾病活动指数。因此，这些结果表明 dex vivo 衍生的过继转移的巨噬细胞可以运输到结肠并影响诱导的炎症在其发展后。这项技术为研究巨噬细胞生物学的研究人员探索巨噬细胞极化在小鼠中的作用铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何确定极化巨噬细胞在小鼠体内平衡和疾病中的作用有一个很好的了解。