离体双心室工作兔心脏的NADH荧光成像

本实验的总体目标是研究代谢过程。通过在工作心脏模型中进行NADH成像，首先分离兔心，以实现该目标。实验的第二步是成功地对心脏的四个腔室进行插管，从而建立工作心脏模型。

最后一步是设置成像设备，并在不同起搏速率下采集NADH数据。最终，通过荧光NADH成像可以显示心脏的代谢变化。该技术相较于现有方法（如离体逆行灌注）的主要优势在于，心脏处于其生理状态，血流方向正常，且由心脏自身提供冠状动脉灌注所需的压力。

该方法有助于解答电生理学及致死性心律失常机制中的关键问题，通过提供一种生理学模型来研究冠状动脉血流代谢与电活动之间的关联。该方法的可视化演示至关重要，因为血管和心脏腔室插管步骤难以掌握。

操作不当可能会损伤心脏，危及后续实验。在开始实验前，先用纯水冲洗工作心脏系统各腔室中的所有导管，然后通过启动泵将系统中的水排空。在LOR灌注泵、左心灌注泵和右心灌注泵的管路中串联加入纤维素膜过滤器。

加入 PERFUSE eight 后，对每个压力传感器进行两点校准。打开加热循环水浴，用于加热带水夹套的管道和热交换器。打开用于加热 PERFUSE eight 的水浴。

启动使灌注液八号在封闭回路中循环的泵，并开启循环储液罐以对灌注液进行氧合。确保微纤维氧合器或血液过滤器以80千帕的压力向灌注液八号提供95%的氧气。最后，确保热交换器维持循环灌注液的温度。

在37摄氏度下孵育八小时后，开始进行心脏切除，首先将工作心脏系统设置为恒压模式（LRF模式）。在对兔子实施镇静后，将主动脉阻断压力设定在50至60之间。

将戊巴比妥和肝素注入耳缘静脉或后肢内侧的腓肠静脉。当兔失去痛觉反射后，迅速打开胸腔。切开心包，夹住主动脉，摘除心脏和肺。

保持肺脏附着以方便分离肺静脉。接下来，用60毫升每F八和200单位肝素填充注射器。连接一个5毫米的套管，并插管至主动脉。

用0号丝线将主动脉固定在套管上。然后缓慢按压注射器，使血液通过心脏冲出。首先将心脏连接到主动脉夹具上，建立工作心脏系统。

以倾斜角度接近连接器，并在连接状态下让灌注液八号缓慢滴入套管内。这样可防止空气进入主动脉，从而在心脏以恒定压力灌注时避免冠状动脉栓塞。L endorf 模式。

去除脂肪和结缔组织，找到以下血管：下腔静脉、上腔静脉、腔静脉、肺动脉和肺静脉。接下来，结扎上腔静脉。

在肺动脉分为左、右肺动脉的分支下方剪断肺动脉。余下的血管为肺静脉，将其在心脏与肺之间归为一组，并使用一根缝线将其全部结扎。

这基于两个关键原因。首先，结扎与肺部相连的血管可确保插管完成后无液体泄漏。其次，重要的是要分离两条腔静脉以便后续插管。

现在移除肺脏。在左心耳的角落处剪开一个适当大小的孔，并确保其充满灌注液八。接着，在灌注液八完全充满导管的情况下，将导管插入心耳。

然后在固定住组织的同时，将套管缝合到心耳上。左心耳的组织极为脆弱，容易撕裂。因此，首次尝试时就必须成功插管左心房，否则可能无法再次进行。

启动二号泵，以向左心房提供血流。在整个实验过程中，将预负荷压力设置在2至6 torr之间。压力可能需要进行调整。

保持在目标压力的两毫米汞柱范围内。现在通过暂时关闭一号泵（即兰格多夫泵）将心脏切换至工作心脏模式。将主动脉压力降低至10托，然后缓慢升高至80至100托的范围内。

这使得主动脉瓣能够打开并像在正常生理条件下一样发挥作用。使用直接连接到系统的插管，将最终的后负荷压力设定为比左心室峰值压力低约20的值。

通过下腔静脉 CVA 插管右心房，并将插管缝合固定于静脉上。避免引入任何气泡。启动3号泵，即右侧泵，以向右心房提供灌注流。

将压力调至约三个托。最后，在不使空气进入的情况下插管右心室，并将插管缝合至肺动脉。至此完成双心室插管。

现在开始进行信号采集。通过主动脉插管将压力换能器导管小心插入主动脉。轻柔地将其经主动脉瓣送入左心室（lv）。

当导管尖端位置适当时，左心室压力信号将如预期般出现。接下来，轻轻将单相动作电位电极压在心室心外膜上。电极信号中出现轻微的运动伪影是正常的。

接下来，将双极刺激电极放置在右心房，以根据实验设计的位置对心脏进行起搏。并将CCD相机聚焦于心脏的兴趣区域。相机上应安装有发射滤光片。

为了观察NADH荧光，关闭环境光，使用与相机连接的工作站上的紫外光源均匀照射心外膜。将软件设置为每秒采集两帧图像，然后选择实时更新模式，以监测感兴趣区域内平均像素强度的变化。

如果灌注充分，由荧光所反映的NADH水平应在心外膜表面保持较低且稳定。实验完成后，运行实验，取出心脏。

用纯化水排空 PERFUSE 八号系统及其管路和腔室。按照规定的方案，定期使用黏膜 TM 溶液或稀释的过氧化氢溶液冲洗系统。心脏在 200 至 400 次/分钟的周期长度下进行起搏。

舒张期左心室压（LVP）通常介于0至10 Torr之间，而最低舒张期主动脉压约为60 Torr。收缩期峰值LVP取决于充盈压和心肌收缩力，理想范围应在60至80 Torr之间。主动脉最高压与LVP最大值应基本一致。兔心的单相动作电位具有快速去极化相和特征性复极化相。动作电位可从标本中轻松记录，但通常在舒张期伴有较小的运动伪影。

通过测量红色方框内感兴趣区域的平均荧光NADH值，以监测在起搏周期分别为300、200和150毫秒（起搏频率接近窦性心律）的三个起搏周期中线粒体氧化还原状态的变化。当周长缩短时，基础NADH水平相对恒定。在低于300毫秒时，基础NADH水平升高，其中在150毫秒时升高最为显著，信号随心肌收缩而振荡，且振荡频率与心率相对应。

这些振荡的幅度始终小于由缺血或缺氧引起的任何长时间尺度的趋势。在每分钟200次心跳时，对整个前表面进行高分辨率荧光NADH成像，在每分钟400次心跳时保持恒定且空间分布均匀。NADH水平在整个心外膜中显著升高。

观察到显著的空间异质性，其中右心室和左心室间隔区域的变化最为明显。一旦掌握，若操作正确，该技术可在45分钟内完成。在尝试执行此操作时，重要的是要记住防止任何气泡进入主动脉或左心房。完成此操作后。

其他方法，例如使用电压敏感性染料对心脏进行染色，可用于回答更多问题，比如在局部缺血等病理情况下，研究心脏表面电活动与代谢活动之间的关联。该技术的建立为心脏生理学领域的研究人员提供了途径，使其能够在更符合生理相关性的模型中研究病理状态下心脏的代谢过程及传导异常。