单细胞与多细胞环境下侵袭性伪足介导的细胞外基质蛋白降解的定量测量

该标准技术可制备带有荧光标记的明胶包被盖玻片，适用于定量分析侵袭性足体基质降解的实验。首先用荧光标记的明胶对盖玻片进行包被，随后接种细胞并进行培养以实现基质降解。接着，固定细胞并使用荧光染料对侵袭性足体标志蛋白进行染色，获取图像后定量分析基质降解情况。

典型结果可以量化在特定基因差异性调控或药物处理条件下，细胞在invadopodia介导的基质降解方面的差异。该方法的可视化演示至关重要，因为荧光明胶涂层盖玻片的制备过程难以实现均匀的荧光，这主要是由于荧光明胶涂层不均匀或对明胶涂层盖玻片操作不当所致。本实验操作将由研究助理教授Karen Martin、博士后研究员Mandy Ammer以及研究生Elise Walk、Karen Hayes和Steve Markwell进行演示。

配制未标记的5%明胶蔗糖储备溶液时，将明胶和蔗糖加入PBS中，在37摄氏度下完全溶解，然后在4摄氏度下保存。接着进行玻璃盖玻片的清洗。

将单个盖玻片分别放入24孔塑料组织培养板的每个孔中，每孔加入500微升20%硝酸，孵育30分钟。移除硝酸溶液后，用去离子水洗涤盖玻片三次。接下来进行包被。

将每张盖玻片加入500微升浓度为每毫升50微克的多聚赖氨酸溶液，在室温下孵育20分钟。去除多聚赖氨酸溶液，并用PBS洗涤三次。聚-L-赖氨酸包被有助于上层标记明胶的均匀涂布和牢固结合。将24孔板置于冰上，并向每孔加入500微升新配制的0.5%戊二醛溶液。

将培养板置于冰上孵育15分钟。用冷的PBS洗涤三次，然后在包被明胶之前吸除所有PBS残留物。在此期间，在戊二醛孵育过程中，重悬Oregon Green 488标记的明胶。

根据制造商的说明书，将标记的5%明胶蔗糖储备溶液和未标记的5%明胶蔗糖储备溶液均升温至37摄氏度。然后将500微升标记明胶加入到4毫升未标记明胶中进行稀释。用移液器将100微升稀释后的488标记明胶混合物滴加到每张盖玻片上。

使用足量的明胶覆盖盖玻片，无需手动涂布。在包被过程中，必须将稀释的488明胶混合物保持在37摄氏度，以防止过早凝固。此外，从这一步开始，应尽可能将盖玻片避光保存，以避免潜在的光漂白。

当所有盖玻片在单个培养板中完成包被后，将培养板倾斜，通过真空抽吸去除每个孔中的多余明胶。随后将包被好的盖玻片在室温下避光孵育10分钟。用PBS洗涤盖玻片三次后，加入500微升硼氢化钠、氢化钠、硼氢化钠。

加入氢化物后会产生气泡，每个盖玻片表面及周围均可见细小气泡。在室温下孵育15分钟，以还原并灭活残留的戊二醛。使用真空抽吸法，快速从每个孔的外围扫过，移除硼氢化钠溶液，注意避免吸走因处理而从组织培养板底部脱落的漂浮盖玻片。经过三次PBS洗涤后，将盖玻片在室温下置于70%乙醇中孵育30分钟。

采用无菌技术，将带有培养物的盖玻片转移至II级B型细胞培养超净工作台中，使用无菌针头和镊子以无菌PBS冲洗盖玻片三次。小心地将盖玻片转移至新的24孔板的空孔中，并用特定细胞类型所需的培养基平衡盖玻片。

在适当的孵育时间后，将细胞直接接种到盖玻片上。对样品进行免疫荧光成像处理以完成封片。在载玻片上滴加一滴ProLong Gold抗荧光淬灭试剂或类似试剂，小心地将倒置的盖玻片放置其上，随后采集图像用于分析。

该分析提供了相对于细胞面积或细胞数量的基质降解归一化面积。它适用于分析包含多个细胞的整个显微视野，这些细胞共同接受了irna生长因子或治疗剂处理。进行此分析时，需采集较低放大倍数下的图像，以高效获取细胞群体的相关信息。

在 ImageJ 中打开图像。检查比例信息并选择测量选项，选择面积并设置阈值范围。利用荧光明胶图像计算降解面积，通过减去背景阈值来校正明胶上照明不均的影响，并设定图像的像素强度上下限值。

在后续图像中，使用阈值窗口中的“设置”按钮为所有图像设置相同的阈值，以此作为选择降解区域的客观方法。使用“分析颗粒”功能测量基质降解区域的阈值。

选择大于零的粒径以去除选区中的噪声。显示轮廓以识别感兴趣区域。然后勾选显示结果并勾选汇总，以显示测量数据，前提是绘图已明确勾勒出所有降解区域。

如果选择了其他对象（例如碎片），请仅记录相关感兴趣区域的面积，并将总面积测量值复制到电子表格中。接下来，为计算细胞面积，打开foid以及染色图像的阈值，设置图像的上下像素强度值，以便在后续图像中选中细胞的边缘。使用阈值窗口中的“set”按钮为所有图像设置相同的阈值。

作为选择细胞区域的客观方法，使用“分析颗粒”功能来测量细胞区域的阈值。选择大于零的颗粒尺寸，以去除选择中的噪声。

显示轮廓以识别分析区域，检查显示结果并进行汇总以显示面积测量值。不要勾选“不包含孔洞”选项。如果细胞之间存在间隙且形成簇状结构，则应包含孔洞。

现在进行选择。将相关感兴趣区域的面积结果复制到电子表格中，并计算每单位细胞总面积的明胶降解面积。另一种方法是将降解面积归一化为细胞数量，细胞数量通过计数DAP e染色的细胞核来确定。

如果操作改变了平均细胞面积，这一点尤为重要。对于此方法，使用细胞核计数插件自动计数细胞核。调整选项以优化您的图像。如果细胞核重叠严重，自动计数可能无法在此情况下提供准确的计数结果。

正确操作时，可使用细胞计数插件辅助人工计数。盖玻片需均匀涂布 Oregon Green 488 标记的明胶。在明胶包被盖玻片的包被和处理过程中，可能出现多种伪影。

例如，由于明胶混合物混合不充分、手动涂布或局部凝固，导致盖玻片在包被过程中覆盖不均，从而产生不均匀的包被结果。划痕表明在操作过程中使用针头或镊子划伤导致包被基质被移除。盖玻片表面在长期储存期间发生干燥，可能导致出现鹅卵石样外观。该区域反映了成像过程中因长时间或高强度光照导致荧光明胶表面发生光漂白现象。

注意观察制备良好的盖玻片在显微镜下呈现均匀的荧光。此操作过程中产生的薄层基质为评估细胞降解细胞外基质（ECM）能力提供了一种灵敏的方法。例如。

这些图像展示了 OSC 19 头颈癌细胞侵袭并降解基质的活动。实验中，将细胞接种于 Oregon Green 488 标记的明胶盖玻片上，通过荧光显微镜成像，呈现为二维和三维图像。接种在 Oregon Green 488 标记明胶盖玻片上的 OSC 19 细胞经鬼笔环肽-Rhodamine 标记，并使用抗 cortactin 抗体及 Alexa Fluor 647 标记的二抗进行染色，其中降解区域以伪彩绿色显示。

在合并图像中，足突表现为 F 肌动蛋白和 cortan 的局灶性胞质富集区域，这些区域与明胶清除体积填充的区域重叠。可视化图像展示了侵入性足突如何穿透到 ECMA 子体积中，该子体积被创建以显示细胞内部存在侵入性足突的边缘。背侧边缘视图展示了侵入性足突插入下方明胶的情况。

腹侧边缘视图显示 Vedapodia 的突出部分以及盖玻片下方明胶降解区域，其中红色区域代表绿色基质的缺失。这些图像展示了在整个显微图像中对标准化明胶基质降解细胞进行定量的一些关键步骤。所有荧光图像均已转换为灰度，以更清晰地显示红色阈值及感兴趣区域的标记。

这张 Oregon Green 488 标记的明胶图像显示了发生降解的暗区。通过对明胶图像进行阈值处理，可突出显示降解区域，并从中选取感兴趣区域以测量降解面积。该图像显示了预期的罗丹明、封片剂以及 F 肌动蛋白的染色结果。

肌动蛋白图像的阈值突显了总细胞区域，从中可选择用于测量的细胞区域。同样，该技术也可应用于研究经DAPI染色的细胞核图像。此面板展示了在混合细胞群体中对单个细胞降解荧光明胶进行定量分析所涉及的部分关键步骤。

此简单的定量分析针对单个转染过表达重组cortactin-Flag表位标签融合蛋白的OSC 19细胞。请注意，转染细胞在转染与非转染细胞的混合群体中，其基质降解情况同样可被分析。在进行该实验操作时，需牢记若干要点。

首先，确保所使用的荧光细胞标记物的颜色不与荧光明胶的颜色发生重叠。在采集图像时，应根据细胞的存在情况选择视野。切勿优先寻找降解区域，因为这可能会因不同细胞系以及对各种治疗药物反应的差异性而导致数据偏差。

座位数降解时间以及免疫荧光标记所用蛋白的选择等因素应根据您的具体实验进行优化。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备均匀包被荧光明胶的盖玻片，用于β突起介导的降解实验，以及细胞外基质降解定量分析的方法。