Name: 定量测量的侵袭伪足介导的细胞外基质蛋白水解单和多细胞的情况下 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 了解如何使用荧光标记明胶包被盖玻片定量测量侵袭伪足介导的细胞外基质降解。该方法适用于单细胞和多细胞实验，结合荧光显微镜成像与ImageJ图像分析，可精确量化基质降解面积并评估细胞侵袭能力。

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本工作得到了西弗吉尼亚大学玛丽·巴布·兰道夫癌症中心捐赠基金的支持。我们感谢乔治城大学的Susette Mueller和Laura Kelley提供的早期建议与帮助。特此感谢西弗吉尼亚大学显微成像设施的使用支持（该设施由玛丽·巴布·兰道夫癌症中心以及美国国立卫生研究院资助项目P20 RR16440、P30 RR032138和P30 GM103488支持）。

<ol><li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Life at the leading edge.</a> Cell. 145, 1012-1022 (2011).</li>
<li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27ins%27+and+%27outs%27+of+podosomes+and+invadopodia%3A+characteristics%2C+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li>
<li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degrading+Devices%3A+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+degradation+of+fibronectin+at+sites+of+expression+of+the+transforming+gene+product+pp60src%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src.</a> Nature. 316, 156-158 (1985).</li>
<li>Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interactions+of+cortactin+and+membrane+type+1+matrix+metalloproteinase+at+invadopodia%3A+defining+the+stages+of+invadopodia+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function.</a> Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).</li>
<li>Ayala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+inputs+converge+on+cortactin+to+control+invadopodia+biogenesis+and+extracellular+matrix+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation.</a> J. Cell Sci. , (2008).</li>
<li>Ammer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saracatinib+impairs+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+invasion+by+disrupting+invadopodia+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Sci.+Ther%22%5BJournal%5D)">Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function.</a> J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).</li>
<li>Seals, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Tks5%2FFish+is+required+for+podosome+formation+and+function%2C+and+for+the+protease-driven+invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells.</a> Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+invadopodium+formation%3A+the+role+of+the+N-WASP-Arp2%2F3+complex+pathway+and+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin.</a> J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).</li>
<li>Kopp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin+KIF1C+and+microtubule+plus+ends+regulate+podosome+dynamics+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).</li>
<li>Oser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+regulates+cofilin+and+N-WASp+activities+to+control+the+stages+of+invadopodium+assembly+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation.</a> J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Src+requires+a+wild-type+counterpart+to+regulate+invadopodia+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation.</a> J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+is+not+present+in+the+focal+adhesions+formed+between+normal+cultured+fibroblasts+and+their+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).</li>
<li>Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transformation-associated+protease%28s%29+that+degrade+fibronectin+at+cell+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites.</a> J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).</li>
<li>Bharti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src-dependent+phosphorylation+of+ASAP1+regulates+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes.</a> Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).</li>
<li>Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+engagement+of+ADAM12+induces+clusters+of+invadopodia+with+localized+ectodomain+shedding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity.</a> Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).</li>
<li>Scott, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
<li>Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+membrane+proteins+mediates+cellular+invasion+by+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells.</a> J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).</li>
<li>Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%3A+unique+methods+for+measurement+of+extracellular+matrix+degradation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro.</a> Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).</li>
<li>Baldassarre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+participates+in+focal+extracellular+matrix+degradation+by+invasive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells.</a> Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+degradation+assays+for+analyzing+local+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ECM degradation assays for analyzing local cell invasion.</a> Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).</li>
<li>Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+microtubules%2C+and+vimentin+intermediate+filaments+cooperate+for+elongation+of+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia.</a> J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).</li>
<li>Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+is+an+essential+regulator+of+matrix+metalloproteinase+secretion+and+extracellular+matrix+degradation+in+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia.</a> Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+signaling+pathway+mediated+by+p110alpha+regulates+invadopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation.</a> J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-bundling+protein+fascin+stabilizes+actin+in+invadopodia+and+potentiates+protrusive+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion.</a> Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+and+PIP5-kinase+Ialpha+are+required+for+invadopodia+formation+in+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells.</a> Cancer Sci. , (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

观察细胞降解细胞外基质的能力，有助于揭示细胞侵袭早期所采用的分子机制。该技术由Wen-Tien Chen于20世纪80年代初首创4,14,15，通过将荧光标记的细胞外蛋白包被于玻璃盖玻片上，随后进行显微分析，已成为评估多种细胞类型中侵袭伪足功能的主要方法。本方案描述了制备明胶包被盖玻片的基本步骤，所形成的胶原层厚度小于2 μm，适用于大多数常规荧光显微镜和共聚焦显微镜检测细胞对细胞外基质的降解能力11,16-18，与先前报道的方法类似19-21。这些特性使得包被盖玻片能够快速制备，并有效检测基质降解的初始阶段。由于底层为坚硬的玻璃表面，所形成的薄明胶基质具有较高的灵敏度，可能有助于促进侵袭伪足的形成，这是细胞对整体基质环境高固有刚度的一种响应22。然而，此类基质并不适用于侵袭伪足延伸过程或更深入的形态学分析，后者通常需采用较厚的明胶层（30–100 μm）、类似方法包被的Transwell小室或电子显微镜技术来实现20,23,24。
我们发现， commercially p...

<table><tbody><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>猪皮来源</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 盖玻片</td><td>Fisher</td><td>50-121-5159</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td>BD Falcon</td></tr><tr><td>硝酸</td><td>Ricca</td><td>R5326000</td><td>20% 溶液</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19320-B</td><td>0.1% 溶液</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma</td><td>G7526</td><td>8% 溶液</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 标记的明胶</td><td>Invitrogen</td><td>G-13186</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明-鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>抗皮层肌动蛋白抗体（克隆 4F11）</td><td>Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>抗 FLAG 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB3118</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的山羊抗小鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>公共领域</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.macbiophotonics.ca/imagej/&quot; target=&quot;_blank">http://www.macbiophotonics.ca/imagej/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>AutoQuant X2.2 软件</td><td>Media Cybernetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

单细胞与多细胞环境中侵袭足介导的细胞外基质降解的定量测量

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

细胞向局部组织的侵袭是发育和稳态维持中的重要过程。侵袭过程的失调及随之发生的细胞迁移是多种病理过程的特征，包括炎症、心血管疾病和肿瘤细胞转移。1上皮或内皮基底膜中细胞外基质（ECM）成分的局灶性蛋白水解降解是启动细胞侵袭的关键步骤。在肿瘤细胞中，广泛的 体外 分析表明，细胞外基质的降解是由富含腹侧肌动蛋白的膜突起结构（称为侵袭性伪足）完成的2,3侵袭伪足在紧邻细胞外基质（ECM）的位置形成，并通过基质金属蛋白酶（MMPs）的作用调控ECM的降解。肿瘤细胞形成侵袭伪足的能力与其侵入局部间质及邻近血管结构的能力直接相关。3. 
利用荧光显微镜观察细胞在包被了染料标记基质蛋白的玻璃盖玻片上形成的侵袭伪足介导的细胞外基质（ECM）降解，已成为评估基质蛋白水解程度和细胞侵袭潜能的最常用技术4,5。本文介绍一种使用 commercially available Oregon Green-488 明胶偶联物制备荧光标记玻璃盖玻片的标准方法。该方法易于扩增，可快速制备大量包被的盖玻片。我们展示了在此过程中常遇到的一些常见显微镜伪影，并说明如何避免这些问题。最后，我们描述了使用 readily available 计算机软件进行定量分析的方法，以评估单个细胞及整个细胞群体介导的标记明胶基质降解情况。所述实验流程能够准确且可重复地监测侵袭伪足活性，也可作为评估调控蛋白表达或测试抗侵袭化合物在单细胞和多细胞环境下对细胞外基质降解效果的平台。

我们描述了一种用于制备荧光明胶包被的显微镜盖玻片的典型方法，以可视化由侵袭性伪足介导的基质降解。本文介绍了利用现有软件进行计算分析的技术，可用于定量混合细胞群体中单个细胞以及涵盖整个显微视野的多细胞群体所导致的基质蛋白水解水平。

细胞侵袭局部组织是发育和稳态维持过程中的重要环节。侵袭过程及其后续的细胞迁移若发生调控异常，……

该标准技术可制备适用于定量侵袭性细胞足体基质降解检测的荧光标记明胶包被盖玻片。将盖玻片用荧光标记明胶进行包被后，接种细胞并进行培养以实现基质降解。随后，固定细胞并用细胞足体标志蛋白的荧光染料进行染色，获取图像并定量分析基质降解情况。典型结果可以量化在特定基因差异性调控或药物处理条件下，细胞通过伪足介导的基质降解能力的差异。该方法的可视化演示至关重要，因为荧光明胶涂层盖玻片的制备过程难以实现均匀的荧光分布，这通常是由于荧光明胶涂层不均或对明胶包被盖玻片操作不当所致。本实验操作将由研究助理教授Karen Martin、博士后研究员Mandy Ammer以及研究生Elise Walk、Karen Hayes和Steve Markwell进行演示。配制未标记的5%明胶蔗糖储备溶液时，将明胶和蔗糖加入PBS中，在37摄氏度下完全溶解，然后在4摄氏度下保存。接着进行玻璃盖玻片的清洗。将单个盖玻片分别放入24孔塑料组织培养板的每个孔中，每孔加入500微升20%硝酸，孵育30分钟。移除硝酸溶液后，用去离子水洗涤盖玻片三次。接下来进行包被。将每张盖玻片加入 500 微升含 50 微克/毫升多聚赖氨酸的溶液，在室温下孵育 20 分钟。去除多聚赖氨酸溶液，用 PBS 洗涤三次。Poly-L-赖氨酸包被有助于上层标记明胶的均匀涂布和牢固结合。将 24 孔板置于冰上，并向每孔加入 500 微升新配制的 0.5% 戊二醛溶液。将培养板置于冰上孵育15分钟。用预冷的PBS洗涤三次，然后在包被明胶前彻底吸除所有PBS残留。在此期间，在戊二醛孵育过程中，重新配制Oregon Green 488标记的明胶。根据制造商的说明书，将标记的5%明胶蔗糖储存液和未标记的5%明胶蔗糖储存液均预热至37摄氏度。然后将500微升标记明胶加入到4毫升未标记明胶中进行稀释。用移液器将100微升稀释后的488标记明胶混合物滴加到每张盖玻片上。使用足量的明胶覆盖盖玻片，无需手动涂布。在包被过程中，必须将稀释的488明胶混合物保持在37摄氏度，以防止过早凝固。此外，从这一步开始，应尽可能将盖玻片避光保存，以避免潜在的光漂白。当所有盖玻片在同一块培养板上完成包被后，将培养板倾斜，通过真空抽吸去除每个孔中的多余明胶。随后将包被好的盖玻片置于室温下避光孵育10分钟。用PBS洗涤盖玻片三次后，加入500微升硼氢化钠溶液。加入氢化物后会产生气泡，每个盖玻片表面及周围均可见细小气泡。在室温下孵育15分钟，以还原并灭活残留的戊二醛。使用真空抽吸法，快速从每个孔的外围扫过，移除硼氢化钠溶液，注意避免吸走因处理而从组织培养板底部脱落的漂浮盖玻片。经过三次PBS洗涤后，将盖玻片在室温下置于70%乙醇中孵育30分钟。采用无菌技术，将含有盖玻片的培养板转移至II型B细胞培养用的超净工作台中，用无菌PBS通过无菌针头和镊子清洗盖玻片三次。小心地将盖玻片转移至新的24孔板中的空孔内，并用特定细胞类型所需的培养基对盖玻片进行平衡。在适当的孵育时间后，将细胞直接接种到盖玻片上。对样品进行免疫荧光成像处理以进行封片。在载玻片上滴加一滴ProLong Gold抗荧光淬灭试剂或类似试剂，小心地将倒置的盖玻片放置其上，随后采集图像用于分析。该分析提供了相对于细胞面积或细胞数量的基质降解归一化面积。它适用于分析包含多个细胞的整个显微视野，这些细胞已共同接受了小干扰RNA、生长因子或治疗剂处理。进行此分析时，需采集较低放大倍数下的图像，以高效获取细胞群体的相关信息。在 ImageJ 中打开图像。检查比例信息并选择测量参数，勾选面积并启用阈值限制选项。通过荧光明胶图像计算降解面积，为校正明胶上照明不均的影响，需减去背景阈值，并设定图像的像素强度上下限值。在后续图像中，使用阈值窗口中的“设置”按钮为所有图像设定相同的阈值，以此作为选择降解区域的客观方法。使用“分析颗粒”功能来测量基质降解区域的阈值。选择大于零的粒径以去除选区中的噪声。显示轮廓以识别感兴趣区域。然后勾选显示结果并进行汇总，以显示测量数据，前提是绘图已明确勾勒出所有降解区域。如果选择了其他对象（例如碎片），请仅记录相关感兴趣区域的面积，并将总面积测量值复制到电子表格中。接下来，为计算细胞面积，打开foid以及染色图像的阈值，设置图像的上下像素强度值，以便在后续图像中选中细胞的边缘。使用阈值窗口中的“set”按钮为所有图像设置相同的阈值。作为一种客观选择细胞区域的方法。使用“分析颗粒”功能来测量细胞区域的阈值。选择大于零的颗粒尺寸，以从选择中去除噪声。显示轮廓以确定分析区域，检查显示结果并汇总以显示面积测量值。不要勾选“包含孔洞”，如果细胞之间存在间隙且形成簇状结构，则应包含孔洞。现在进行选择。将相关感兴趣区域的面积结果复制到电子表格中，并计算每单位细胞总面积的明胶降解面积。另一种方法是根据DAP e染色的细胞核计数确定的细胞数量，将降解面积归一化为细胞数。如果操作改变了平均细胞面积，则这一点尤为重要。对于该方法，使用细胞核计数插件自动计数细胞核。根据图像情况调整参数以优化计数效果。若细胞核存在广泛重叠，自动计数可能无法提供准确的计数结果，在此情况下。正确操作时，可使用细胞计数插件辅助人工计数。盖玻片需均匀涂布 Oregon Green 488 标记的明胶。在明胶包被盖玻片的包被和处理过程中，可能出现多种人为假象。例如，由于明胶混合物混合不充分、手动涂布或局部凝固，盖玻片在包被过程中覆盖不均，导致包被不均匀。划痕表明在操作过程中使用针头或镊子对包被基质造成刻划而使其脱落。盖玻片表面在长期储存期间干燥，可导致出现鹅卵石样外观。该区域反映了成像过程中因长时间或高强度光照导致荧光明胶表面发生光漂白。注意观察制备良好的盖玻片在显微镜下呈现均匀的荧光。此操作过程中产生的薄层基质为评估细胞降解细胞外基质（ECM）能力提供了一种灵敏的方法。例如。这些图像展示了 OSC 19 头颈癌细胞侵袭并降解基质的活动。实验中，将细胞接种于 Oregon Green 488 标记的明胶盖玻片上，并通过荧光显微镜成像，呈现为二维和三维图像。接种在 Oregon Green 488 标记明胶盖玻片上的 OSC 19 细胞经鬼笔环肽-Rhodamine 标记，并使用抗 cortactin 抗体及 Alexa Fluor 647 标记的二抗进行免疫荧光染色，其中降解区域以伪彩色绿色显示。在融合图像中，足体表现为F肌动蛋白和cortan在细胞质内的局部浓集，其位置与明胶清除体积填充区域相重叠。该可视化图像展示了侵入性足体如何穿透至ECMA亚体积内，该亚体积用于显示细胞内部存在侵入性足体的边缘区域。背侧边缘视图显示侵入性足体已插入下方的明胶中。腹侧边缘视图显示 Vedapodia 的突出结构以及盖玻片下方明胶降解区域，其中红色区域代表绿色基质的缺失。这些图像展示了在整个显微图像中对标准化明胶基质降解细胞进行定量的一些关键步骤。所有荧光图像均已转换为灰度，以更清晰地显示红色阈值及感兴趣区域的标记。这张 Oregon Green 488 标记的明胶图像显示了发生降解的暗区。通过对明胶图像进行阈值处理，可突出显示降解区域，并从中选定感兴趣区域以测量降解面积。该图像显示了预期的明胶染色、空腔结构以及 F-肌动蛋白的染色情况。肌动蛋白图像中的阈值标出了总面积，从中选择待测的细胞区域。同样，该技术也可应用于研究经DAPI染色的细胞核图像。此图示展示了在混合细胞群体中对单个细胞荧光明胶降解进行定量分析所涉及的部分关键步骤。该简单定量分析针对单个转染过表达重组cortactin-Flag表位标签融合蛋白的OSC 19细胞。请注意，转染细胞在与未转染细胞的混合群体中，其基质降解情况同样可被分析。在进行此实验操作时，需牢记若干要点。首先，确保所使用的荧光细胞标记物的颜色不与荧光明胶的颜色发生重叠。在采集图像时，应根据细胞的存在情况选择视野，切勿优先寻找降解区域，因为这可能会因不同细胞系以及对各种治疗药物反应的差异性而导致数据偏差。诸如座位编号、降解时间以及免疫荧光标记所用蛋白的选择等因素，均需根据具体的实验进行优化。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备均匀包被荧光明胶的盖玻片，用于β足体介导的降解实验，以及基质降解定量分析的方法。

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生物学

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