Name: 定量测量的侵袭伪足介导的细胞外基质蛋白水解单和多细胞的情况下 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 了解如何使用荧光标记明胶包被盖玻片定量测量侵袭伪足介导的细胞外基质降解。该方法适用于单细胞和多细胞实验，结合荧光显微镜成像与ImageJ图像分析，可精确量化基质降解面积并评估细胞侵袭能力。

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本工作得到了西弗吉尼亚大学玛丽·巴布·兰道夫癌症中心捐赠基金的支持。我们感谢乔治城大学的Susette Mueller和Laura Kelley提供的早期建议与帮助。特此感谢西弗吉尼亚大学显微成像设施的使用支持（该设施由玛丽·巴布·兰道夫癌症中心以及美国国立卫生研究院资助项目P20 RR16440、P30 RR032138和P30 GM103488支持）。

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<li>Kopp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin+KIF1C+and+microtubule+plus+ends+regulate+podosome+dynamics+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).</li>
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<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
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<li>Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transformation-associated+protease%28s%29+that+degrade+fibronectin+at+cell+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites.</a> J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).</li>
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<li>Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+engagement+of+ADAM12+induces+clusters+of+invadopodia+with+localized+ectodomain+shedding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity.</a> Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).</li>
<li>Scott, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
<li>Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+membrane+proteins+mediates+cellular+invasion+by+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells.</a> J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).</li>
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<li>Baldassarre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+participates+in+focal+extracellular+matrix+degradation+by+invasive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells.</a> Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+degradation+assays+for+analyzing+local+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ECM degradation assays for analyzing local cell invasion.</a> Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).</li>
<li>Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+microtubules%2C+and+vimentin+intermediate+filaments+cooperate+for+elongation+of+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia.</a> J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).</li>
<li>Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+is+an+essential+regulator+of+matrix+metalloproteinase+secretion+and+extracellular+matrix+degradation+in+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia.</a> Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+signaling+pathway+mediated+by+p110alpha+regulates+invadopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation.</a> J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-bundling+protein+fascin+stabilizes+actin+in+invadopodia+and+potentiates+protrusive+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion.</a> Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+and+PIP5-kinase+Ialpha+are+required+for+invadopodia+formation+in+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells.</a> Cancer Sci. , (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

观察细胞降解细胞外基质的能力，有助于揭示细胞侵袭早期所采用的分子机制。该技术由Wen-Tien Chen于20世纪80年代初首创4,14,15，通过将荧光标记的细胞外蛋白包被于玻璃盖玻片上，随后进行显微分析，已成为评估多种细胞类型中侵袭伪足功能的主要方法。本方案描述了制备明胶包被盖玻片的基本步骤，所形成的胶原层厚度小于2 μm，适用于大多数常规荧光显微镜和共聚焦显微镜检测细胞对细胞外基质的降解能力11,16-18，与先前报道的方法类似19-21。这些特性使得包被盖玻片能够快速制备，并有效检测基质降解的初始阶段。由于底层为坚硬的玻璃表面，所形成的薄明胶基质具有较高的灵敏度，可能有助于促进侵袭伪足的形成，这是细胞对整体基质环境高固有刚度的一种响应22。然而，此类基质并不适用于侵袭伪足延伸过程或更深入的形态学分析，后者通常需采用较厚的明胶层（30–100 μm）、类似方法包被的Transwell小室或电子显微镜技术来实现20,23,24。
我们发现， commercially p...

<table><tbody><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>猪皮来源</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 盖玻片</td><td>Fisher</td><td>50-121-5159</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td>BD Falcon</td></tr><tr><td>硝酸</td><td>Ricca</td><td>R5326000</td><td>20% 溶液</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19320-B</td><td>0.1% 溶液</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma</td><td>G7526</td><td>8% 溶液</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 标记的明胶</td><td>Invitrogen</td><td>G-13186</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明-鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>抗皮层肌动蛋白抗体（克隆 4F11）</td><td>Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>抗 FLAG 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB3118</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的山羊抗小鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>公共领域</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.macbiophotonics.ca/imagej/&quot; target=&quot;_blank">http://www.macbiophotonics.ca/imagej/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>AutoQuant X2.2 软件</td><td>Media Cybernetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

单细胞与多细胞环境中侵袭足介导的细胞外基质降解的定量测量

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

细胞向局部组织的侵袭是发育和稳态维持中的重要过程。侵袭过程的失调及随之发生的细胞迁移是多种病理过程的特征，包括炎症、心血管疾病和肿瘤细胞转移。1上皮或内皮基底膜中细胞外基质（ECM）成分的局灶性蛋白水解降解是启动细胞侵袭的关键步骤。在肿瘤细胞中，广泛的 体外 分析表明，细胞外基质的降解是由富含腹侧肌动蛋白的膜突起结构（称为侵袭性伪足）完成的2,3侵袭伪足在紧邻细胞外基质（ECM）的位置形成，并通过基质金属蛋白酶（MMPs）的作用调控ECM的降解。肿瘤细胞形成侵袭伪足的能力与其侵入局部间质及邻近血管结构的能力直接相关。3. 
利用荧光显微镜观察细胞在包被了染料标记基质蛋白的玻璃盖玻片上形成的侵袭伪足介导的细胞外基质（ECM）降解，已成为评估基质蛋白水解程度和细胞侵袭潜能的最常用技术4,5。本文介绍一种使用 commercially available Oregon Green-488 明胶偶联物制备荧光标记玻璃盖玻片的标准方法。该方法易于扩增，可快速制备大量包被的盖玻片。我们展示了在此过程中常遇到的一些常见显微镜伪影，并说明如何避免这些问题。最后，我们描述了使用 readily available 计算机软件进行定量分析的方法，以评估单个细胞及整个细胞群体介导的标记明胶基质降解情况。所述实验流程能够准确且可重复地监测侵袭伪足活性，也可作为评估调控蛋白表达或测试抗侵袭化合物在单细胞和多细胞环境下对细胞外基质降解效果的平台。

我们描述了一种用于制备荧光明胶包被的显微镜盖玻片的典型方法，以可视化由侵袭性伪足介导的基质降解。本文介绍了利用现有软件进行计算分析的技术，可用于定量混合细胞群体中单个细胞以及涵盖整个显微视野的多细胞群体所导致的基质蛋白水解水平。

细胞侵袭局部组织是发育和稳态维持过程中的重要环节。侵袭过程及其后续的细胞迁移若发生调控异常，……

该标准技术可制备适用于定量侵袭性细胞足体基质降解检测的荧光标记明胶包被盖玻片。将盖玻片用荧光标记明胶进行包被后，接种细胞并进行培养以实现基质降解。随后，固定细胞并用细胞足体标志蛋白的荧光染料进行染色，获取图像并定量分析基质降解情况。典型结果可以量化在特定基因差异性调控或药物处理条件下，细胞通过伪足介导的基质降解能力的差异。该方法的可视化演示至关重要，因为荧光明胶涂层盖玻片的制备过程难以实现均匀的荧光分布，这通常是由于荧光明胶涂层不均或对明胶包被盖玻片操作不当所致。本实验操作将由研究助理教授Karen Martin、博士后研究员Mandy Ammer以及研究生Elise Walk、Karen Hayes和Steve Markwell进行演示。配制未标记的5%明胶蔗糖储备溶液时，将明胶和蔗糖加入PBS中，在37摄氏度下完全溶解，然后在4摄氏度下保存。接着进行玻璃盖玻片的清洗。将单个盖玻片分别放入24孔塑料组织培养板的每个孔中，每孔加入500微升20%硝酸，孵育30分钟。移除硝酸溶液后，用去离子水洗涤盖玻片三次。接下来进行包被。将每张盖玻片加入 500 微升含 50 微克/毫升多聚赖氨酸的溶液，在室温下孵育 20 分钟。去除多聚赖氨酸溶液，用 PBS 洗涤三次。Poly-L-赖氨酸包被有助于上层标记明胶的均匀涂布和牢固结合。将 24 孔板置于冰上，并向每孔加入 500 微升新配制的 0.5% 戊二醛溶液。将培养板置于冰上孵育15分钟。用预冷的PBS洗涤三次，然后在包被明胶前彻底吸除所有PBS残留。在此期间，在戊二醛孵育过程中，重新配制Oregon Green 488标记的明胶。根据制造商的说明书，将标记的5%明胶蔗糖储存液和未标记的5%明胶蔗糖储存液均预热至37摄氏度。然后将500微升标记明胶加入到4毫升未标记明胶中进行稀释。用移液器将100微升稀释后的488标记明胶混合物滴加到每张盖玻片上。使用足量的明胶覆盖盖玻片，无需手动涂布。在包被过程中，必须将稀释的488明胶混合物保持在37摄氏度，以防止过早凝固。此外，从这一步开始，应尽可能将盖玻片避光保存，以避免潜在的光漂白。当所有盖玻片在同一块培养板上完成包被后，将培养板倾斜，通过真空抽吸去除每个孔中的多余明胶。随后将包被好的盖玻片置于室温下避光孵育10分钟。用PBS洗涤盖玻片三次后，加入500微升硼氢化钠溶液。加入氢化物后会产生气泡，每个盖玻片表面及周围均可见细小气泡。在室温下孵育15分钟，以还原并灭活残留的戊二醛。使用真空抽吸法，快速从每个孔的外围扫过，移除硼氢化钠溶液，注意避免吸走因处理而从组织培养板底部脱落的漂浮盖玻片。经过三次PBS洗涤后，将盖玻片在室温下置于70%乙醇中孵育30分钟。采用无菌技术，将含有盖玻片的培养板转移至II型B细胞培养用的超净工作台中，用无菌PBS通过无菌针头和镊子清洗盖玻片三次。小心

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生物学

定量测量的侵袭伪足介导的细胞外基质蛋白水解单和多细胞的情况下

肿瘤细胞侵袭三维细胞外基质的模型更能反映真实情况 体内...

三维集体细胞侵袭的建模与成像

本视频介绍了利用天然基质研究肿瘤细胞侵袭的技术。该检测方法能够在三维环境中评估上皮-间充质细胞相互作用，而无需使用合成或外源性基质。...

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本视频展示了用于评估细胞外基质刚度依赖性的定量延时显微镜技术 单核细胞增生李斯特菌...

定量延时显微镜技术用于评估细胞外基质刚度依赖性细菌扩散

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利用粒子追踪微流变学对三维肿瘤模型中细胞外基质刚度进行纵向测量

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三维胶原基质中细胞迁移的分析

肿瘤微环境中的机械刚度通过增强侵袭伪足活性和肌动球蛋白收缩力，在驱动恶性行为中起着关键作用。利用聚丙烯酰胺凝胶（PAAs），可通过侵袭伪足和牵引力测定方法研究癌细胞对基质刚度响应的侵袭性和收缩性特征。...

用于癌细胞侵袭足和牵引力测定的聚丙烯酰胺凝胶

本文介绍一种非侵入性方法，通过细胞-基质阻抗和活细胞成像分析，以高时间分辨率连续量化细胞黏附与去黏附过程。这些方法可揭示由基质修饰引发的细胞黏附/去黏附过程的动力学特征，以及其与黏附依赖性信号事件之间的时间关系。...

利用细胞-基质阻抗与活细胞成像技术实时测量基质修饰诱导的细胞黏附与去黏附动态变化

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用于研究线性侵袭体形成与活性的二维和三维基质

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分析三维培养物体外细胞侵袭的替代策略

了解如何使用荧光标记明胶包被盖玻片定量测量侵袭伪足介导的细胞外基质降解。该方法适用于单细胞和多细胞实验，结合荧光显微镜成像与ImageJ图像分析，可精确量化基质降解面积并评估细胞侵袭能力。

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