Name: Nanotopology细胞粘附在可变角度的全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学习使用可变角度全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM）测量细胞粘附纳米拓扑结构的方法。该技术可在纳米级精度下分析不同细胞系（如癌细胞与非癌细胞）的粘附差异，为细胞生物学和癌症研究提供重要见解。

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作者感谢巴登-符腾堡州政府、欧洲联盟—欧洲区域发展基金（Europäische Union - Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung）对 ZAFH-PHOTONn 项目的资助，感谢德国联邦教育与研究部（Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF）对研究资助项目编号 1792C08 的资助，以及感谢巴登-符腾堡基金会有限公司（Baden-Württemberg-Stiftung GmbH）对“Aurami”项目的经费支持。

1. 细胞接种与培养
<ol>
	<li>单细胞接种 例如 U373-MG 或 U-251-MG 胶质母细胞瘤细胞，接种密度通常为 100 个细胞/mm²2 在玻璃载玻片上培养细胞，并在培养基中培养48-72小时（例如 RPMI 1640 培养基，添加 10% 胎牛血清和抗生素，在培养箱中培养 37 °C 和5% CO2.</li>
	<li>将细胞与膜标记物共同孵育， 例如 6-十二烷酰基-2-二甲氨基萘（laurdan）以指定浓度处理60分钟 8 μM （在培养基中）4或细胞质标记物 例如 钙黄绿素乙酰甲酯以一定浓度处理40分钟 5 μM3或一种膜结合型光敏剂 例如 经其前体5-氨基乙酰丙酸（5-ALA；1 mM）孵育4小时后诱导生成的原卟啉IX4,5.</li>
	<li>在进行荧光显微镜观察前，使用培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
</ol>
2. VA-TIRFM
<ol>
	<li>使用直立显微镜， 例如 蔡司 Axioplan，并按照参考文献3所述，将其聚光镜替换为照明装置，该装置包含一个半球形或半圆柱形玻璃棱镜，通过光学耦合与样品载玻片连接（参见 图1).</li>
	<li>使用一束平行准直激光，该激光经玻璃棱镜成像及后续光学元件（例如 凹面镜）再次在样品表面形成平行光束（远心瞳孔光线）。注意确保电场矢量垂直于入射面偏振。</li>
	<li>使用位于聚光镜内部的可调反射镜，该反射镜成像于样品平面，并以可变的入射角（物光束）照射样品。该可调反射镜可由步进电机驱动，每个位置对应一个通过测角仪测量确定的明确定义的入射角。3.</li>
	<li>使用临界角 Θ 校准可调反射镜的角度位置c=61.3°，作为玻璃-水界面的固定值。θc 当荧光染料存在时，通过改变Θ可观察到其可视化现象例如 1 mM 黄素单核苷酸（FMN）溶于水中。镜面位于 Θ=Θ 处c 存储在镜片定位程序中。</li>
	<li>设置相机参数（背照式 Andor Ixon EMCCD，DV887DC，ANDOR Technology，Belfast，U.K.）6），包括温度、增益、记录时间以及扫描速度。</li>
	<li>使用适当放大倍数的物镜，并优先选择中等数值孔径（例如 40×/0.75 或 63×/0.90 水浸）并将样品载玻片置于显微镜下定位。使用浸油以确保样品与玻璃棱镜之间形成光学接触。在改变照明角度（Θ≥Θ）的条件下，对相同样品记录荧光图像。c 与 Θc 对应于 64.5° 用于细胞-玻璃界面）。一个角度范围 66°-74° 步骤包括 0.5° 建议使用1°。荧光检测时应选用合适的长通或带通滤光片。</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>读取在不同角度 Θ 下记录的图像（例如 ASCII 格式），以及相机设置（用于背景 discrimination）、激发波长，和玻璃（n1 = 1.52）与细胞（n2 = 1.37）的折射率，输入至分析程序（LabView；NanoCell）。对于每组参数，穿透深度 d(Θ) 和透射因子 T(Θ) 将自动计算。</li>
	<li>根据公式 5（膜标记）或公式 4（细胞质标记）选择用于分析细胞-基底距离 Δ 的图像。照明不均匀的单张图像（例如显示条纹）可予以排除。</li>
	<li>计算细胞-基底拓扑结构图像，并选择合适的颜色编码进行显示。在分析过程中，可显示单个像素的剖面图，如图 2所示。这些剖面图可作为拟合质量的参考指标。</li>
	<li>保存分析记录。</li>
</ol>
4. 代表性结果
代表性实验采用由南丹麦大学欧登塞分校分子肿瘤学系Jan Mollenhauer教授实验室提供的基因工程改造的U251-MG胶质母细胞瘤细胞进行。在这些U251细胞的两个亚克隆中，利用Tet-On诱导表达系统过表达肿瘤抑制基因TP53或PTEN，从而使这些细胞的致瘤潜能降低，可被视为恶性程度较低的细胞。未携带抑制基因的高恶性U251-MG细胞作为对照组，同时使用U251-MG野生型细胞进行进一步比较。激发光源采用半导体激光二极管（LDH400配PDL 800-B驱动器，Picoquant，德国柏林），发射近连续的皮秒脉冲序列（波长：391 nm；脉冲能量：12 pJ；重复频率：40 MHz）。
在 图3 TIRFM 图像显示激活了 TP53 肿瘤抑制基因并用 laurdan 孵育的 U251-MG 胶质母细胞瘤细胞8 μM；60 分钟）分别针对不同入射角进行展示 66.0°, 69.0° 和 73.0° 分别对应约140 nm、75 nm和60 nm的隐失电磁场穿透深度。随着穿透深度减小，荧光强度降低（见标尺），且荧光信号来源于细胞更表层的区域。例如 细胞边缘的黏着斑）。细胞-基质距离（以可视化方式显示在 图3d 通过0-600 nm的颜色编码显示，细胞间的差异显著，仅几纳米（白色-黄色）至250-300 nm（深红色）不等。 即 局灶性接触点与较大的细胞-基质距离彼此相邻。这一现象同样存在于PTEN抑癌基因被激活的U251-MG胶质母细胞瘤细胞中。图4d），而U251-MG对照组和野生型细胞的细胞-基底距离相对恒定，典型值为80-100 nm（黄色； 图4b）和150-200 nm（橙红色； 图 4a).
<img alt="显微镜光学装置；用于激发研究的光路示意图，包含反射镜、透镜和棱镜。" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 直立显微镜中用于VA-TIRFM的照明装置。由步进电机驱动的可调反射镜可实现±0.25°的角分辨率。
<img alt="静态平衡图 ln(I₀/T(ω)) 与 1/d(θ) nm⁻¹ 的关系及线性拟合；数据分析。" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 单个像素的评估曲线（示意图）。当将 ln[IF/T(Θ)] 对 1/d(Θ) 作图时，其斜率代表细胞-基底距离 Δ。该斜率通常可测定至约 ±10% 的精度。一个由非均匀照明导致的异常值已被标记并排除在分析之外。
<img alt="显示光谱拟合数据的灰度和颜色编码图的显微成像分析。" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
 图 3. U251-MG 胶质母细胞瘤细胞在与 Laurdan（8 μM；60 分钟）孵育后，TP53 抑癌基因激活状态下的全内反射荧光显微镜（TIRFM）图像，以不同照明角度记录（a-c）；通过颜色编码显示细胞与基底之间的距离范围为 0–600 nm（d）；激发波长：391 nm，检测波长：≥420 nm；图像尺寸：210 μm × 210 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="空间分布图；通过颜色标度识别多孔介质中的液体饱和度测量结果" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
 图 4. U251-MG 胶质母细胞瘤细胞与基底之间的距离在 0–600 nm 范围内，以颜色编码显示；(a) 野生型；(b) 对照组；(c) 抑癌基因 TP53 激活的细胞；(d) 抑癌基因 PTEN 激活的细胞；激发波长：391 nm，检测波长：≥420 nm；图像尺寸：210 μm × 210 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。

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<li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+microscopy%3A+technical+innovations+and+novel+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

一种用于以纳米级精度测量细胞-基质距离的方法。目前，超分辨率显微镜技术的方法， 例如 基于结构光照明显微技术7 或单分子检测8-10 以及受激发射损耗（STED）显微镜技术11 具有相当大的研究兴趣。然而，这些技术均无法实现低于 50 nm 的轴向分辨率。此外，所需的辐照度高达 50&shy;100 W/cm2 单分子方法需要超过 3,000 W/cm2 用于STED显微镜。这超过了太阳辐照度（约100 mW/cm²）2）高出几个数量级，因此很可能迅速对活细胞造成损伤。然而，在VA-TIRFM实验中，辐照强度可被限制在20 mW/cm²以下2，可在不损伤活细胞的情况下实现数分钟甚至数小时的曝光时间12因此，进行多次曝光的长期实验显得完全可行。每次实验的主要先决条件是良好的角度校准以及对洁净样品载玻片的均匀照明。
VA-TIRFM 可应用于与技术或生物表面相关的众多研究领域，例如</e...

当一束光在折射率为 n1 的介质中传播并遇到折射率为 n2 &lt; n1 的第二种介质的界面时，若入射角 Θ 大于临界角 Θc = arcsin(n2/n1)，则会发生全内反射。尽管入射光束被完全反射，但仍会激发出一种倏逝电磁场，该场会穿透进入第二种介质，并随垂直于界面的距离 z 呈指数衰减，其强度表示为 I(z) = I0 e-z/d(Θ)。其中 I(z) 表示电磁场的强度，d(Θ) 表示在波长 λ 下的穿透深度，其表达式为 
 
d(Θ) = (λ/4π) (n12 sin2Θ - n22)-1/2
如文献报道1,2，I0 对应于入射光强 Ie 与透射系数 T(Θ) 及比值 n2/n1 的乘积。若该光束的电场矢量垂直于入射面（即 由入射光束与反射光束所张成的平面）偏振，则该透射系数由下式给出： 
 
T(Θ) = 4 cos2 Θ / [1 - (n2/n1)2]
在TIRFM测量中，对于检测到的荧光强度，必须将样品所有层的光吸收进行积分，并乘以相关染料的荧光量子产率η以及检测的立体角Ω。如先前报道3，该强度可由下式描述： 
 
IF (Θ) = A T(Θ)òc(z) e-z/d(Θ) dz
如果将所有与入射角Θ和坐标z无关的因素都归入实验常数A中，则当荧光分子的浓度c(z)被视为几乎恒定时，方程3可解析求解
- 或在所有 z ≥ Δ 的坐标处，例如，位于距界面距离为 Δ 的细胞的细胞质内。在此情况下，积分需从 z = Δ 计算至 z = ∞，结果为 
 
IF = A c T(Θ) d(Θ) e-Δ/d(Θ)
- 或在 z = Δ - t/2 与 z = Δ + t/2 之间，即厚度为 t 的薄层内，例如位于距界面距离为 Δ 处的细胞膜。在此情况下，若 t 远小于 Δ，则荧光强度可计算为 
 
IF = A c T(Θ) t e-Δ/d(Θ)， 
 
其中 t 与 Δ 相比很小。
根据公式（4）和（5），若记录了不同角度 Θ 下的荧光强度图像 IF，并以 1/d 的函数形式评估 ln (IF / T d)（公式 4）或 ln (IF / T)（公式 5），即可计算细胞-基底距离 Δ。本文所用的膜标记物 laurdan（见下文）采用公式（5）进行评估。
如先前报道3，图像采集与评估需要满足以下条件： 
- 激发光在样品上均匀分布， 
- 符合双层模型（基底和细胞质的折射率分别为 n1 和 n2）。当细胞质膜非常薄，且细胞与基底之间的细胞外介质层厚度远小于入射光波长时，该条件成立。
此外，采用中等数值孔径（通常 A ≤ 0.90）的显微镜物镜有利于避免因介质界面近场辐射各向异性导致的亮度偏差。

<table><tbody><tr><td>培养箱</td><td>Nunc</td><td>Nunc Cellstar&lt;br/&gt; QM1300SVBA</td><td></td></tr><tr><td>层流柜</td><td>Holten Safe</td><td>S2010 1.2 EN GG 1LN</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + 10%FCS + 1% 青霉素/链霉素</td><td>BIOCHROM</td><td></td><td>培养基</td></tr><tr><td>玻璃载玻片</td><td>Marienfeld</td><td>纯白玻璃</td><td>采用特殊清洗程序</td></tr><tr><td>6-十二酰基-2-二甲氨基萘（laurdan）</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>荧光标记物（储备液：2 mM 乙醇溶液）</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axioplan 1</td><td></td></tr><tr><td>激光二极管</td><td>PicoQuant</td><td>LDH 400 配驱动器 PDL 800-B</td><td>波长：391 nm</td></tr><tr><td>单模光纤系统</td><td>Point Source</td><td>kineFlex</td><td>与准直光学元件联用</td></tr><tr><td>EMCCD 相机</td><td>Andor</td><td>DV887DC</td><td>背照式相机</td></tr></tbody></table>

可变角度全内反射荧光显微镜下细胞黏附的纳米拓扑结构

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

利用变角全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM），可实现对细胞在基底上生长时表面拓扑结构的纳米级精度测定。e.g.，将细胞培养在透明载片上，并与均匀分布于其质膜中的荧光标记物共同孵育。通过平行激光束以不同全内反射（TIR）角度进行照射，产生具有不同穿透深度的渐逝电磁场，从而实现照明。在约10个不同角度照射下采集荧光图像，即可计算出细胞与基底之间的距离，精度达数纳米。由此可确定不同细胞系之间黏附性的差异，e.g. 癌细胞与低度恶性细胞之间的差异。此外，还可检测化学或光动力处理对细胞黏附性可能造成的变化。与其他超分辨率显微技术相比，该方法的光照暴露强度极低，不会对活细胞造成损伤。

通过变角全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM），可实现对细胞在基底上黏附拓扑结构的纳米级精度测量。

表面拓扑结构（例如在基底上生长的细胞）可通过变角全内反射荧光显微技术以纳米级精度测定……

本实验的总体目标是以前所未有的纳米级精度测量细胞在基底上的黏附拓扑结构。该目标通过以下步骤实现：首先在透明玻璃盖玻片上培养细胞，并用荧光标记物孵育细胞；随后校准显微镜可调反射镜的角度位置，并将该位置信息存储至反射镜定位程序中。下一步是在约10个不同角度照射下记录荧光图像。最后一步是计算细胞与基底之间的距离，精度达到几纳米。最终，通过细胞在基底上黏附拓扑结构的结果，展示不同细胞系之间黏附性的差异，例如癌细胞与低度恶性细胞之间的差异。与共聚焦显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于其实际分辨率仅在几个纳米的范围内。尽管该方法可用于研究细胞膜，但也可应用于其他体系，例如小囊泡或纳米材料。本次实验将由我们的博士后 Petra 演示，她将负责制备细胞样本，以及由我们的工程师 Michael Wagner 演示实验操作。为进行变角全内反射荧光显微镜观察，需在玻璃载片上接种单个细胞，密度为每平方毫米 100 个细胞，培养基中需添加 10% 胎牛血清和抗生素。将细胞在 37°C、5% CO₂ 的培养箱中培养 72 小时。接下来，在培养基中加入终浓度为 8 µM 的荧光膜染料六氟化二氯、癸二、二甲基氨基萘或洛瑞胺，作用于细胞，孵育 60 分钟后进行荧光显微镜观察。用 PBS 洗涤细胞，将缓冲液通过移液器滴加至载玻片表面以去除培养基，随后擦去载玻片背面的缓冲液。使用配备背照式和/或 Exeon E-M-C-C-D 相机的正置显微镜（如 Zeiss Axio plan）进行可变角度观察。全内反射荧光显微镜（T-I-R-F-M）将其聚光器替换为一个定制的照明装置，该装置包含一个与样品载玻片光学耦合的半圆柱形玻璃棱镜。激光束从准直的单模光纤入射，经过玻璃棱镜成像以及后续光学元件的作用后，在样品表面再次形成平行光束。需注意确保电场矢量偏振方向垂直于入射面。该位置在光纤输出耦合器上标出。使用位于聚光镜内部的可调反射镜，该反射镜成像于样品平面，并以可变的入射角或物方光线角度照射样品。该可调反射镜可通过步进电机驱动，由软件控制。每个位置对应一个由几何测量确定的明确定义的入射角。为了校准可调反射镜的角度位置，可使用一种荧光染料，例如1毫摩尔的黄素核苷酸，溶于水中。为了在入射角变化时观察临界角现象，可采用玻璃-水界面的临界角61.3度作为固定值；当入射角等于该临界角时，反射镜对应的角度位置将被记录在反射镜定位程序中。使用相机软件设置 E-M-C-C-D 相机的参数，包括温度增益、记录时间以及移位速度。使用浸油确保样品的光学接触。通过玻璃棱镜，为细胞选择适当放大倍数和中等数值孔径的物镜。为了在显微镜下观察样品，应使用合适的长通或带通滤光片进行荧光检测。在改变照明角度的情况下，记录相同样品的荧光图像。入射角应等于或大于临界角。对于细胞-玻璃界面，当临界角对应为64.5度时，建议采用66度至74度的角范围，步长为0.5度或1度。开始数据分析时，使用LabVIEW程序读取在不同角度下记录的图像，以及相机设置、激发波长和折射率。对于玻璃（折射率为1.52）和细胞（折射率为1.37），需导入这些设置以正确评估数据。对于每组参数，系统将自动计算穿透深度和透射系数，以确保实验步骤的成功。图像的仔细记录和选择对分析至关重要。根据方程选择用于评估细胞与基质间距离的图像。对于膜标记物，在均匀照明条件下的单个图像（如本示例所示）可被排除。计算细胞基质拓扑结构的图像，并在评估期间选择合适的颜色编码进行显示。单个像素的轮廓可如本图所示进行展示。这些曲线可作为评估拟合质量的指标。最后，保存评估方案。该图显示了具有激活型 TP 53 肿瘤抑制基因的 U2 51 mg 胶质母细胞瘤细胞的全内反射成像。在以不同入射角孵育后进行检测，其中66度对应于约140纳米的隐逝电磁场穿透深度，69度对应于75纳米的穿透深度，73度对应于60纳米的穿透深度，穿透深度随角度增加而减小。随着穿透深度降低，荧光强度减弱，并主要来源于细胞更表层的区域，例如细胞边缘的黏着斑。细胞与基质之间的距离在D图中以颜色编码表示，范围从0到600纳米，如图所示。细胞与基质之间的距离在细胞区域内变化显著，仅几纳米的距离以白色到黄色表示，而250至300纳米的距离以深红色表示。这表明局灶性接触点与较大的细胞-基质距离彼此相邻。对于P53基因激活的U251MG胶质母细胞瘤细胞，计算得出的细胞-基质距离也表现出类似的变异特征。相比之下，由黄色表示的U2 51 mg对照细胞以及由橙色到红色表示的野生型细胞，其细胞与基质的距离在发育后相对恒定。该技术为细胞-基质拓扑学领域的研究人员探索肿瘤细胞及激光治疗后的形态学变化奠定了基础。观看本视频后，您应能充分理解如何在低光照暴露（对活体生物具有良好的耐受性）条件下，以纳米级实际分辨率对表面进行可视化观察。

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Nanotopology细胞粘附在可变角度的全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM）

全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种强大的技术，可用于高对比度和高时间分辨率地观察靠近细胞表面的结构。我们展示了如何利用TIRF研究细胞壁包被的细菌和真菌细胞皮层中的蛋白质动态。...

使用全内反射荧光显微镜观察微生物皮层结构与动态

本视频介绍了TIRF技术，这是一种基于全内反射显微镜的方法，用于观察肌动蛋白和微管聚合的动态过程。该方法能够实现对肌动蛋白与微管偶联动态的高分辨率实时成像，对于理解细胞间相互作用至关重要。...

利用TIRF显微镜观察肌动蛋白与微管耦联动力学

来源：Daniele, F., 等 利用全内反射荧光显微镜和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动力学：细胞成像与数据分析。J. Vis. Exp.

使用全内反射荧光显微镜进行细胞成像

将介绍一种先进的显微镜，该显微镜能够对分离的质膜及其周围的细胞内体积进行快速且高分辨率的成像。将转盘共聚焦显微技术与全内反射荧光显微技术集成于同一系统，可实现高达每3.5秒获取一幅图像堆栈的高速活细胞成像实验。...

利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

我们介绍了一种成像方法，用于测定活细胞质膜中由配体结合诱导的mEGFP标记受体寡聚体的平均寡聚状态。该方案基于全内反射荧光（TIRF）显微镜结合粒子数与亮度（N&amp;B）分析。...

结合全内反射荧光显微镜与数目和亮度分析法研究活细胞中细胞表面受体的寡聚化动态

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

近紫外光刻技术与牵引力显微镜相结合，用于测量细胞在微图案化水凝胶上的作用力。通过靶向光诱导单个细胞释放，可在同一样本上进行大量测量。...

利用水凝胶图案化技术调控细胞黏附在牵引力显微镜中的应用

我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。...

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

本方案旨在通过可视化动态微丝和微管提供操作指南 体外 全内反射荧光（TIRF）显微镜检测...

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

本方案描述了如何使用全内反射荧光显微镜（TIRF）追踪支撑脂质膜中的单个离子通道并测定其活性，从而阐明侧向膜运动与通道功能之间的相互作用。方案详细介绍了如何制备膜样品、记录数据以及分析结果。...

使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

学习使用可变角度全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM）测量细胞粘附纳米拓扑结构的方法。该技术可在纳米级精度下分析不同细胞系（如癌细胞与非癌细胞）的粘附差异，为细胞生物学和癌症研究提供重要见解。

可变角度全内反射荧光显微镜下细胞黏附的纳米拓扑结构

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