可变角度全内反射荧光显微镜下细胞黏附的纳米拓扑结构

本实验的总体目标是以前所未有的纳米级精度测量细胞在基底上的黏附拓扑结构。该目标通过以下步骤实现：首先在透明玻璃盖玻片上培养细胞，并用荧光标记物孵育细胞；随后校准显微镜可调反射镜的角度位置，并将该位置信息存储至反射镜定位程序中。

下一步是在约10个不同角度照射下记录荧光图像。最后一步是计算细胞与基底之间的距离，精度达到几纳米。最终，通过细胞在基底上黏附拓扑结构的结果，展示不同细胞系之间黏附性的差异，例如癌细胞与低度恶性细胞之间的差异。

与共聚焦显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于其实际分辨率仅在几个纳米的范围内。尽管该方法可用于研究细胞膜，但也可应用于其他体系，例如小囊泡或纳米材料。

本次实验将由我们的博士后 Petra 演示，她将负责制备细胞样本，以及由我们的工程师 Michael Wagner 演示实验操作。为进行变角全内反射荧光显微镜观察，需在玻璃载片上接种单个细胞，密度为每平方毫米 100 个细胞，培养基中需添加 10% 胎牛血清和抗生素。将细胞在 37°C、5% CO₂ 的培养箱中培养 72 小时。

接下来，在培养基中加入终浓度为 8 µM 的荧光膜染料六氟化二氯、癸二、二甲基氨基萘或洛瑞胺，作用于细胞，孵育 60 分钟后进行荧光显微镜观察。用 PBS 洗涤细胞，将缓冲液通过移液器滴加至载玻片表面以去除培养基，随后擦去载玻片背面的缓冲液。使用配备背照式和/或 Exeon E-M-C-C-D 相机的正置显微镜（如 Zeiss Axio plan）进行可变角度观察。

全内反射荧光显微镜（T-I-R-F-M）将其聚光器替换为一个定制的照明装置，该装置包含一个与样品载玻片光学耦合的半圆柱形玻璃棱镜。激光束从准直的单模光纤入射，经过玻璃棱镜成像以及后续光学元件的作用后，在样品表面再次形成平行光束。需注意确保电场矢量偏振方向垂直于入射面。

该位置在光纤输出耦合器上标出。使用位于聚光镜内部的可调反射镜，该反射镜成像于样品平面，并以可变的入射角或物方光线角度照射样品。该可调反射镜可通过步进电机驱动，由软件控制。

每个位置对应一个由几何测量确定的明确定义的入射角。为了校准可调反射镜的角度位置，可使用一种荧光染料，例如1毫摩尔的黄素核苷酸，溶于水中。为了在入射角变化时观察临界角现象，可采用玻璃-水界面的临界角61.3度作为固定值；当入射角等于该临界角时，反射镜对应的角度位置将被记录在反射镜定位程序中。

使用相机软件设置 E-M-C-C-D 相机的参数，包括温度增益、记录时间以及移位速度。使用浸油确保样品的光学接触。通过玻璃棱镜，为细胞选择适当放大倍数和中等数值孔径的物镜。

为了在显微镜下观察样品，应使用合适的长通或带通滤光片进行荧光检测。在改变照明角度的情况下，记录相同样品的荧光图像。入射角应等于或大于临界角。

对于细胞-玻璃界面，当临界角对应为64.5度时，建议采用66度至74度的角范围，步长为0.5度或1度。开始数据分析时，使用LabVIEW程序读取在不同角度下记录的图像，以及相机设置、激发波长和折射率。对于玻璃（折射率为1.52）和细胞（折射率为1.37），需导入这些设置以正确评估数据。

对于每组参数，系统将自动计算穿透深度和透射系数，以确保实验步骤的成功。图像的仔细记录和选择对分析至关重要。根据方程选择用于评估细胞与基质间距离的图像。

对于膜标记物，在均匀照明条件下的单个图像（如本示例所示）可被排除。计算细胞基质拓扑结构的图像，并在评估期间选择合适的颜色编码进行显示。单个像素的轮廓可如本图所示进行展示。

这些曲线可作为评估拟合质量的指标。最后，保存评估方案。该图显示了具有激活型 TP 53 肿瘤抑制基因的 U2 51 mg 胶质母细胞瘤细胞的全内反射成像。

在以不同入射角孵育后进行检测，其中66度对应于约140纳米的隐逝电磁场穿透深度，69度对应于75纳米的穿透深度，73度对应于60纳米的穿透深度，穿透深度随角度增加而减小。随着穿透深度降低，荧光强度减弱，并主要来源于细胞更表层的区域，例如细胞边缘的黏着斑。细胞与基质之间的距离在D图中以颜色编码表示，范围从0到600纳米，如图所示。

细胞与基质之间的距离在细胞区域内变化显著，仅几纳米的距离以白色到黄色表示，而250至300纳米的距离以深红色表示。这表明局灶性接触点与较大的细胞-基质距离彼此相邻。对于P53基因激活的U251MG胶质母细胞瘤细胞，计算得出的细胞-基质距离也表现出类似的变异特征。

相比之下，由黄色表示的U2 51 mg对照细胞以及由橙色到红色表示的野生型细胞，其细胞与基质的距离在发育后相对恒定。该技术为细胞-基质拓扑学领域的研究人员探索肿瘤细胞及激光治疗后的形态学变化奠定了基础。观看本视频后，您应能充分理解如何在低光照暴露（对活体生物具有良好的耐受性）条件下，以纳米级实际分辨率对表面进行可视化观察。