Nanotopology细胞粘附在可变角度的全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM）
October 2nd, 2012
细胞粘附在基板上的拓扑结构是由可变角度的总内部反射荧光显微镜（VA-TIRFM）与纳米精度测量。
该程序的总体目标是以纳米精度测量基板上细胞粘附的拓扑结构。这是通过首先在透明载玻片上培养细胞并与荧光标记物一起孵育来实现的。然后校准显微镜可调镜的角度位置，并将该位置存储在镜定位程序中。
下一步是记录以大约 10 个不同角度照射时的荧光图像。最后一步是以几纳米的精度计算细胞衬底距离。最终，细胞粘附在基质上的拓扑结果用于显示各种细胞系之间的粘附差异，例如癌细胞和恶性较低的细胞。
与共聚焦显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是实际分辨率仅在几纳米范围内。虽然这种方法可以提供对细胞膜的了解。它也可以应用于其他系统，例如小囊泡或纳米材料。
演示实验的是我们的博士后 Petra，他将准备细胞样品，我们的工程师 Michael Wagner 将进行实验，以准备用于可变角度全内反射的细胞。荧光显微镜将单个细胞以每平方毫米 100 个细胞的密度接种在补充有 10% 胎牛、血清和抗生素的培养基中的载玻片上。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中培养细胞 72 小时。
接下来，将荧光膜、标记物 6 D、十醇 2、二甲基氨基萘或氯烷以 8 微摩尔的浓度应用于细胞，培养基在荧光显微镜下孵育 60 分钟。用 PBS 洗涤细胞，将缓冲溶液移液到目标载玻片上以去除培养基，然后擦去目标载玻片背面的缓冲溶液。配备背照式和/或外显子 E-M-C-C-D 相机的正置显微镜（如 Zeiss Axio plan）用于可变角度。
T-I-R-F-M 用定制的照明装置取代其聚光镜，该装置带有一个光学耦合到物体载玻片的半圆柱形玻璃棱镜。激光束从整理的单模光纤入射，在玻璃棱镜和进一步的光学元件成像后，再次在样品表面产生平行光束。注意电场矢量是极化的，垂直于事件平面。
此位置标记在光纤的输出耦合器上。使用位于聚光镜内部的可调节镜子，该镜子在样品平面中成像，并在可变角度的入射或物光线下照亮样品。可调镜可由步进电机驱动，步进电机由软件控制。
每个位置对应于由 go 度量进行测量确定的明确定义的事件角度。要校准可调镜子的角度位置，请使用溶解在水中的荧光染料，例如一个毫摩尔黄素核苷酸。为了可视化入射角度变化时的临界角，使用玻璃水过渡的 61.3 度临界角作为固定值，入射角等于临界角的镜子角度位置存储在镜子定位程序中。
使用相机软件，设置 E-M-C-C-D 相机的参数，包括温度增益、录制时间和换挡速度。使用浸油确保样品的光学接触。使用玻璃棱镜，为细胞选择适当放大倍率和适度数值孔径的物镜。
要在显微镜中观察物体，请使用适当的长通或带通滤光片进行荧光检测。在照明角度变化时记录相同样品的荧光图像。事件的角度应等于或大于临界角度。
对于单元玻璃界面，临界角对应于 64.5 度，建议的角度范围为 66 度至 74 度，步长为 0.5 度或 1 度。要开始数据分析，请使用实验室视图程序读取以不同角度记录的图像以及相机设置、激发波长和折射率。对于玻璃 （1.52） 和单元格 （1.37），将导入设置以正确评估数据。
对于每组参数，都会自动计算穿透深度和传输系数 为了手术的成功。仔细记录和选择图像进行分析非常重要。根据方程选择用于评估细胞基质距离的图像。
对于膜标记物，可以排除均匀照明中的单个图像，如本例所示。计算细胞衬底拓扑的图像，并选择合适的颜色代码在评估期间显示。单个像素的配置文件可以如图所示显示。
这些轮廓可以用作拟合质量的指标。最后，存储评估协议。该图描绘了具有激活的 TP 53 肿瘤抑制基因的 U2 51 mg 胶质母细胞瘤细胞的全内反射图像。
在与 luan 孵育时，以不同的入射角度记录，66 度对应于约 140 纳米的倏逝电磁场的穿透深度，69 度对应于 75 纳米的穿透深度，73 度对应于 60 纳米的穿透深度，随着穿透力的降低。深度荧光强度降低，源自细胞的更浅表部位，例如细胞边缘的局灶接触。图 D 中用颜色代码表示细胞衬底距离，范围从 0 到 600 纳米，如图所示。
细胞衬底距离在细胞上差异很大，只有几纳米（白色到黄色）和 250 到 300 纳米（深红色）。这表明焦点接触和较大的细胞基质距离很近。对于具有激活的抑癌基因 P 10 的 U2 51 mg 胶质母细胞瘤细胞，计算了细胞底物距离的类似变化。
相比之下，以黄色为代表的 U2 51 mg 对照细胞和以橙色至红色表示的野生型细胞发育后的细胞基质距离相当恒定。这项技术为细胞基质拓扑学领域的研究人员探索肿瘤细胞和激光治疗后的形态变化铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何在低光照下以纳米范围内的实际分辨率可视化表面有很好的了解，这对于生物体来说是可以容忍的。
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概述
此程序使用可变角度全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM）以纳米级精度测量细胞在基底上的粘附拓扑。它包括在玻璃片上培养细胞，并使用荧光成像来分析不同细胞系之间的粘附差异。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞粘附
- 荧光显微镜
- 细胞生物学
背景
- 理解细胞粘附对于各种生物过程至关重要。
- 荧光标记物增强了细胞相互作用的可视化。
- VA-TIRFM允许在纳米尺度上进行精确测量。
- 不同的细胞系表现出不同的粘附特性。
研究目的
- 以高精度测量细胞粘附拓扑。
- 比较癌细胞和非癌细胞之间的粘附。
- 提高对细胞在基底上相互作用的理解。
使用的方法
- 在透明玻璃片上培养细胞。
- 用荧光标记物孵育。
- 校准显微镜的可调节镜片。
- 在多个角度记录荧光图像。
主要结果
- 实现了细胞-基底距离的精确测量。
- 观察到不同细胞系之间的粘附差异。
- 结果有助于理解细胞在不同情况下的行为。
结论
- VA-TIRFM有效用于研究细胞粘附拓扑。
- 研究结果可能对癌症研究有重要意义。
- 进一步的研究可以探索其他细胞类型和条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
VA-TIRFM enables nanometer-scale measurement of cell-substrate adhesion, providing quantitative data to de-risk target validation in oncology and mechanobiology. By resolving adhesion differences between malignant and non-malignant cell lines, the method supports predictive confidence in early discovery. Its low phototoxicity and compatibility with live-cell imaging allow longitudinal assessment of adhesion dynamics under compound or genetic perturbation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures nanoscale variations in cell adhesion to interrogate therapeutic hypotheses involving integrin signaling or cytoskeletal regulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by correlating adhesion phenotypes with genetic or pharmacological perturbations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize aberrant adhesion in cancer models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative adhesion readouts across multiple illumination angles for reproducible screening campaigns.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and automated angle control for medium-throughput adhesion profiling.
- Data Quality: Penetration depth modulation allows discrimination of superficial versus deep adhesion sites, reducing false positives in hit selection.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly compares adhesion topology in cancer versus control cells, aligning with mechanistic de-risking in tumor microenvironment studies.
- Translational Continuity: Links molecular perturbations to functional adhesion outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go criteria based on adhesion normalization thresholds in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
VA-TIRFM fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, particularly when adhesion is a functional readout of pathway activity.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or inhibitors alter nanoscale adhesion patterns.
- Screening: Delivers reproducible, angle-resolved fluorescence data to standardize adhesion assays across compound libraries.
- Analytics: Provides nanometer-precision distance measurements and penetration depth calculations to enable condition comparisons.
- Translational Research: Connects adhesion changes to disease models only when supported by comparative cell line data, as shown in cancer versus control comparisons.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for adhesion profiling across cell types, substrates, and perturbation conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in adhesion-related targets through direct, nanoscale phenotypic measurement.
- Operational Value: Ensures standardization via calibrated angular steps and automated penetration depth modeling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking adhesion phenotypes to target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on adhesion normalization in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, optical alignment, and evanescent wave theory.
- Needs a custom illumination device with adjustable mirror, glass prism, and polarized laser source.
- Demands standardization of cell seeding density, marker incubation, and angle-specific image acquisition.
- Involves adaptation considerations for different cell morphologies and substrate refractive indices.
- Limited to systems compatible with total internal reflection geometry and fluorescent membrane labeling.
