小规模的核提取物，基因表达机具功能分析

以下实验的总体目标是使用从细胞中提取的功能性核机制检测基因表达。这是通过首先在肿胀的 hela 细胞中收获来实现的。接下来，通过向下压接细胞，然后在第三步中离心以沉淀细胞核。

细胞核进行盐提取、浓缩和透析，以获得可溶性和功能性基因表达机制。最终，可以根据核提取物的转录和剪接活性来评估核提取物的功能，这是用偶联 RNA 聚合酶与转录和剪接系统评估的。与大量细胞核提取物制备等现有方法相比，该技术的主要优点是，使用这种技术，可以使用少量细胞来制备细胞核提取物。

首先将 hela 细胞接种在三个 150 毫米平板上，使用补充有 FBS 和抗生素的 DMEM 培养基，在含有 5%CO 2 的 37 摄氏度培养箱中培养培养物，直到细胞此时达到 90%Co 流度，从 HELOC 细胞培养物中吸出培养基，并用 13 毫升室温洗涤一次。然后吸出每板的 PBS。PBS 将每个板侧放几秒钟，然后吸出其余的 PBS。

接下来，使用细胞提升器将细胞刮到每个板的底部边缘，然后将细胞拉入 1.5 毫升的 einor 管中。最后，在微量离心中以 100 倍 G 和 4 摄氏度沉淀细胞 5 分钟。现在从细胞沉淀中吸出 PBS，并通过查看试管上的渐变来估计填充的细胞体积或 PCV。

然后向细胞沉淀中加入两倍体积的低渗缓冲液 PCV。轻轻摇动试管以重悬。细胞用 1000 微升移液管轻轻上下移液细胞悬液，以根据需要移开细胞簇。

然后在与以前相同的离心条件下沉淀细胞。离心后，小心吸出低渗缓冲液层。细胞开始肿胀，细胞体积将增加到约 750 至 1000 微升。

添加新的低渗缓冲液至最终体积为 1.5 mL，并将细胞重悬于缓冲液中。再。最后，在细胞冷却期间，将重悬的肿胀细胞在冰上孵育 10 分钟。用低渗缓冲液冲洗羽绒均质器，然后将其与细胞一起放在冰上。

然后使用精细的任务刮水器（如 Kim 湿巾）擦干杵。使用 1000 μL 加长微量移液器吸头从下沉处去除缓冲液。现在使用移液器将冷藏的肿胀细胞转移到 downs Down 中。

是此程序中最棘手的部分，以成功检查裂解。每次在显微镜下下降后，慢慢地上下移动 Down 的紧杵五次以虱子细胞，小心避免气泡。接下来，将 5 微升 Eloqua 的 lys 细胞悬液转移到 einor 管中，并加入 10 微升 trian blue 和 15 微升 1 μL 的 1 XPBS。

将细胞溶液加入载玻片中，在光学显微镜下检查细胞是否裂解，lys 细胞的细胞核在 3 盎司后会呈蓝色。由于可以看到许多活细胞，因此裂解不足。5 盎司后，裂解足够。

最后，将 lys 细胞转移到预冷的 einor管中，并在 1500 倍 G 和 4 摄氏度的微量离心中将细胞悬液旋转 5 分钟。然后小心地将 super natin 转移到新管中，不要破坏沉淀。现在，通过查看管上的渐变来估计贴片核体积或 PNV。

用 PNV 一半的低盐缓冲液填充微量移液器吸头。然后将微量移液器吸头插入 einor 管底部的细胞核中。慢慢将缓冲液喷入细胞核中，同时轻轻混合。

轻轻弹动试管，确保沉淀完全重悬。接下来，加入 PNV 一半的高盐缓冲液，并通过倒置试管快速混合一次。在 4 摄氏度下旋转试管 30 分钟。

最后，在微量离心机中以 18， 000 倍 G 和 4 摄氏度的速度将细胞核向下旋转 15 分钟。首先将 500 微升上清液转移到冷藏的微量混合物中。离心后，将高盐核提取物以 14， 000 倍 G 和 4 摄氏度离心 15 分钟，倒置微型 Racon 并将其放入新的单独 EOR 管中。

在 1000 倍 G 和 4 摄氏度下旋转两分钟后，高盐核提取物将被浓缩至约 115 微升。现在将 45 微升等分试样的高盐核提取物转移到小型透析 SLI 中。确保载玻片的底部与浮子的底部在一起。

然后将 SLI 放入 500 毫升冷冻透析缓冲液中。最后，将等分试样在 4 摄氏度下搅拌一到两个小时，透析后核提取物会出现混浊。该图显示了比较小规模核提取物与大量核提取物中偶联 RNA 聚合酶、两种转录和切片反应的代表性数据。

当 A-C-M-V-D-N-A 构建体在散装或小规模提取物中孵育时，在添加 α 和 manin 后的 5 分钟时间点合成相似水平的新生前体 mRNA，以阻断进一步转录，剪接中间体和剪接产物随着时间的推移积累，在两种类型的提取物中具有相似的动力学。这些代表性结果证实，偶联 RNA 聚合酶两种转录和剪接系统的效率在大块和小规模核提取物中相似。为了证明小规模提取物的实用性，从用剪接抑制剂 E 7 1 0 7 或阴性对照化合物 Platy 分析 F 处理的 hela 细胞中制备方法提取物，然后进行偶联 RNA 聚合酶 2 转录和剪接测定，如图所示，RNA 聚合酶 2 的转录在从处理的格子 F 和 E 7 1 0 7 制备的提取物中有效发生细胞。

相反，剪接在从分析 F 处理的细胞制备的提取物中正常发生，但在 E 7 1 0 7 处理的细胞中被消除。这些数据为使用小规模细胞核提取物对小规模细胞进行特殊处理提供了概念验证。一旦掌握，这项技术可以在不到五个小时的时间内完成。