用于基因表达机制功能检测的小规模核提取物

以下实验的总体目标是利用从细胞中提取的功能性细胞核机制来检测基因表达。首先通过使Hela细胞膨胀来收集细胞；接着，在第二步中通过破碎细胞并离心，使细胞核形成沉淀。

通过盐提取、浓缩和透析细胞核，以获得可溶且具有功能的基因表达系统。最终，可通过偶联RNA聚合酶的转录与剪接体系来评估核提取物的转录和剪接活性，从而评价其功能。该技术相较于现有的大量核提取物制备方法的主要优势在于，仅需少量细胞即可制备核提取物。

将HeLa细胞接种于三块150毫米培养皿中，每皿加入含FBS和抗生素的DMEM培养基，在37°C、5% CO₂的培养箱中培养，直至细胞融合度达到90%。此时吸除HELa细胞培养皿中的培养基，每皿用13毫升室温PBS洗涤一次，随后吸除PBS，将每块培养皿侧置数秒钟，吸除残留的PBS。

接下来，使用细胞刮刀将细胞刮至每个培养板的底部边缘，然后将细胞转移至1.5毫升离心管中。最后，在4°C条件下，以100 × g离心5分钟，使细胞沉淀。随后吸除细胞沉淀中的PBS，并通过观察离心管上的刻度来估算压积细胞体积（PCV）。

然后向细胞沉淀中加入两倍于红细胞压积体积的低渗缓冲液。轻轻振荡离心管以重悬细胞，并根据需要使用1000微升移液器上下轻柔吹打细胞悬液，以分散细胞团块。

然后在与之前相同的离心条件下沉淀细胞。离心后小心吸除低渗缓冲液层。此时细胞已开始肿胀，细胞体积将增加至约 750 至 1000 微升。

加入低渗缓冲液至终体积为1.5毫升，并用缓冲液重悬细胞。再次操作后，将重悬的肿胀细胞置于冰上孵育10分钟，期间保持细胞低温。用低渗缓冲液冲洗Dounce匀浆器，然后将其与细胞一同放置于冰上。

然后使用精细擦拭纸（如 Kim 擦拭纸）将研钵擦干。用一支 1000 微升加长微量移液枪头吸除下层液体。接着使用移液枪将已冷却膨胀的细胞转移至下层液体中。

该操作中最关键的步骤是检查裂解是否成功。每次使用Dounce匀浆器后，在显微镜下观察样品，缓慢上下移动Dounce匀浆器的紧配合杵5次以裂解细胞，注意避免产生气泡。接着，取5 µL裂解后的细胞悬液转移至一个Eppendorf管中，加入10 µL台盼蓝染液和15 µL 1× PBS。

将细胞悬液加入载玻片，在光学显微镜下观察细胞裂解情况，裂解后的细胞核经三盎司处理后呈蓝色。此时裂解不充分，因仍可见大量活细胞。经五盎司处理后，裂解充分。

最后将裂解后的细胞转移至预冷的Eppendorf管中，在4°C条件下，于微量离心机中以1500 × g离心5分钟。然后小心地将上清液转移至新管中，注意不要扰动沉淀。现在，通过观察管壁上的刻度来估算核团体积（PNV）。

用低盐缓冲液填充微量移液器吸头，体积为 PNV 的一半。然后将微量移液器吸头插入离心管底部的细胞核中，一边缓慢注入缓冲液，一边轻轻混匀。

轻轻弹击离心管，确保沉淀完全重悬。随后，加入体积为PNV一半的高盐缓冲液，通过倒置离心管快速混匀一次。在4摄氏度下旋转孵育30分钟。

最后，在微型离心机中以18,000 × g、4 °C离心15分钟，使细胞核沉淀。首先将500 µL上清液转移至预冷的微量离心管中。将高盐核提取物在14,000 × g、4 °C条件下离心15分钟，离心结束后将微型离心柱倒置，放入新的单独EOR管中。

在1000 × g、4 °C条件下离心两分钟后，高盐核提取液将浓缩至约115 µL。现在将45 µL的高盐核提取液分装至微型透析SLIs中。确保载玻片的底部与浮子的底部齐平。

然后将SLIs放入500毫升预冷的透析缓冲液中。最后，在4°C下搅拌分装样品1至2小时，透析后核提取物将呈现浑浊状态。该图显示了在小规模核提取物与大量核提取物中进行的偶联RNA聚合酶II转录和剪切反应的代表性数据比较。

当A-C-M-V-D-N-A构建体在大量或小规模提取物中孵育时，在加入α-鹅膏菌素和放线菌素阻断进一步转录后的5分钟时间点，两种提取物中合成了相似水平的新生前体mRNA，剪接中间产物和剪接终产物随时间以相似的动力学在两类提取物中积累。这些代表性结果证实，RNA聚合酶II介导的转录与剪接偶联系统的效率在大量和小规模核提取物中相似。为展示小规模提取物的实用性，从小分子剪接抑制剂E 7 1 0 7或阴性对照化合物Platyphalin F处理的HeLa细胞中制备了提取物，并按照本图所示方法进行了RNA聚合酶II转录与剪接偶联实验。结果显示，来源于Platyphalin F和E 7 1 0 7处理细胞的提取物中，RNA聚合酶II的转录均能高效进行。

相比之下，经 analy F 处理的细胞所制备的提取物中剪接过程正常进行，而在 E 7 1 0 7 处理的细胞中剪接则完全被抑制。这些数据证明了利用小规模核提取物对小规模培养的细胞进行特殊处理的可行性。该技术一旦掌握，可在不到五小时内完成。