Name: 反向遗传学感染小鼠诺沃克病毒介导的恢复 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: 了解两种反向遗传学方法用于在细胞培养中恢复感染性小鼠诺沃克病毒（MNV）。这些技术通过体外转录加帽RNA或细胞内T7聚合酶表达系统，实现病毒高效回收，为研究诺罗病毒复制与致病机制提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由授予伊恩·古德费洛（Ian Goodfellow）的惠康信托资深研究员奖和授予阿曼多·阿里亚斯（Armando Arias）的玛丽·居里欧盟内 fellowship（FP7 欧洲研究理事会）资助。我们谨此感谢赵耀康（Io Hong Cheong）、丽贝卡·罗比博士（Dr Rebecca Robey）和迈克·斯金纳博士（Dr Mike Skinner）允许我们使用安捷伦生物分析仪，并协助进行 RNA 样本检测。

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb.+Mortal.+Wkly.+Rep%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li>
<li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis%2C+Avon%2C+England%2C+2002-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li>
<li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li>
<li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5%27-end+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li>
<li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413(2011).</li>
<li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5%27+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li>
<li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase%3A+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li>
<li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs%3A+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li>
<li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
<li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li>
<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

本文展示了两种不同的反向遗传学方法，均可在细胞培养中成功拯救具有感染性的MNV。这两种方法均通过生成带有帽子结构的MNV转录本，使其能够被细胞核糖体识别，从而有效绕过病毒RNA基因组5'端必须共价连接VPg蛋白的绝对需求。体外转录后经酶法加帽的方法在拯救感染性MNV方面比在表达T7 RNA聚合酶的细胞中转录感染性质粒的方法更为高效，后者依赖于FPV加帽酶对转录本进行加帽。利用这些反向遗传学系统所获得的病毒滴度与从感染细胞培养物中纯化的VPg连接病毒RNA转染所得滴度相似17（图5）。将带有帽子结构的MNV RNA转染至允许性Raw264.7细胞后，所得病毒滴度仅比转染含VPg连接病毒RNA的感染细胞总RNA实验低1个数量级（图5）。这一结果激励我们进一步研究：若将VPg分子添加至这些系统所产生的转录本5'端，是否可提高病毒产量，从而揭示VPg在MNV细胞感染性中所起的功能机制。尽管如此，我们认为该反向遗传学系统效率极高，可与其他当前常用的RNA病毒反向遗传学系统相媲美——在这些系统中，体外转录的RNA所拯救的病毒滴度通常仅比真实病毒颗粒感染低10至100倍19, 20。
总体而言，当前的方法在诺如病毒分子生物学领域迈出了重要的一步，为我们提供了研究诺如病毒基因组中蛋白质和保守RNA基序功能作用的工具。这些方法已与现有的小鼠模型相结合，并已证明从感染性cDNA获得的MNV可在不到10天内导致&gt;80%的STAT1-/-小鼠发生致死性感染4, 21。利用该系统，我们已成功获得具有衣壳蛋白突变以及多嘧啶 tract（参与多种宿主因子PTB和PCBP结合）突变的可存活小鼠诺如病毒，这些突变体在体内表现出一定程度的减毒表型in vivo21, 22。此外，我们最近证明，缺乏从ORF4表达VF1蛋白能力的病毒在细胞培养中能够有效复制，但在小鼠中的毒力相较于野生型MNV再次表现出降低8。这些研究激励我们基于MNV的研究设计人诺如病毒的减毒株，以探索其作为潜在疫苗候选物的可能性。

<table><tbody><tr><td>氯化锂沉淀溶液</td><td>Ambion</td><td>AM9480</td><td></td></tr><tr><td>RNA储存溶液</td><td>Ambion</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>ScriptCap m7G 加帽系统</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>SCCE0610</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 600 Nano 试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr></tbody></table>

反向遗传学介导的小鼠诺如病毒的感染性恢复

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

人类诺如病毒是全球大多数胃肠炎（GE）病例的致病原因，在无法避免人际密切接触的环境中反复出现这一问题 1, 2近年来，医院内暴发疫情的频率有所上升，导致医疗机构的正常运营受到显著影响，并造成巨大的经济损失。由于人类诺如病毒无法在细胞培养中完成有效的感染过程，新型抗病毒方法的研发受到了限制。 3最近分离出一种与人类诺如病毒密切相关的鼠诺如病毒（MNV） 4 但可在细胞中扩增 5 为这些病原体的研究开辟了新的途径 6, 7. 
MNV 的复制会导致新的正义基因组 RNA 分子和亚基因组 RNA 分子的合成，后者对应于病毒基因组的最后三分之一（图1）。MNV 包含四个不同的开放阅读框（ORF），其中 ORF1 占据了基因组的大部分区域，编码由多聚蛋白前体切割产生的七种非结构蛋白（NS1–7）。ORF2 和 ORF3 位于亚基因组 RNA 区域内，分别编码衣壳蛋白（VP1 和 VP2）（图1）。最近，我们发现一个与 ORF2 重叠但处于不同阅读框的额外开放阅读框 ORF4 具有功能，可编码一种定位于线粒体的毒力因子（VF1）8。
包括诺如病毒在内的正义RNA病毒的复制发生在细胞质中，从而合成新的无帽结构RNA基因组。为了促进病毒翻译，病毒利用多种不同策略，旨在招募宿主细胞的蛋白质合成机制9-11。有趣的是，诺如病毒的翻译由多功能病毒蛋白引物VPg驱动，该蛋白共价连接在基因组RNA和亚基因组RNA的5'端12-14。这种复杂的翻译机制可能是传统反向遗传学方法在病毒回收效率上受限的主要因素之一。
本文报道了两种基于生成5'端加帽的小鼠诺如病毒-1（以下简称MNV）转录本的不同策略。其中一种方法同时涉及 体外 病毒RNA的合成与加帽，而第二种方法则涉及在表达T7 RNA聚合酶的细胞中转录MNV cDNA。这些反向遗传学系统与小型动物模型的建立，为深入解析病毒序列在复制和致病过程中的作用提供了前所未有的研究能力 15-17.

诺如病毒是胃肠炎的主要病因之一，但针对其进行表征的分子技术仍相对较新。本文报道了两种不同的反向遗传学方法，可高效拯救小鼠诺如病毒（MNV），该病毒是此类病毒中唯一可在细胞培养中增殖的成员。

人类诺如病毒是全球大多数胃肠炎（GE）病例的主要原因，在人员密切接触的环境中反复出现...

本实验的总体目标是利用两种反向遗传学系统回收具有感染性的脊髓灰质炎病毒。大家好，我是来自伦敦帝国理工学院病毒学系的Armando Arias。在我们课题组中，致力于解析脊髓灰质炎病毒复制所依赖的分子机制。诺如病毒是胃肠炎的主要病因。目前，全球范围内用于其表征的分子技术仍相对较新。由于诺如病毒无法在细胞培养中完成有效的感染过程，针对该病毒的新型抗病毒策略的发现及其生命周期的相关研究进展较为有限。最近分离出一种能够感染小鼠并在细胞培养中传播的抗病毒药物，即镜像神经病毒，为研究这些重要病原体开辟了新的途径。本报告中，我们将展示两种可在细胞培养中产生基因明确的神经病毒分离株的策略。这两种策略均基于在5'端加帽的病毒转录本的生成。第一种方法涉及在将病毒RNA转染入细胞之前，在体外进行RNA加帽的合成。第二种方法包括在表达T7 RNA聚合酶的细胞内对MI神经诺如病毒cDNA进行转录。操作流程概述：从加帽的RNA转录本中拯救神经诺如病毒的实验方案首先通过线性化启动。含有MV CD NA的质粒用于mmv1，通过限制性内切酶NHE1进行酶切。随后，利用T7 RNA聚合酶将DNA在体外转录为RNA。随后，将体外加帽的M-M-V-R-N-A转染入细胞，以实现具有感染性的MNV的直接回收。为利用表达T7 RNA聚合酶的FAL PX病毒回收具有感染性的MNV，首先用该重组FAL PX病毒感染细胞。FAL PX病毒感染将导致T7 RNA聚合酶以及病毒RNA加帽酶的表达，后者可能对部分合成的RNA进行加帽。然后通过脂质体介导的转染方法，将M-M-V-C-D-N-A转染至FAL PX病毒感染的细胞中。T7 RNA聚合酶随后转录产生M-M-V-R-N-A，其中部分RNA可能被F-P-V-R-N-A的加帽机制进行加帽。核酶序列可确保每条RNA转录本均含有明确的3'末端。带有帽子结构的MMV转录本随后将在复制前被翻译成蛋白质，从而产生新的感染性病毒颗粒。本方案用于感染性MMV的RNA转录与加帽，以获得具有感染性的带帽MMV转录本。首先，混合以下试剂：转录缓冲液、核苷酸、水和含有M-M-V-C-D-N-A的线性化质粒。然后向反应体系中加入RNA和T7 RNA聚合酶。目前市面上有多种商用试剂盒可用于此目的，能够提供可重复的RNA合成方法。转录反应通过在 37 摄氏度下孵育混合物至少两小时来完成。取少量该转录反应产物，在非变性琼脂糖凝胶上进行分析。首先，使用去污剂清洗凝胶设备，并在使用前用无 RNase 的水冲洗。确保使用无RNA酶的试剂制备琼脂糖凝胶。M-V-R-N-A在非变性琼脂糖凝胶上的迁移长度约为三个千碱基。此外，可使用Agilent生物分析仪快速分析RNA的完整性。随后应纯化RNA以去除未掺入的核苷酸。虽然有多种方法可用，但在本实验方案中，我们采用氯化锂沉淀法纯化RNA，这是一种经济有效的方法。通过在最大转速下离心15分钟使RNA形成沉淀。小心移除上清液，避免扰动透明的沉淀物，并用70%乙醇洗涤。将MMV转录本重悬于RNA储存溶液中，并确保其完全溶解。将RNA加热至65°C可能有助于后续溶解过程。通过分光光度法对RNA进行定量。取少量 RNA 在 1% 非变性琼脂糖凝胶上进行电泳，以分析 RNA 的完整性。如图所示，经氯化锂沉淀后，RNA 的完整性应保持不变，以提高加帽效率。将一份 RNA 样品在 65 摄氏度下加热 10 分钟。立即将离心管置于冰上。为避免降解或重新折叠，按制造商建议配制加帽反应混合液。我们通常在100微升的终反应体系中加入约60微克的M-N-V-R-N-A。尽管反应体系可以缩小，但仍需充分混匀，并在37摄氏度孵育1小时，然后按之前方法通过氯化锂沉淀法纯化RNA。在进行转染之前，必须再次检测RNA的完整性。通过RNA电穿孔将MMV导入原代细胞的步骤方案。Resus。将含有原始细胞的培养瓶悬浮于DMEM中，确保形成单细胞悬液。使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板中测定活细胞浓度。离心收集细胞并小心重悬。将细胞悬浮于新鲜的无抗生素培养基中，每转染样本含800万个细胞，然后在微量离心机中离心收集细胞。弃去培养基，用500微升PBS洗涤细胞，再次离心后弃去PBS，将细胞重悬于130微升室温下的缓冲液中。Neon 复苏悬浮液。加入适当量的加帽 RNA，通常每 130 微升细胞中加入 1.3 微克，相当于每 600 万个细胞加入 1 微克 RNA。将与转录本混合的细胞收集至 100 微升 Neon 转染尖端中。此步骤中应格外小心，避免产生气泡。随后使用 1700 伏特电压、25 毫秒单脉冲进行电穿孔操作。将细胞释放至含有 1 mL 无抗生素培养基的离心管中。将细胞从离心管中分装至含有不含抗生素的DMEM（添加10% FCS）的独立孔板中，在37°C条件下培养24至72小时。通过RNA脂质转染法将MMV恢复至BSR T7细胞，操作同前。CAP MMV转录本由MMV cDNA质粒经T7聚合酶体外转录及体外加帽生成，随后通过脂质转染导入BSR T7细胞。用胰蛋白酶消化单层BSR T7细胞，将7.5 × 10⁵个活细胞接种至6孔板中。将细胞在37摄氏度下孵育过夜。移除细胞中的培养基，并替换为3 mL不含抗生素的新鲜培养基。为确保转染效率最大化，将1至2微克带帽的M-M-V-R-N-A与100微升OptiMEM混合。同时将4 µL的lipectomy 2000与100 µL的optimum混合。将含有RNA和lipectomy的样品合并，通过上下吹打15次充分混匀。室温下静置20分钟。然后以逐滴加入的方式将含有加帽MMV转录本的转染复合物加入细胞单层中。将培养板在相互垂直的方向上轻轻摇动。将细胞孵育24至72小时。在表达T7 RNA聚合酶的细胞中直接从cDNA恢复具有感染性MMV的方案，如前所述。该方案基于在牛痘病毒辅助感染的细胞中表达T7 RNA聚合酶和牛痘病毒加帽酶。随后将由T7启动子调控的M-N-V-C-D-N-A转染入细胞中。首先，移除细胞培养基，并向每孔加入700微升溶于无抗生素培养基中的F痘病毒。通常使用的感染复数约为每细胞0.5 PFU，将培养板垂直轻摇混匀后，在37摄氏度孵育1小时。随后，加入两毫升无抗生素培养基，继续在37摄氏度孵育细胞1小时，以促进T7 RNA聚合酶的表达。MNVC GNRA转染时，移除感染细胞的培养基，并加入三毫升不含抗生素的新鲜培养基。按照前文所述方法，制备含有1微克M-M-V-C-D-N-A和脂质体的混合物。通过反复吹打充分混匀。将离心管置于室温下孵育20分钟，再次混匀后，将混合液逐滴加入细胞单层中。轻轻摇动培养板，沿垂直方向进行。将细胞在37摄氏度孵育24至72小时，以确认通过本视频所示的不同反向遗传学方法成功恢复具有感染性的MMV。通过反复冻融使细胞释放出感染性病毒颗粒。采用标准方法（如TCID50或蚀斑实验）测定每个样品中的病毒滴度，并获得代表性结果。这些用于研究mi神经病毒的反向遗传学系统，为解析病毒序列在自然宿主中神经病毒复制和致病过程中的作用提供了前所未有的能力。本视频中介绍的两种反向遗传学方法在获得具有感染性的神经病毒以及细胞培养中的神经病毒方面均具有很高的效率。如本图所示。转染带有帽子结构的MMV转录本至RAW细胞或BSRT7细胞后，可回收到滴度超过每毫升10的5次方TCID50的传染性MMV。将MMV cDNA转染至先前感染了辅助性禽痘病毒的BSRT7细胞中，可获得超过每毫升10的4次方TCID50的病毒滴度。通过反向遗传学方法获得的病毒滴度与转染来自传染性病毒的RNA所拯救出的滴度相似，表明此处描述的反向遗传系统具有高效性。

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

反向遗传学感染小鼠诺沃克病毒介导的恢复

本文描述了一种一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法，用于检测儿童粪便样本中的诺如病毒分离株并进行基因组别鉴定，该方法采用针对诺如病毒基因组中最保守区域——开放读码框1（ORF1）与开放读码框2（ORF2）连接区的特异性引物和TaqMan探针。同时详细介绍了一种非商业化的、经济高效的RNA提取方法。...

通过TaqMan一步法RT-PCR检测儿童粪便中的诺如病毒并进行基因群分型

用于裂谷热病毒 MP-12 疫苗株的反向遗传学系统是构建具有增强减毒性和免疫原性的新型 MP-12 突变株的有效工具。本文描述了生成和鉴定 NSs...

利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性

本文介绍一种定量小鼠诺如病毒（MNV）感染性颗粒的方法，MNV 是唯一能在细胞培养中高效复制的诺如病毒。空斑试验利用 MNV 对小鼠巨噬细胞的嗜性，可适用于含有 MNV...

小鼠诺如病毒蚀斑试验

来源： Leuthold, M. M., 等 人诺如病毒突出域的制备 E. coli 用于X射线晶体学。 J. Vis. Exp.

人诺如病毒细菌来源重组P结构域蛋白的纯化

质粒介导的培养细胞中重组轮状病毒的生成

从克隆的cDNA中拯救重组沙粒病毒，这一方法被称为反向遗传学，可使研究人员探究特定病毒基因产物及其不同结构域和残基在沙粒病毒生物学多个方面所起的作用。同样，将反向遗传学技术应用于经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于疫苗开发的细胞系（Vero）中，为研制有效且安全的疫苗以对抗人类致病性沙粒病毒提供了新的可能性。...

在 FDA 批准的 Vero 细胞中生成用于疫苗开发的重组沙粒病毒

近年来，为了开发新的疫苗和治疗载体等应用，人们对新城疫病毒（NDV）进行了广泛研究。这些研究得以实现，得益于从cDNA中拯救重组病毒的技术，例如本文所描述的方法。...

从cDNA拯救重组新城疫病毒

本文介绍了一种利用反转录-定量PCR方法对环境水和饮用水中肠道病毒和诺如病毒进行定量的实验流程。采用美国环境保护署方法1615（EPA Method...

EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在情况。第三部分：通过 RT-qPCR 检测病毒

利用病毒基因组扩增的常规检测方法受限于无法区分具有感染性与非感染性的病毒颗粒。本文旨在提供详细的实验方案，介绍利用适配体结合、动态光散射和透射电子显微镜等替代方法，以辅助区分具有感染性的诺如病毒颗粒。...

替代方法 体外 病毒衣壳结构完整性的测定方法

通过质粒DNA拯救重组轮状病毒，为研究轮状病毒的复制机制、致病过程以及开发轮状病毒表达载体和疫苗提供了重要工具。本文介绍一种简化的反向遗传学方法，用于生成重组轮状病毒，包括表达荧光报告蛋白的病毒株。...

一种简化的反向遗传学方法用于拯救表达报告蛋白的重组轮状病毒

本实验方案的目的是定量分析真核病原体人诺如病毒与细菌的结合能力。在完成初步的病毒-细菌结合实验后，采用流式细胞术检测整个细菌群体中与病毒结合的细菌。...

利用流式细胞术定量人诺如病毒样颗粒与共生细菌的结合

了解两种反向遗传学方法用于在细胞培养中恢复感染性小鼠诺沃克病毒（MNV）。这些技术通过体外转录加帽RNA或细胞内T7聚合酶表达系统，实现病毒高效回收，为研究诺罗病毒复制与致病机制提供重要工具。

反向遗传学介导的小鼠诺如病毒的感染性恢复

探索更多视频