Name: 抗体转染神经元作为一种工具来研究疾病的发病机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学习抗体转染神经元技术，通过免疫荧光显微镜研究自身抗体对神经元功能的影响，探索神经免疫疾病的发病机制。该方法可快速量化转染效率，为神经科学研究提供可靠工具。

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本工作由退伍军人事务部研究与发展办公室医学研究服务处资助。本研究由退伍军人事务部优异奖（授予 MCL）和田纳西大学健康科学中心多发性硬化研究基金资助。

1. 抗体标记（图1）
<ol>
 <li>配制 0.1 M NaHCO3 缓冲液：
 <ul type="circle">
 <li>8.4 g NaHCO3</li>
 <li>29.2 g NaCl</li>
 <li>1 升 H2O</li>
 </ul>
 </li>
 <li>用以下溶液将缓冲液调至 pH 8.4（10.6 g Na2CO3，29.2 g NaCl，1 升 H2O）。</li>
 <li>在 70 μl 抗 hnRNPA1 抗体和 500 μl NaHCO3 缓冲液中加入 35 μl Atto550 NHS，室温下旋转孵育 1 小时。孵育结束后，将混合物注入透析装置，并在 2 升 PBS 中透析过夜。</li>
 <li>次日，使用离心柱（Amicon Ultra 0.5）浓缩透析后的 Atto550 NHS 标记抗 hnRNPA1 抗体。</li>
 <li>Atto550 NHS 标记的抗 hnRNPA1 抗体浓缩后，使用 NanoDrop 测定样品浓度。</li>
</ol>
2. 抗体转染（图2）
<ol>
 <li>转染前24小时，在8孔板中每孔接种105个细胞，加入500 μl含DMEM/F12培养基（含10% FBS和1%抗生素），细胞融合度应至少达到70%。</li>
 <li>接种后24小时，将2 μl Ab-DeliverIN试剂加入一个Eppendorf管中。</li>
 <li>随后，向同一Eppendorf管中加入2 μg Atto550 NHS标记的抗hnRNPA1抗体（0.5 μg/μl），室温孵育10–15分钟。</li>
 <li>孵育期间，吸除细胞培养液，并向每孔加入394 μl新鲜DMEM培养基。</li>
</ol>
注意：向未处理细胞的一个孔中加入 500 μl DMEM 作为对照。
<ol start="5">
 <li>孵育后，向抗体混合物中加入 100 μl DMEM，用移液器吹打混匀，然后加入到含细胞的 DMEM 中，总体积为 500 μl。</li>
 <li>抗体递送 48 小时后更换培养基。</li>
</ol>
注意：使用FITC标记的rIgG作为阳性对照重复该实验方案。
3. 活细胞与固定成像以确定效率
<ol>
 <li>使用荧光显微镜上的 Cy3 滤光片在 48 小时时对转染了 Atto550 NHS 标记抗体的细胞进行活细胞成像。</li>
 <li>完成活细胞成像后，吸除培养基并固定细胞。</li>
 <li>吸除培养基后，用 0.4% 多聚甲醛在室温下处理细胞 15 分钟。用 PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 4 次。然后使用含 DAPI 试剂的封片液封片，并固定盖玻片。使用 Axiovision 软件测定固定细胞的转染效率。若无 Axiovision 软件，可手动统计图像中的事件数，并将结果代入 3.7 中的计算公式。或者，也可使用 ImageJ 软件进行此类计算。</li>
 <li>首先，使用“Events”测量功能在 20 倍放大倍数下统计所选图像中细胞的总数。</li>
 <li>接着，在同一张 20 倍放大倍数的图像中，使用“Events”测量功能统计未成功转染抗体的细胞数量。</li>
 <li>要以类似 Excel 表格的格式查看测量得到的“Events”数据，请点击“Properties”，选择“Measurement”选项卡，然后点击“As Table”进行查看。</li>
 <li>最后，通过比较前述两次测量得到的事件数，使用以下公式计算转染效率：((总细胞数 - 未转染细胞数) / 总细胞数) × 100 = 转染效率。</li>
</ol>
4. 代表性结果
未转染（图3A）与转染后（图3B）神经元的活体图像对比显示，抗体标记（每张图中为红色或绿色）在细胞内清晰可见（图3B、C、D）。在通过灌注并用培养基清洗以去除细胞间或附着于细胞表面的抗体后，神经元内仍可观察到标记的抗体（图3C、D）。为计算转染效率，可使用Axiovision软件统计总细胞数与未成功转染的细胞数。将这些数值代入转染效率计算公式，即可获得转染效率占总细胞数的百分比（图4）。
<img alt="抗体标记过程；Atto 550 NHS 反应、透析和离心装置示意图。" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 使用 Atto 550 NHS 酯标记抗体的流程示意图，以及浓缩标记抗体所需的后续步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="细胞孵育过程；接种细胞、试剂、抗体；吸除培养基；试剂混合物配制" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 将标记抗体转染入培养中活细胞所用步骤的流程图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig2large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="细胞形态显微图像；培养细胞的对比度和荧光标记，20 μm 比例尺。" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图 3. 转染后 48 小时的转染神经元的活细胞图像。
<img alt="荧光显微镜，细胞结构高亮显示，示意图，20 µm 比例尺，科学分析。" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图 4. 固定并洗涤后的图像，通过计数事件以确定转染效率。

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
<li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambert-Eaton+syndrome+antibodies%3A+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li>
<li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA%2C+DNA-binding+proteins%2C+and+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Rheum.+Dis.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li>
<li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry%3A+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons%3A+implications+for+molecular+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li>
<li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies%3A+cause+of+disease+or+caused+by+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li>
<li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li>
<li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li>
<li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer%2C+Axl%2C+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+%27passive+transfer%27+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff%2C+twitchy+or+wobbly%3A+are+GAD+antibodies+pathogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li>
<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

为了验证关于特定分子及其表达的假设，通常将基因和其他载体转染到细胞中。该方法的独特之处在于能够轻松地将抗体转染入靶细胞。我们共进行了五次独立实验，每次实验均设置重复。各实验的转染效率结果相似。重要的是，该方法能够在不改变抗体结构或功能的前提下，使抗体进入细胞内部。此外，通过活神经元的荧光显微镜观察，可以确定转染效率，通常超过55%。这使得研究人员能够直接验证目标抗体与其细胞内靶点之间相互作用的相关假设。尽管本研究未涉及，但也可使用Fab片段。此外，还可设计实验来探究培养条件的改变（例如添加炎性细胞因子）是否会影响细胞内靶点的表达或定位。
抗体如何靶向细胞内抗原仍是当前研究的热点领域。主流理论认为，在细胞损伤后，细胞内抗原暴露于适应性免疫应答中，从而促使机体产生针对该抗原的抗体。系统性红斑狼疮（SLE）患者对异质性胞核核糖核蛋白（hnRNP）的抗体反应即为这一机制的例证。SLE患者可产生针对hnRNP P2的抗体；当靶细胞发生凋亡时，hnRNP P2被转运至细胞表面，从而可被免疫系统识别并引发自身免疫反应。 14这一点在神经系统疾病中也得到了证实，研究表明只有...

<table><tbody><tr><td>荧光显微镜 AxioObserver A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision 版本 4.2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗人 hnRNPA1 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab4791</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的抗兔 IgG 抗体</td><td>OZ Biosciences</td><td>AI20100</td><td></td></tr><tr><td>Atto550 NHS 酯</td><td>Sigma</td><td>92835</td><td></td></tr><tr><td>Ab-DeliverIN</td><td>OZ Biosciences</td><td>AI20100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基（含 10% FBS 和 1% 抗生素）</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸 8 孔培养载玻片</td><td>BD</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>多功能旋转仪</td><td>Scientific Industries Inc</td><td>Model 151</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 封片介质</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Ambion</td><td>9626</td><td></td></tr><tr><td>透析装置</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（4% 溶液）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

将抗体转染入神经元作为研究疾病发病机制的工具

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

抗体能够帮助人们深入了解生物系统中发生的各种事件。针对特定蛋白质产生高特异性抗体的能力，使得科学家能够精确地回答一系列生物学问题。尤为重要的是，抗体已被证实参与多种人类疾病的发生发展过程，包括系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）、副肿瘤综合征、多发性硬化症（MS）以及人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）相关的脊髓病/热带痉挛性截瘫（HAM/TSP）1-9。抗体如何致病是当前持续研究的领域，相关数据表明，抗体与多种细胞内分子之间的相互作用可导致炎症反应、细胞信号传导异常以及细胞凋亡10。已有研究显示，多发性硬化症（MS）和HAM/TSP患者体内可产生针对细胞内RNA结合蛋白——异质性核糖核蛋白A1（hnRNP A1）的自身抗体3, 5-7, 9, 11。近期的研究数据进一步表明，针对神经元内蛋白和细胞表面抗原的抗体均具有致病性3, 5-9, 11。因此，建立一种可用于研究细胞内抗体与蛋白质相互作用的实验方法，将有助于深入揭示这些疾病的发病机制。
基因通常可被转染到原代细胞和培养的细胞系中，然而抗体的转染却因抗体结构的改变或转染效率低下而受到阻碍12。其他转染方法包括基于阳离子脂质体（由DOTAP/DOPE组成）和聚乙烯亚胺（PEI）的抗体转染；这两种方法与对照组相比，抗体转染效率均下降了十倍12。我们研究中采用的方法类似于阳离子脂质介导的方法，利用基于脂质的机制通过静电和疏水相互作用与抗体形成非共价复合物13。我们使用了Ab-DeliverIN试剂，这是一种可通过非共价的静电和疏水相互作用捕获抗体并将其递送至细胞内的脂质制剂。因此，无需化学或基因偶联即可将功能性抗体递送至活细胞内。该方法使我们能够开展多种抗体示踪和蛋白质定位实验，以及分析细胞内抗体与蛋白质相互作用所产生的分子效应9。
在本实验方案中，我们将展示如何快速、可重复且高效地将抗体转染至神经元中。以抗-hnRNP A1 抗体和抗-IgG 抗体为例进行说明。为了便于定量转染效率，我们使用了 Atto-550-NHS 标记的抗-hnRNP A1 抗体以及 FITC 标记的 IgG 抗体。Atto550 NHS 是一种新型荧光标记物，具有高摩尔吸光系数和量子产率。Atto550 的激发光源和荧光滤光片与 Cy3（激发波长 556 nm，发射波长 578 nm）相似。此外，Atto550 具有良好的光稳定性。使用 FITC 标记的 IgG 作为对照，以证明该方法具有通用性，且不依赖于特定荧光染料。该方法及其所产生的数据将有助于理解针对细胞内靶抗原的抗体在人类疾病发病机制中可能发挥的作用。

本文描述了一种快速研究抗体在细胞内环境中对分子机制的相互作用及其影响的方法。该方法利用基于脂质配方的非共价复合物形成，将抗体转染至活细胞中。该技术可适用于永生化细胞系和原代细胞。

抗体能够为深入了解生命系统中发生的各种事件提供可能。制备高特异性……

本实验的目的是提供一种快速且可重复的方法，用于研究抗体、与神经元功能相关的自身分子机制以及神经系统疾病发病机制。首先，使用 ATO five 50 NHS 荧光标记物对抗体进行标记。随后，将标记后的抗体与转染试剂混合，并转染至神经元细胞中。在转染后 48 小时，对培养的神经元进行固定，使用 DPI 封片剂封片，并通过免疫荧光显微镜观察。转染效率可利用成像软件进行计算。该方法有助于回答神经科学和神经免疫学中的关键问题，例如自身抗体如何改变与神经元功能相关的分子机制，以及免疫介导性神经系统疾病的发病机制。我们最初萌生这一方法的想法，是源于希望验证一个假设：即针对 h 和 RPA1 以及在神经元中过表达的 RNA 结合蛋白的抗体，可能参与了神经退行性变的机制。演示本实验操作的将是研究生 Josh Douglas。在开始实验之前，需确保前一日已准备好高质量且完整的神经元细胞，以每孔 100,000 个细胞的密度接种，且细胞融合度至少达到 80%。在进行检测当天，应观察细胞状态，确保其生长健康。首先，通过将 8.4 克碳酸氢钠和 29.2 克氯化钠溶于 1 升水中，配制 0.1 mil 的碳酸氢钠缓冲液。然后将缓冲液的 pH 值调节至 8.4，并取 500 微升该缓冲液。向其中加入 70 微升待转染的抗体（本例中为抗 H-N-R-N-P-A 一抗）以及 35 微升标记试剂（此处为 ATTO 550 NHS）。将溶液在室温下旋转孵育一小时，然后注入透析器中，在四摄氏度下于两升磷酸盐缓冲液（PBS）中透析过夜。次日，使用离心柱浓缩透析后的标记抗体。最后，使用 NanoDrop 分光光度计测定抗体浓度。在八孔板中，每孔接种10,000个细胞，培养体积为500 µL完全DMEM培养基。将细胞在37°C培养箱中孵育过夜，或直至细胞汇合度达到至少70%。当细胞汇合度达到70%后，开始实验操作：取2 µL抗体与转染试剂混合，加入终浓度为0.5 µg/µL的标记抗体共2 µg，于离心管中混匀，室温孵育10至15分钟。在此期间，从细胞培养孔中移除 SUP 培养基，并以每孔精确加入 394 微升的新鲜培养基进行替换。转染液准备就绪后，加入 100 微升 DMEM，并通过反复吹打混匀。然后，向每孔含有细胞的培养孔中精确加入 106 微升转染混合物，使每孔终体积达到 500 微升。务必设置一个未转染的阴性对照孔，该孔中加入DMEM而非抗体。将细胞在37摄氏度下孵育48小时。孵育结束后，更换为新鲜DMEM，在标记后48小时使用荧光显微镜进行活细胞成像。为了可视化标记了五种50 NHS抗体的ATO，活体成像后，使用SI3滤光片，吸除培养基，加入4%多聚甲醛固定细胞，并在室温下孵育载玻片15分钟。细胞固定后，用PBS洗涤四次，每次洗涤在PBS中孵育五分钟。随后吸除PBS，加入一滴含DPI的封片剂。使用荧光显微镜，向每个样本的细胞上轻轻放置盖玻片。开始对细胞进行成像。在本实验中，我们成功对转染了 ATO 五 50 NHS 标记的抗 H-N-R-N-P-A 一抗体的神经元进行了活细胞荧光成像。该图像显示了神经元细胞内的抗体，包括细胞质神经元突起，以及细胞核固定和细胞核染色情况。使用此处以蓝色显示的 DAPI 可通过将转染细胞数量除以总细胞数量来确定转染效率。在此情况下，按照本实验步骤操作后，转染效率为 50%。为了回答更多科学问题，还可开展其他实验方法，例如免疫细胞化学、RNA 提取、微阵列分析以及蛋白质印迹（Western blot），以研究抗体在细胞器内的共定位情况，以及抗体对靶抗原特异性识别所引发的神经元功能与完整性的变化。在本视频中，我们展示了如何使用荧光标记物对抗体进行标记，制备转染试剂与荧光标记抗体的复合物，将神经元进行转染，并计算转染效率。该方法在评估自身抗体如何影响细胞功能方面具有重要价值，包括细胞活力、凋亡、神经元运输，以及与神经元功能和神经系统疾病发病机制相关的分子通路。

antibody-transfection-into-neurons-as-tool-to-study-disease

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科研

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Neuroscience

神经科学

抗体转染神经元作为一种工具来研究疾病的发病机制

本视频展示了利用编码突变型人源tau蛋白并标记黄色荧光蛋白（YFP）的慢病毒转导人神经元细胞，以研究蛋白聚集的过程。该方法详细阐述了从病毒进入细胞到突变型tau蛋白表达的各个步骤，最终在神经元中形成可见的细胞质tau蛋白聚集体。...

慢病毒介导的人类神经元转导用于 Tau 蛋白聚集分析

本文展示了一种通过向新生小鼠脑内脑室内注射腺相关病毒实现广泛神经元转导的技术。该方法可快速、简便地实现病毒递送的转基因在生命全程中的持续表达。...

新生小鼠脑室内病毒注射以实现持续且广泛的神经元转导

调控蛋白质表达不仅对所有现存生物至关重要，而且也是在细胞模型中研究蛋白质功能的重要策略。本文介绍的方案展示了抗体干扰技术在哺乳动物细胞（包括原代海马神经元）中的应用，并演示了如何利用三维重建技术研究蛋白质功能。...

通过抗体干扰和三维重建研究蛋白质功能及异常蛋白质表达的作用

本文描述了病毒载体介导的局部基因递送如何为在中枢神经系统中表达外源基因提供一种有效的方法。该方案概述了在大鼠黑质内注射病毒载体以建立基于病毒载体的帕金森病动物模型所需的全部关键步骤。...

基于α-突触核蛋白的帕金森病大鼠模型通过重组腺相关病毒载体立体定向注射的建立方法

通过注射依赖重组酶的重组腺相关病毒（rAAV）可操控脊髓中任意基因标记的细胞类型。本文介绍如何转导腰段脊髓背角中的神经元。该技术可实现对被操控神经元亚型的功能性研究。...

腺相关病毒介导的脊髓遗传学定义神经元中转基因表达

本实验方案的目的是提供一种基于细胞的系统，用以模拟α-突触核蛋白聚集体的形成...

外源性施加与微粒体相关的α-突触核蛋白聚集体至原代神经元：一种高效的纤维形成细胞模型

该技术的目的是从鼠类脊髓中制备高度富集的原代运动神经元（MNs）培养物。为了评估导致运动神经元疾病突变的影响，本文描述了这些分离的运动神经元的获取及其通过磁转染法进行转染的方法。...

建模查理-玛丽-图斯病 体外 通过转染小鼠原代运动神经元

本方案详细描述了一种将编码突变人源tau蛋白的慢病毒载体转导至人神经元培养物中的实验方法。经转导的培养物可出现tau蛋白聚集物及相关病理学特征。...

一种利用慢病毒介导的人类神经元转导研究 Tau 蛋白聚集的体外模型

自身免疫性脑炎是一类新型的中枢神经系统抗体介导性疾病。海马神经元可用于发现和鉴定这些抗体。本文提供了一种原代细胞培养和免疫染色的实验方案，用于检测患者血清和脑脊液中的自身抗体。...

用于检测和研究自身免疫性脑炎中新型致病性抗体的海马神经元培养

在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。...

利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

学习抗体转染神经元技术，通过免疫荧光显微镜研究自身抗体对神经元功能的影响，探索神经免疫疾病的发病机制。该方法可快速量化转染效率，为神经科学研究提供可靠工具。

将抗体转染入神经元作为研究疾病发病机制的工具

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