肺转移瘤在小鼠体内的组合在单细胞分辨率的可视化改进在原位 lacZ的标记的肿瘤细胞
2012年8月21日
在本研究中报道的新颖协议在小鼠经合并在单细胞分辨率允许选择性检测肺转移在原位肺灌注固定和X-Gal染色 lacZ的标记的肿瘤细胞。
该程序的总体目标是提高小鼠肺离体微转移的检测，同时保留充气的肺结构。这是通过首先用 PBS 原位灌注肺部以去除血液来实现的，血液是该组织中颜色背景的主要来源。下一步是通过注射 PFA 给肺充气，然后掐开以固定充气下的肺组织。
接下来，取出肺并进一步固定在 PFA 中或嵌入单个肺叶进行冷冻切片。最后的步骤是在 Xal 溶液中对组织进行染色并可视化 LA 锯齿形肿瘤细胞，最终可以用双目显微镜或光学显微镜检测到整个肺叶或肺组织切片上的转移，直至单个细胞水平。与现有方法（如天空独立站立）相比，该技术的主要优点是，由于去除了与血液相关的背景，微转移的可检测性大大提高。
通过在大约 150 微升 PBS 中腹膜内注射氯胺酮、甲苯噻嗪和 ace promazine 来麻醉小鼠，以开始该方案。当不再观察到小鼠的疼痛反射时，将其固定在手术台上。退后并用 70% 乙醇滑过头发。
从腹部到颈部打开皮肤。将皮肤拉到两侧或将其去除。小心地打开胸部的腹膜，以防止静脉颈等大血管破裂。
这将提高灌注的效率。现在使用 20 毫升注射器和 21 至 24 号针头切开肝脏下方的腔静脉卡底。将 10 至 15 毫升 PBS 缓慢注射到跳动心脏的右心室中，直到肺完全变白并且心脏停止跳动。
然后用血管夹捏掉肝脏和隔膜上方的血管。将 10 毫升注射器中加入 3% 多聚甲醛，然后用 21 至 24 号针头注射到右心室。大约 2 毫升。
揭开胸腔外的气管，从胸腔外向气管注射约 3 毫升醛，使肺部充气。然后在取出针头后立即用血管夹捏住被穿刺处的气管，等待 10 分钟以允许固定。接下来，横切血管夹上方的血管。
然后取下夹子，将大约 2 毫升的 PBS 注入右心室，以去除多余的能量甲醛。用针刺穿所有肺叶的下部，并取下气管处的血管夹。现在将 3 到 5 毫升稀释的包埋液注射到气管中，与另一次注射相匹配。
当隐藏在肺叶中的副状物被溶液取代时停止注射。用镊子拉动心脏并横切结缔组织韧带、血管和气管，小心地切除肺。一定要保持心脏与肺部的连接。
留出一个肺叶用于冷冻切片，并使用剩余的肺组织进行整个长染色。将肺放入盖紧盖子的塑料杯中，并用 2% 甲醛和 PBS 固定。将一块纱布放在肺顶部，使其保持在溶液中，并在室温下静置 30 分钟。
半小时后，取出固定液并彻底洗涤组织 用 PB S3 次，稀释 1 毫升 Xal 储备溶液，在碱性染色溶液中稀释 1 至 40 剂，并加入至少 10 毫升到杯中，新鲜制备即用型 xal 溶液。用一块纱布沉入肺部。松散地锁紧盖子以允许空气交换，并在 37 摄氏度下避光孵育 3 到 5 小时。
孵育后，取出 xal 溶液。用 PBS 冲洗肺部一次以去除残留的 xal 溶液，并在 PBS 中加入至少 10 毫升 4% 多聚甲醛。组织现在已准备好进行组织学检查，可以在 4 摄氏度的 4% PFA 中长期储存。
首先用未稀释的 poly forze 包埋介质填充包埋模具的三分之一。然后将肺叶装入模具中并继续添加培养基，直到肺叶完全覆盖。小心避免产生气泡，现在将包埋的叶在 4 摄氏度下孵育 20 分钟。
接下来，将嵌入的肺慢慢冷冻在干冰和 isop 戊烷的混合物中，准备用于切片。如果需要，现在可以将它们转移到零下 80 摄氏度的冰箱中，储存在低温恒温器上 切割 7 到 10 微米的冷冻切片 将切片安装到市售的冷冻切片上 安装后，立即将切片在 37 摄氏度的 xal 染色溶液中在加湿室中孵育 24 小时。第二天，用 PBS 冲洗玻片两次，每次冲洗 5 分钟。
然后用蒸馏水短暂冲洗。现在用核固红对载玻片进行复染 10 秒，以获得微弱的复染剂，使 xal 更显眼，并立即用蒸馏水冲洗复染剂。对于较深的复染剂，请将时间延长至 30 秒或更长时间。
使用 immuno 支架安装载玻片。重新研究了 done LM 8 小鼠 OS 模型中转移的形成。使用此处描述的小鼠灌注和非灌注肺的代表性图像，同时注射松弛转导和非转导的对照 done 和注射对照 done 细胞的小鼠中的 LM 8 个细胞。
在未灌注和灌注的肺中，肉眼和显微镜下的转移仍然无法检测到。但有趣的是，在注射 dun LA Z 细胞的小鼠中，xgl 染色显示未灌注肺表面单细胞或小细胞簇的蓝色微转移病灶原位灌注和固定进一步提高了 dun la z 微转移的可检测性，然而，在注射对照 LM 8 细胞半透明的小鼠中未观察到向宏观病灶的生长， 在未灌注的肺中发现直径大于 0.1 毫米的几乎无法检测到的宏大转移病灶。肺灌注并没有改善病灶的检测。
然而，在注射 ate LAC Z 细胞的小鼠中，在未灌注器官表面检测到多个 X gal 染色蓝色大转移。在未灌注器官表面也检测到微转移。此外，肺灌注进一步提高了宏大和微观转移的可检测性。
因此，微转移和大转移以更高的密度和更大的数量变得可见，这主要是由于灌注组织的半透明性，其中器官表面下的病灶也变得可见。使用肺组织冷冻切片的另一项组织学分析证实，注射 LAX Z 转导 done 的小鼠和 LM 8 细胞注射的小鼠肺转移的可检测性提高，原发性肿瘤来源于 Dun LAX Z 细胞。在肺切片中发现微转移甚至单细胞病灶。
这在具有相应对照细胞的原发性肿瘤的小鼠中未观察到。此外，注射 LM 8 LA C 细胞的小鼠比注射对照 LM 8 细胞的动物更明显。看完这个视频，你应该对 ZI 2 中如何进行肺灌注和固定以及随后在切除的肺中对转移灶进行兴奋染色有了很好的了解。
该技术是任何类型的癌症研究中肺部转移分布的高灵敏度终点读数，也可以作为改进当前体内成像技术的基准，例如用于早期检测转移病灶的显微 CT PET 和 MRI。
概述
本研究提出了一种新的协议，用于在小鼠中以单细胞分辨率选择性检测肺转移。该方法结合了原位肺灌流、固定和X-Gal染色lacZ标记的肿瘤细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 组织学
背景
- 由于血液相关的背景，肺部微转移难以检测。
- 现有方法无法以单细胞分辨率可视化转移。
- 改进的检测技术对于更好地理解肿瘤扩散至关重要。
- 本研究旨在提高肺组织中微转移的可见性。
研究目的
- 开发一种协议，允许以单细胞水平检测肺转移。
- 在检测过程中保留肺部结构。
- 与现有方法相比，提高微转移的整体可检测性。
使用的方法
- 用PBS进行原位灌流以清除血液。
- 使用甲醛对肺组织进行充气和固定。
- 对肺叶进行包埋和冷冻切片以进行详细分析。
- X-Gal染色以可视化lacZ标记的肿瘤细胞。
主要结果
- 与未灌流的对照相比，灌流肺中微转移的检测得到增强。
- 使用X-Gal染色可以识别单个细胞或小群集的转移。
- 该协议显著减少了血液相关的背景干扰。
- 代表性图像展示了该方法的有效性。
结论
- 开发的协议有效用于以单细胞分辨率检测肺转移。
- 该方法通过减少背景噪音改进了现有技术。
- 未来的应用可能增强对肿瘤生物学和转移的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate detection of micrometastases is critical for preclinical oncology studies, as undetected disease burden can lead to false-negative efficacy signals and costly late-stage failures. This protocol enhances target validation by enabling single-cell resolution visualization of lacZ-tagged tumor cells in lung tissue, reducing background interference from blood. The improved sensitivity supports mechanistic de-risking and predictive confidence in metastasis models, directly informing go/no-go decisions in therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing micrometastatic burden at single-cell resolution.
- Operational Value: Provides a low-cost, equipment-light method for functional target validation in metastasis models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing dormant or early metastatic events otherwise missed by conventional imaging.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible tissue preparations suitable for quantitative metastasis scoring.
- Quantitative Output: X-Gal staining yields a chromogenic readout enabling digital pathology and automated counting of lacZ-positive cells.
- Platform Reuse: The perfused lung preparation serves as a reusable platform for screening anticancer compounds across multiple studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maintains alveolar architecture and tissue morphology, ensuring metastasis detection reflects physiologically relevant lung microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing consistent, histology-based metastasis readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Improves confidence in preclinical efficacy data, reducing attrition due to undetected metastatic progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing a reliable ex vivo endpoint for metastasis assessment that complements in vivo imaging modalities.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct visualization of tumor cell dissemination and colonization in lung tissue.
- Screening: Delivers standardized, background-reduced tissue samples for consistent compound evaluation in metastasis assays.
- Analytics: Produces quantitative, single-cell resolution readouts that facilitate statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Ensures histological fidelity for preclinical-to-clinical extrapolation by preserving lung structure and metastatic niche.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, transferable protocol for metastasis detection across oncology discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metastasis models by reducing false-negative detection due to vascular background.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories through defined perfusion, fixation, and staining parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by increasing the reliability of preclinical metastasis data, reducing wasted investment in ineffective candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on accurate micrometastatic burden assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery, perfusion techniques, and histological processing.
- Dependent on access to perfusion equipment, cryostat, and standard histology tools (microscopes, embedding molds).
- Necessitates cross-team standardization between in vivo pharmacology and histology teams for consistent tissue handling.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of perfusion pressure and fixation timing.
- Practical limitation: X-Gal staining sensitivity depends on lacZ expression levels and may require signal amplification for low-expressing models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
In-situ Lung Perfusion and Fixation
8:00
Conclusion
3:30
Visualizing lacZ-tagged Metastatic Tumor Cells in Entire Lung Lobes
4:31
Visualizing lacZ-tagged Metastatic Tumor Cells in Lung Cryosections
5:48
Metastases Analysis in Dunn/LM8 Osteosarcoma-bearing Mice
