Name: 在黑质和腹侧被盖区多巴胺调控的综合性能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习使用高效液相色谱法和蛋白质分析技术，精确分离啮齿动物黑质与腹侧被盖区，研究多巴胺调控的分子机制。该方法可从单一组织样本获取多重分子读数，为神经精神疾病研究提供重要数据。

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本工作的资助来源如文献2,10所引，部分来自美国衰老研究联合会、Edward P. Stiles 信托基金和路易斯安那州西北部生物医学研究基金会向 MF Salvatore 提供的研究资助，以及 LSU 健康科学中心-什里夫波特分校向 BS Pruett 提供的 Ike Muslow 博士前奖学金。

<ol><li>Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substantia+nigra+pars+reticulate+is+a+highly+potent+site+of+action+for+the+behavioral+effects+of+the+D1+antagonist+SCH23390+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat.</a> Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+reveals+a+role+for+nigral+tyrosine+hydroxylase+ser31+phosphorylation+in+locomotor+activity+generation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation.</a> PLoS ONE. 4, e8466(2009).</li>
<li>Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+controls+persistence+of+long-term+memory+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopamine controls persistence of long-term memory storage.</a> Science. 325, 1017-1020 (2009).</li>
<li>Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+dopamine+regulation+in+mesoaccumbens+pathway+in+response+to+non-contigent+binge+and+escalating+methamphetamine+regimens+in+the+Wistar+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat.</a> Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).</li>
<li>Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+infusion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+into+the+ventral+tegmental+area+induces+long-lasting+potentiation+of+cocaine+seeking+after+withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal.</a> J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).</li>
<li>Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+reverses+toxin-induced+injury+to+midbrain+dopaminergic+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.</a> Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).</li>
<li>Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+GDNF+administration+increases+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+rat+striatum+and+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra.</a> J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).</li>
<li>Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ventral+tegmental+area+glial+cell-line+derived+neurotrophic+factor+in+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving.</a> Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).</li>
<li>Lavicky, J., Dunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticotropin-releasing+factor+stimulates+catecholamine+release+in+hypothalamus+and+prefrontal+cortex+in+freely+moving+rats+as+assessed+by+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis.</a> J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichotomy+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+regulation+between+somatodendritic+and+terminal+field+areas+of+nigrostriatal+and+mesoaccumbens+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways.</a> PLoS ONE. 7, e29867(2012).</li>
<li>Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+nigrostriatal+and+mesolimbic+systems+in+vivo%3A+Effects+of+acute+haloperidol+and+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds.</a> J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).</li>
<li>Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-stimulated+catecholamine+biosynthesis%3A+involvement+of+protein+kinases+and+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+sites+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ.</a> J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).</li>
<li>Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serine-19+phosphorylation+in+regulating+tyrosine+hydroxylase+studied+with+site-+and+phosphospecific+antibodies+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis.</a> J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).</li>
<li>Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tyrosine+hydroxylase+activity+and+phosphorylation+at+ser19+and+ser40+via+activation+of+glutamate+NMDA+receptors+in+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum.</a> J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

如图1所示，上述方法可从大鼠或小鼠的黑质（SN）或腹侧被盖区（VTA）单一样本中，同时获得多组关于多巴胺及其调控蛋白TH、DAT和VMAT2的检测结果。再次强调，实施本方案的优势在于研究者能够获得操作条件匹配的多巴胺调控机制读数 体内 在几乎所有实验范式下均可实现这一目标，从而通过减少每次实验所需的动物数量，显著节约实验资源。 
研究人员必须严格遵守解剖过程中（4°C）、组织储存（至少-70°C）、组织超声处理（从储存温度取出后立即在冰冻HPLC缓冲液中进行超声）以及后续沉淀形成和处理步骤中的温度要求。一旦沉淀物在SDS溶液中完成超声和煮沸处理，样品可继续在室温下进行后续操作。用于HPLC分析的存档样品以及为蛋白质分析制备的样品缓冲液应保存在-80°C。
该方案的主要优势再次体现在其内在的操作性匹配方法，可用于分析与多巴胺调节相关的结果 体内 此外，将多巴胺组织检测结果标准化为多巴胺能神经纤维标志物（TH、DAT），可在很大程度上确保研究者一致且准确地分离黑质（SN）或腹侧被盖区（VTA）...

黑质与腹侧被盖区多巴胺调节的全面分析

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

多巴胺是中枢神经系统中被广泛研究的一种神经递质。事实上，由于其在运动活动和奖赏相关行为中的重要作用，过去五十年来，科研人员一直在深入探究与多巴胺调控相关的分子缺陷。这些关于大脑中多巴胺调控的研究，主要集中于黑质纹状体通路和中脑伏隔核通路的终末区域——即纹状体和伏隔核——中多巴胺调控的分子基础。此外，此类研究通常仅将多巴胺组织含量归一化至湿组织重量进行分析。对于调控多巴胺的蛋白质（如酪氨酸羟化酶（TH）蛋白、TH的磷酸化状态、多巴胺转运体（DAT）以及囊泡单胺转运体2（VMAT2）蛋白）的研究，往往未在同一组织样本中同时分析多巴胺的组织含量。能够同时分析多巴胺组织含量及其调控蛋白（包括翻译后修饰）不仅有助于深入理解多巴胺与TH、DAT或VMAT2的蛋白水平及功能之间的关系，还能提高样本利用效率。这不仅降低了研究成本，而且使研究人员能够在几乎任意实验范式下获得关于多巴胺分子调控机制的深刻见解。
我们将分析重点聚焦于中脑。尽管在大多数多巴胺调控研究中，黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）通常被忽视，但经过练习后，这些核团可以较容易地进行分离。可对多巴胺组织含量以及酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺转运体（DAT）或囊泡单胺转运体2（VMAT2）进行系统性检测。目前已有大量文献报道了SN和VTA中多巴胺功能对行为的影响，以及外源性物质或疾病过程对这些区域的干扰作用1-5。此外，某些化合物（如生长因子）对多巴胺及其调控蛋白具有显著影响，且这种影响在SN或VTA中尤为明显6-8。因此，本文介绍该方法旨在为希望深入探究特定处理如何调节行为及多巴胺调控机制的实验室提供参考。本文提供了一种多步骤方法，用于分析来自啮齿类动物中脑的黑质和VTA组织中的多巴胺含量、TH、DAT或VMAT2蛋白水平，以及TH的磷酸化状态。对TH磷酸化的分析不仅有助于深入了解TH活性的调控机制，还可揭示在特定实验范式下影响胞体-树突核团的信号转导级联变化。
我们将演示分离这两个核团的解剖技术，以及对分离组织进行样本处理的方法，从而获得揭示多巴胺调控分子机制的表达谱 体内 特异于每个细胞核 （图1）.

多巴胺在中脑核团中受到独特调控，这些核团含有多巴胺神经元的胞体和树突。本文介绍一种解剖与样本处理方法，旨在最大化对啮齿类动物黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）中脑核团内多巴胺调控研究的结果质量，从而提升结论的可靠性与科学洞察力。

多巴胺是中枢神经系统中被广泛研究的神经递质。事实上，其在运动活动和与奖赏相关行为中的作用已促成了五个……

本实验的总体目标是最大限度地获取与从中脑脑区树突体部分离的单个组织样本中多巴胺调控相关的分子读出信息。该目标首先通过精确解剖，将黑质与腹侧被盖区分离来实现；第二步是对组织进行处理，用于高效液相色谱法（HPLC）分析多巴胺，并进一步处理沉淀的内源性蛋白质以进行后续分析。接下来，对沉淀的蛋白质进行总蛋白含量分析，可确定哪些多巴胺调节蛋白或蛋白磷酸化水平能够与样品中多巴胺组织含量的检测结果联合分析。最终，对中脑特定区域，尤其是胞体-树突区域的多巴胺及其调节蛋白的分析，有助于阐明与多巴胺调节相关的分子机制。单胺类物质影响多种行为结果，事实上，成瘾、生物学以及运动功能障碍（如帕金森病）领域的研究人员都非常关注单胺类物质（如我们在实验室中研究的多巴胺）如何影响行为结果。然而，如果我们能够理解单胺类物质在分子水平上的调控机制，对其研究的重要性将进一步凸显。本技术的优势在于，我们可以从一份中枢神经系统组织样本中获得多种检测结果，从而全面了解分子事件如何导致单胺类物质的失调。我们可以利用这些数据，并将其置于行为将如何受到影响的背景下进行解读。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为对蛋白质及其磷酸化水平的测定需要了解，根据研究者所选用的抗体，需要多少总蛋白才能获得准确的检测结果。该方法的可视化演示至关重要。利用解剖技术结合调节蛋白分析单胺含量，是研究体内调控机制的一种相对较新的方法。开始该实验前，先将啮齿类动物脑切片模具、盛有五把剃刀和11号手术刀的培养皿置于湿冰上预冷。同时，根据解剖所需数量，将离心管置于干冰上预冷。然后，在处死大鼠后取出其脑组织，将脑组织倒置，使小脑外侧嵌入冰冷切片矩阵的凹槽中。一分钟后，将冰冷的剃刀刀片插入冷却的脑组织中，从视交叉前方约两毫米处开始，以进行纹状体和伏隔核的分析。随后，每隔一毫米继续插入冰冷的剃刀刀片，直至脑桥中部，接下来错开每片刀片的位置，以便更轻松地从矩阵中取出。取出刀片时，应寻找海马的起始位置，因为这是确保在海马完全包绕中脑的部位处存在黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）的最佳参考标志。首先使用11号手术刀片进行切片，以分离黑质与腹侧被盖区。随后去除覆盖其上的皮层和海马组织。然后进行垂直切割，将黑质（SN）的色素区域与腹侧被盖区（VTA）分离，确保在解剖过程中刀片始终与湿冰保持接触。接着，在中线处或靠近中线的位置，于黑质背侧和最外侧部分的上方进行水平切割。最后，将黑质从脑干其余部分小心剥离。将黑质去除后，将腹侧被盖区从其余中脑组织中分离出来。立即将解剖得到的组织放入预冷的微量离心管中。随后将组织保存在零下80摄氏度，直至准备进行后续处理。在此步骤中，将组织从干冰中取出后，立即使用预冷的0.1摩尔高氯酸EDTA溶液轻轻匀浆。随后，再次将样品置于干冰上。接下来，以12,000 RPM离心样品以沉淀。用于后续 Western blot 检测的蛋白沉淀，请随后将上清液吸入 HPLC 小瓶中。将来自 HPLC 缓冲液处理后仍处于冷冻状态的蛋白沉淀置于湿冰上解冻，并确保已去除并存档所有缓冲液。对于 SN 的双侧处理，向沉淀中加入 300 微升含 5 毫摩尔 Tris 和 1 毫摩尔 EDTA 的 1% SDS 溶液，并进行超声处理；而对于 VTA 的双侧处理，加入 200 微升 1% SDS 溶液即可。接下来，将样品放入沸水中加热约五分钟，以完成蛋白质变性。然后让样品冷却至室温，此步骤中需确保管盖已拧紧。随后使用BCA法测定蛋白质浓度，标准曲线范围为2至40微克蛋白质。为确定五微升样品中的蛋白质浓度，需根据三次重复分析所得的中位数值，对照标准曲线确定蛋白质含量，再将该结果除以样品体积，得到蛋白质浓度。随后，根据样品缓冲液颜色的提示，必要时使用含有 DIO 三乙醇的样品缓冲液制备样品，用于在 10% 丙烯酰胺凝胶上进行还原型 SDS 电泳。变为黄色后，以10 µL为增量，向样品中逐次加入1 mol/L Tris碱（pH 8.2），直至出现蓝色。为确保pH值合适，使用SDS-PAGE在10%丙烯酰胺凝胶上电泳适量的总蛋白，然后将蛋白质转移至孔径为0.45 µm的硝酸纤维素膜上，将转印槽电压设置为至少27 V，并过夜完成转印。第二天，将印迹干燥至少30分钟。然后用Poncho S溶液染色约5分钟。随后，用0.2%盐酸溶液剧烈震荡洗脱，直至蛋白质条带清晰分离且背景染色完全去除。然后使用 ImageJ 获取 poncho S 染色的图像，以进一步量化每条泳道中相对蛋白质上样量，并对酪氨酸羟化酶、多巴胺转运体或囊泡单胺转运体 2 的结果进行归一化。此处显示的是大鼠黑质样品中磷酸化酪氨酸羟化酶（Serine 31）的 Western 印迹。经校准的 Serine 31 磷酸化酪氨酸羟化酶标准曲线范围为 0.3 纳克至 2.0 纳克，处于检测的线性范围内。此处为大鼠腹侧被盖区样品中磷酸化酪氨酸羟化酶（Serine 40）的 Western 印迹。校准的SN 40酪氨酸羟化酶磷酸化标准曲线范围为0.2纳克至1.5纳克，处于检测的线性范围内。保持适当的温度以及对试管进行标记非常重要。此外，对蛋白质进行归一化处理以减少结果变异也十分关键。严格遵循本方案后，可为运动功能与成瘾行为领域的研究者提供大量影响单胺类物质调节的分子数据，尤其是与我们研究兴趣密切相关的脑内多巴胺系统。这些数据能够对行为学结果的分子基础进行极为详尽和全面的分析。观看本视频后，您应能充分掌握如何通过一次组织切取，最大化获取黑质与腹侧被盖区单胺类物质调节的相关分子信息。

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在黑质和腹侧被盖区多巴胺调控的综合性能分析

本文描述了一种在小鼠中进行单侧内侧前脑束6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的实验方案。该方法死亡率较低（13.3%），存活小鼠中有89%表现出纹状体多巴胺含量减少&gt;95%，且对侧旋转偏差达90.63±4.02%，偏向损毁侧。...

帕金森病单侧损毁6-OHDA小鼠模型的建立

利用快速扫描循环伏安法测量纹状体脑片中电刺激诱发的突触前多巴胺动态变化。...

采用快速扫描循环伏安法检测纹状体脑切片中的突触前多巴胺动态变化

本视频展示了在麻醉大鼠中植入电极和套管，以使用恒电位仪测量伏隔核中的多巴胺释放，并通过向腹侧被盖区输注药物来调节多巴胺能活性。...

通过VTA多巴胺能神经元受体操控的大鼠模型监测多巴胺释放

本方案描述了两种不同的环境干预方法以及一种同步进行的脑内灌注方案，用于研究成年小鼠中由环境诱导的、介导适应性行为和脑修复的脑部变化。...

成年小鼠中脑多巴胺能神经元数量的环境调节

快速扫描循环伏安法可用于在药物、疾病及其他实验干预条件下监测体内多巴胺神经传递。本研究介绍了QNsim1.0软件的使用方法，该软件基于定量神经生物学模型，用于模拟电刺激诱导的多巴胺反应，以量化估算多巴胺的释放与再摄取动力学参数。...

使用 QNsim1.0 对电刺激多巴胺神经传递的快速扫描循环伏安法数据进行建模

突触体多巴胺摄取与高效液相色谱分析是研究小鼠多巴胺稳态的实验工具，分别用于评估多巴胺转运体功能和纹状体组织中多巴胺水平。本文中，我们提供了测定多巴胺组织含量及评估多巴胺转运体功能的实验方案。...

利用高效液相色谱分析和突触体多巴胺摄取评估小鼠多巴胺能稳态

在伏隔核中鉴定多巴胺 D1-α 受体对于阐明中枢神经系统疾病期间 D1 受体功能障碍至关重要。我们采用了一种新型的 RNA 原位 杂交检测方法，以可视化特定脑区中的单个 RNA...

通过一种创新的RNA 原位检测技术鉴定啮齿类动物伏隔核中的多巴胺D1-α受体

本实验方案的目的是直接操控腹侧被盖区受体，以研究其对次秒级多巴胺释放的贡献。...

联合灌注与刺激结合快速扫描循环伏安法（CIS-FSCV）评估腹侧被盖区受体对时相性多巴胺的调控

本文介绍一种用于自动半定量测定大鼠黑质致密部多巴胺能神经元数量的方法。...

使用自动图像分析法对啮齿类动物模型黑质中多巴胺能神经元密度进行半定量测定

本方案展示了如何获取黑质的神经黑色素敏感磁共振成像数据。...

黑质神经黑色素敏感磁共振成像的标准化数据采集

学习使用高效液相色谱法和蛋白质分析技术，精确分离啮齿动物黑质与腹侧被盖区，研究多巴胺调控的分子机制。该方法可从单一组织样本获取多重分子读数，为神经精神疾病研究提供重要数据。

黑质与腹侧被盖区多巴胺调节的全面分析

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