黑质与腹侧被盖区多巴胺调节的全面分析

本实验的总体目标是最大限度地获取与从中脑脑区树突体部分离的单个组织样本中多巴胺调控相关的分子读出信息。该目标首先通过精确解剖，将黑质与腹侧被盖区分离来实现；第二步是对组织进行处理，用于高效液相色谱法（HPLC）分析多巴胺，并进一步处理沉淀的内源性蛋白质以进行后续分析。

接下来，对沉淀的蛋白质进行总蛋白含量分析，可确定哪些多巴胺调节蛋白或蛋白磷酸化水平能够与样品中多巴胺组织含量的检测结果联合分析。最终，对中脑特定区域，尤其是胞体-树突区域的多巴胺及其调节蛋白的分析，有助于阐明与多巴胺调节相关的分子机制。

单胺类物质影响多种行为结果，事实上，成瘾、生物学以及运动功能障碍（如帕金森病）领域的研究人员都非常关注单胺类物质（如我们在实验室中研究的多巴胺）如何影响行为结果。然而，如果我们能够理解单胺类物质在分子水平上的调控机制，对其研究的重要性将进一步凸显。本技术的优势在于，我们可以从一份中枢神经系统组织样本中获得多种检测结果，从而全面了解分子事件如何导致单胺类物质的失调。

我们可以利用这些数据，并将其置于行为将如何受到影响的背景下进行解读。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为对蛋白质及其磷酸化水平的测定需要了解，根据研究者所选用的抗体，需要多少总蛋白才能获得准确的检测结果。该方法的可视化演示至关重要。

利用解剖技术结合调节蛋白分析单胺含量，是研究体内调控机制的一种相对较新的方法。开始该实验前，先将啮齿类动物脑切片模具、盛有五把剃刀和11号手术刀的培养皿置于湿冰上预冷。同时，根据解剖所需数量，将离心管置于干冰上预冷。

然后，在处死大鼠后取出其脑组织，将脑组织倒置，使小脑外侧嵌入冰冷切片矩阵的凹槽中。一分钟后，将冰冷的剃刀刀片插入冷却的脑组织中，从视交叉前方约两毫米处开始，以进行纹状体和伏隔核的分析。随后，每隔一毫米继续插入冰冷的剃刀刀片，直至脑桥中部，接下来错开每片刀片的位置，以便更轻松地从矩阵中取出。

取出刀片时，应寻找海马的起始位置，因为这是确保在海马完全包绕中脑的部位处存在黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）的最佳参考标志。首先使用11号手术刀片进行切片，以分离黑质与腹侧被盖区。随后去除覆盖其上的皮层和海马组织。

然后进行垂直切割，将黑质（SN）的色素区域与腹侧被盖区（VTA）分离，确保在解剖过程中刀片始终与湿冰保持接触。接着，在中线处或靠近中线的位置，于黑质背侧和最外侧部分的上方进行水平切割。最后，将黑质从脑干其余部分小心剥离。

将黑质去除后，将腹侧被盖区从其余中脑组织中分离出来。立即将解剖得到的组织放入预冷的微量离心管中。随后将组织保存在零下80摄氏度，直至准备进行后续处理。

在此步骤中，将组织从干冰中取出后，立即使用预冷的0.1摩尔高氯酸EDTA溶液轻轻匀浆。随后，再次将样品置于干冰上。接下来，以12,000 RPM离心样品以沉淀。

用于后续 Western blot 检测的蛋白沉淀，请随后将上清液吸入 HPLC 小瓶中。将来自 HPLC 缓冲液处理后仍处于冷冻状态的蛋白沉淀置于湿冰上解冻，并确保已去除并存档所有缓冲液。对于 SN 的双侧处理，向沉淀中加入 300 微升含 5 毫摩尔 Tris 和 1 毫摩尔 EDTA 的 1% SDS 溶液，并进行超声处理；而对于 VTA 的双侧处理，加入 200 微升 1% SDS 溶液即可。

接下来，将样品放入沸水中加热约五分钟，以完成蛋白质变性。然后让样品冷却至室温，此步骤中需确保管盖已拧紧。随后使用BCA法测定蛋白质浓度，标准曲线范围为2至40微克蛋白质。

为确定五微升样品中的蛋白质浓度，需根据三次重复分析所得的中位数值，对照标准曲线确定蛋白质含量，再将该结果除以样品体积，得到蛋白质浓度。随后，根据样品缓冲液颜色的提示，必要时使用含有 DIO 三乙醇的样品缓冲液制备样品，用于在 10% 丙烯酰胺凝胶上进行还原型 SDS 电泳。

变为黄色后，以10 µL为增量，向样品中逐次加入1 mol/L Tris碱（pH 8.2），直至出现蓝色。为确保pH值合适，使用SDS-PAGE在10%丙烯酰胺凝胶上电泳适量的总蛋白，然后将蛋白质转移至孔径为0.45 µm的硝酸纤维素膜上，将转印槽电压设置为至少27 V，并过夜完成转印。

第二天，将印迹干燥至少30分钟。然后用Poncho S溶液染色约5分钟。随后，用0.2%盐酸溶液剧烈震荡洗脱，直至蛋白质条带清晰分离且背景染色完全去除。

然后使用 ImageJ 获取 poncho S 染色的图像，以进一步量化每条泳道中相对蛋白质上样量，并对酪氨酸羟化酶、多巴胺转运体或囊泡单胺转运体 2 的结果进行归一化。此处显示的是大鼠黑质样品中磷酸化酪氨酸羟化酶（Serine 31）的 Western 印迹。经校准的 Serine 31 磷酸化酪氨酸羟化酶标准曲线范围为 0.3 纳克至 2.0 纳克，处于检测的线性范围内。此处为大鼠腹侧被盖区样品中磷酸化酪氨酸羟化酶（Serine 40）的 Western 印迹。

校准的SN 40酪氨酸羟化酶磷酸化标准曲线范围为0.2纳克至1.5纳克，处于检测的线性范围内。保持适当的温度以及对试管进行标记非常重要。此外，对蛋白质进行归一化处理以减少结果变异也十分关键。

严格遵循本方案后，可为运动功能与成瘾行为领域的研究者提供大量影响单胺类物质调节的分子数据，尤其是与我们研究兴趣密切相关的脑内多巴胺系统。这些数据能够对行为学结果的分子基础进行极为详尽和全面的分析。观看本视频后，您应能充分掌握如何通过一次组织切取，最大化获取黑质与腹侧被盖区单胺类物质调节的相关分子信息。