一种从野生幼虫中提取血细胞的简易方案

本实验的总体目标是从野生幼虫中提取、观察并计数血细胞。首先将幼虫置于冰上进行麻醉，随后注射含有抗凝剂的缓冲液，并将幼虫放回冰上，使血细胞重新进入循环系统，然后再进行提取。第二步是使用洁净的解剖刀在幼虫后端做一个浅切口。

接下来，使用柔软的镊子轻轻挤压毛虫，然后用微量移液器吸取血淋巴与缓冲液的混合液，并收集到微量离心管中。最后一步是将血淋巴溶液与等体积的缓冲液轻轻混匀，取10 µL溶液转移到血细胞计数板上，以观察并计数血细胞的数量。

最终，这种血细胞提取方法可作为一种快速有效的方法，用于计数多种毛虫物种的血细胞，并可作为一种工具来研究昆虫细胞免疫反应的生理学特征。该技术的主要优势在于，它可用于从体型非常微小的毛虫中提取血细胞。其他毛虫模型通常是通过切割其前肢之一，从流出的体液中获取血细胞。

此外，该技术还可用于从其他昆虫物种中提取血细胞。该方法可用于解答生态免疫学领域的一些关键问题，例如昆虫的细胞免疫反应如何随食物质量、发育阶段或暴露于不同病原体而变化。开始此操作时，需将倒数第二龄幼虫置于冰上冷藏20分钟，以进行麻醉，然后再进行血细胞提取。

随后，将一支洁净的16号毛细针的钝端插入连接至20毫升玻璃注射器的管路中。将装有收集溶液的试管敞口放置在实验台上。缓慢吸取约10至15微升缓冲液至毛细管中。

然后将针放在解剖显微镜旁的一团黏土上。将幼虫放入培养皿中。应将昆虫侧放，以便清晰观察到球形结构。

在体视显微镜下观察时，用一对镊子固定住幼虫，并将针头靠近其中一个球状体节，该部位昆虫表皮通常较柔软。然后轻轻将毛细玻璃针压入昆虫体壁。一旦针头刺穿表皮，即将溶液的全部体积注入幼虫体内。

注射后，幼虫的体体会膨胀，但不应破裂或渗出液体。将幼虫放回冰镇的培养皿中，将其背侧朝上放置，以防止缓冲液从伤口泄漏。

对用于采集血淋巴的每只毛虫重复注射操作。然后将所有昆虫置于冰上冷藏30分钟。现在，将毛虫放置在解剖显微镜下的培养皿中。

使用无菌手术刀在幼虫后部区域小心地做一个长约2至3毫米的浅切口，注意不要损伤肠道或其他内部器官。接下来，用一对柔软的塑料镊子轻轻挤压幼虫，同时用10微升移液器吸头收集约10至20微升的血淋巴混合液。同样需注意避免损伤内部组织。

随后，弃去毛虫的残体。将每只毛虫的血淋巴分别收集到已标记的硅化0.5毫升微量离心管中。然后向来自每只单独毛虫的血淋巴样品中加入约10至20微升孵育液。

在此步骤中，始终将血淋巴样品置于冰上。在计数前立即混合血淋巴样品与孵育液。He cytes。

该处理可实现血细胞的充分分离，并防止细胞聚集。使用洁净的移液器吸头，将10 µL与孵育液混合的血淋巴样本转移至血细胞计数板上。然后在复式显微镜下计数并记录血细胞计数板中央网格中至少15个大方格内的血细胞数量。

将这些数值相加，得到15个方格内血细胞总数的总和。接下来，使用装有蒸馏去离子水的洗瓶彻底冲洗血细胞计数板及其盖玻片，然后用Kim擦拭纸擦干。

对剩余的血淋巴样品重复上述步骤，并计算每只毛虫每毫升血淋巴体积中的血细胞平均数量。明场显微镜图像显示了从核酸酶抑制剂处理的毛虫中提取的血细胞，放大倍数为20倍。通过该方法获得的血细胞可用于研究细胞免疫反应，并开展吞噬作用、CAP选择性包囊以及酚氧化酶活性等检测实验。

此外，可以收集未使用的 RNA-DNA 和蛋白质，用于后续检测，以研究昆虫的细胞免疫反应。观看本视频后，您应能充分掌握如何注射毛虫以提取血淋巴，以及如何收集含有活体血细胞的血淋巴。