Name: 一个简单的协议提取血细胞从野生毛毛虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习从野生毛毛虫中提取、可视化和计数血细胞的方法，用于昆虫免疫学研究。该技术通过麻醉、注射抗凝缓冲液和显微计数，帮助研究人员快速评估昆虫细胞免疫反应。

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本研究期间，TMS 获得了哈兰信托研究员项目（GWU）的支持。L. fasciola 和 E. delphinii 的野外采集与繁育经费由美国国家科学基金会（NSF）授予 JTL 的项目 DEB 0642438 提供资助。

1. 材料准备
<ol>
	<li>使用硼硅酸盐玻璃毛细管和微电极拉制仪制备针尖（尖端直径1-2 μm，锥度3-4 mm）。仪器参数设置：ramp：561；velocity：20；heat：560；delay：1；pull：100；pressure：500。</li>
	<li>配制收集液：60% Grace's Medium（GM），添加10%胎牛血清（FBS）和20%抗凝缓冲液（含98 mM NaOH、186 mM NaCl、1.7 mM EDTA 和 41 mM 柠檬酸，pH 4.5）。上述溶液需在无菌条件下新鲜配制，并始终置于冰上保存。</li>
	<li>配制孵育缓冲液：90% Grace's Medium（GM）添加10%胎牛血清（FBS）。该溶液也需新鲜配制，并始终置于冰上保存。</li>
	<li>收集液和孵育液的总体积均需准备至少15 μl × 昆虫数量。</li>
</ol>
2. 用收集液注射毛虫
<ol>
	<li>在采集血细胞前，将倒数第二龄幼虫置于冰上冷藏20分钟以进行麻醉。</li>
	<li>将一根洁净的钝头毛细针（16号）的钝端插入连接至20 ml玻璃注射器的管路中（图2）。将装有收集液的管子敞口放置在实验台上，缓慢用缓冲液充满毛细针。毛细针通常充入约10–15 μl收集液，具体体积取决于毛虫的大小（每10 mg毛虫总体重约需1 μl溶液，即总体重的0.01%）。将针头放置在解剖显微镜旁的一团黏土上固定。</li>
	<li>将毛虫放入培养皿中，使其侧卧，以便清晰观察气门（图3）。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察，用一对镊子固定毛虫，并将针头靠近其中一个气门处——该区域的昆虫表皮通常较柔软。轻轻将毛细针压在昆虫体壁上。一旦针头刺穿表皮，即将全部溶液注入毛虫体内（图3）。注意避免将气泡注入毛虫体内。注射后毛虫身体会膨胀（例如，体积增加20%），但不应破裂或渗漏。</li>
	<li>将毛虫放回冰上，使其背部朝上，以防止缓冲液从伤口泄漏（图3）。</li>
	<li>对每只用于血淋巴提取的毛虫重复步骤2.1–2.4。在此阶段，让所有昆虫在冰上继续冷藏30分钟后再进行后续操作。</li>
</ol>
3. 血细胞的提取
<ol>
	<li>将幼虫置于解剖显微镜下的培养皿中。</li>
	<li>使用无菌解剖刀在幼虫后部区域做一个浅层切口（长2-3 mm）（图3）。注意不要损伤肠道或其他内部器官；目的是小心刺破表皮，并收集含有血细胞的缓冲液/血淋巴混合物，来自单个昆虫。</li>
	<li>用柔软的塑料镊子轻轻挤压幼虫，同时用10 μl移液器吸头收集血淋巴混合物（约10-20 μl），再次注意避免损伤内部组织（图3）。血淋巴从幼虫体壁挤出的液滴中获取。弃去幼虫残体。</li>
	<li>将每只单独幼虫的血淋巴分别收集到已标记的硅化0.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>向每份来自单只幼虫的血淋巴样品中加入等体积的孵育溶液（约10-20 μl）。血淋巴样品始终置于冰上保存。</li>
	<li>对实验中使用的每只幼虫重复步骤3.1–3.5。</li>
</ol>
4. 血细胞的定量分析
<ol>
	<li>在计数血细胞之前，立即将血淋巴样品与孵育液混合。此处理可实现血细胞的充分分离，并防止细胞聚集。</li>
	<li>使用洁净的移液器吸头，将10 μl已混合孵育液的血淋巴样品转移至血细胞计数板上。</li>
	<li>使用复式显微镜，计数并记录血细胞计数板中央网格中至少15个大方格内的血细胞数量（每个方格面积：0.04 mm2，深度：0.1 mm）（图3）。将这些数值相加，得到15个方格内血细胞总数。</li>
	<li>每次样品操作之间，使用装有去离子蒸馏水的冲洗瓶彻底冲洗血细胞计数板及其盖玻片，并用Kimwipes（Kimberly-Clark）擦拭干燥。</li>
	<li>对每个血淋巴样品重复步骤4.1–4.4。</li>
	<li>按下述方法计算每只幼虫每毫升血淋巴体积内的平均血细胞数量：</li>
</ol>
血细胞计数板网格中方格的总体积：（0.04 mm2 面积）×（0.1 mm 深度）= 0.004 mm3 × 15 个方格 = 0.06 mm3 = 所计数的全部15个方格的总体积。
（15个计数方格中血细胞总数之和 / 15个计数方格的总体积）× 2 稀释倍数 = 血细胞数/mm3 × 1,000 = 血淋巴中血细胞数/ml。

<ol><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).</li>
<li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes%3A+masters+of+multitasking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542(2007).</li>
<li>Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+cellular+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">The insect cellular immune response.</a> Insect Sci. 15 (1), 1(2008).</li>
<li>Fauvarque, M. O., Williams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+cellular+immunity%3A+a+story+of+migration+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion.</a> J. Cell Sci. 124 (9), 1373(2011).</li>
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<li>Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+in+lepidopteran+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunity in lepidopteran insects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181(2010).</li>
<li>Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmatocyte-spreading+peptide+%28PSP%29+plays+a+central+role+in+insect+cellular+immune+defenses+against+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection.</a> J. Exp. Biol. 212 (12), 1840(2009).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehélin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+what+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: what type of cell is that.</a> J. Insect Physiol. 52 (5), 417(2006).</li>
<li>Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+larval+and+pupal+hemocytes+of+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%2C+determined+by+monoclonal+antibodies+and+density+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation.</a> J. Insect Physiol. 50 (9), 805(2004).</li>
<li>Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+hemocyte+counts+with+different+developmental+parameters+during+the+last+larval+instar+of+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63(2008).</li>
<li>Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects%2C+nematodes+and+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695(2010).</li>
<li>Qayum, A. A., Telang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+Collecting+and+Staining+Hemocytes+from+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti.</a> J. Vis. Exp. (51), e2772(2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

此前已有文献报道过从具有医学重要性的昆虫以及鳞翅目模式昆虫中提取血细胞的方法9, 14。血细胞提取方法需根据昆虫种类、发育阶段及其形态特征进行相应调整。例如，可通过剪断烟草天蛾（Manduca）幼虫腹部末端附近的弯曲角状突起，便捷地获取血淋巴15。由于蛞蝓状幼虫（Limacodidae科）缺乏此类腹部结构，我们开发了一种专门适用于野外采集的小型幼虫的血淋巴提取方案。该方法能够高效地分离出含有大量血细胞的血淋巴，所获样本可直接用于后续实验或储存。此外，成蚊血细胞的采集通常包含一个耗时的步骤，即需仔细去除其足、翅以及腹部末端16；而本方案无需此类操作，因此从蛞蝓状幼虫中分离血细胞的过程更为简便快捷。本技术的局限性可能包括：1）与其他所有血细胞提取方法一样，昆虫需在实验当天处死；2）同种同发育阶段的幼虫之间，血细胞数量可能存在显著差异，因此需使用多个个体以计算每单位体积血淋巴中的平均血细胞数量。
我们计划在今后的研究中利用该方法，对从森林中采集的毛虫不同发育阶段的血细胞类型进行形态学表征。该检测方法还可作...

<table><tbody><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃管</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-50-10</td><td>外径：1.0 mm，内径：0.50 mm</td></tr><tr><td>Grace's 培养基</td><td>Sigma</td><td>G8142</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH3007102</td><td>经热灭活</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine science tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>塑料管</td><td>Tri-Tech</td><td>TT-3-32OD</td><td>外径：3/32英寸，内径：1/32英寸</td></tr><tr><td>玻璃医用注射器</td><td>Fortuna Optima</td><td>D-97877</td><td>50 ml 容量</td></tr><tr><td>钝头针</td><td>Small Parts</td><td>NE-162PL-25</td><td>16 号 × 1&quot; 长度</td></tr></tbody></table>

一种从野生幼虫中提取血细胞的简易方案

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

昆虫血细胞（相当于哺乳动物的白细胞）在昆虫整个生命周期的多种生理过程中发挥着重要作用1。在鳞翅目（蛾类和蝴蝶）和双翅目（真蝇类）昆虫的幼虫阶段，血细胞来源于淋巴腺（一种特化的造血器官）或胚胎细胞，并可延续至成虫阶段。胚胎来源的血细胞参与发育过程中的细胞迁移以及炎症期间的趋化性调控，同时也参与细胞凋亡，对胚胎发育至关重要2。血细胞介导昆虫先天免疫反应的细胞分支，其功能包括细胞铺展、细胞聚集、结节形成、吞噬作用以及对异物的包裹作用3。它们还负责在感染过程中协调特定的体液免疫防御反应，例如抗菌肽及其他效应分子的产生4,5。目前对血细胞形态与功能的研究主要集中在遗传学或生理学昆虫模型上，包括果蝇Drosophila melanogaster6,7、埃及伊蚊Aedes aegypti和冈比亚按蚊Anopheles gambiae8,9，以及烟草天蛾Manduca sexta10,11。然而，关于非模式昆虫物种——尤其是从野外采集的物种——其血细胞的多样性、分类、形态及功能，目前仍缺乏足够的研究信息12。
本文介绍了一种从野生幼虫中提取血细胞的简单且高效的方法。我们以近末龄期的Lithacodes fasciola（黄肩蛞蝓蛾）（图1）和Euclea delphinii（刺 oak 蛞蝓）幼虫（鳞翅目：刺蛾科）为例，证明可从单个幼虫中分离出足够体积的血淋巴（昆虫血液），并计数血细胞数量。该方法可用于高效研究这些物种以及其他从野外采集的近缘鳞翅目幼虫的血细胞类型，也可与免疫学检测方法结合使用，以研究微生物或寄生生物感染后血细胞的功能13。

本方案可从单个幼虫中收集至少10–20 μl的昆虫血淋巴。采用该方法收集的血细胞无细胞聚集、黑化缺陷、组织碎片或其他污染物。因此，可在显微镜下直接观察并计数血细胞，且可在数小时内完成对多个昆虫个体的观察。我们观察到，样本中大多数血细胞为浆细胞3（血细胞呈不对称铺展）（图4）。目前我们正在对这些幼虫中存在的不同类型血细胞进行详细表征（Stoepler et al.，未发表数据）。本方法为来自野外实验的单个幼虫总血细胞数量的快速、准确计数提供了有效手段。
尽管昆虫物种间及种内血细胞密度可能存在显著差异1，我们发现L. fasciola幼虫的血细胞数量范围为1.10 × 106 - 8.23 × 106 个细胞/ml血淋巴（平均值：3.51 × 106；n = 31 只幼虫），处于其他鳞翅目昆虫先前报道值的范围内14。
<p class="jove_content" fo:keep...

昆虫血细胞在昆虫发育的各个阶段均执行多种重要功能，包括免疫和非免疫功能。目前关于血细胞类型和功能的知识主要来源于对昆虫遗传模型的研究。本文介绍了一种从野生毛虫中提取、定量和可视化血细胞的方法。

昆虫血细胞（相当于哺乳动物的白细胞）在其整个生命周期的多种生理过程中发挥着重要作用……

本实验的总体目标是从野生幼虫中提取、观察并计数血细胞。首先将幼虫置于冰上进行麻醉，随后注射含有抗凝剂的缓冲液，并将幼虫放回冰上，使血细胞重新进入循环系统，然后再进行提取。第二步是使用洁净的解剖刀在幼虫后端做一个浅切口。接下来，使用柔软的镊子轻轻挤压毛虫，然后用微量移液器吸取血淋巴与缓冲液的混合物，并收集到微量离心管中。最后一步是将血淋巴溶液与等体积的缓冲液轻轻混匀，取10 µL该溶液加入血细胞计数板，以观察并计数血细胞的数量。最终，这种血细胞提取方法可作为一种快速有效的方法，用于计数多种幼虫物种的血细胞，并可作为研究昆虫细胞免疫反应生理学特征的工具。该技术的主要优势在于，可用于从体型非常微小的幼虫中提取血细胞。其他幼虫模型通常通过切开一个原足（proleg），收集流出的液体来提取血细胞。此外，该技术还可用于从其他昆虫物种中提取血细胞。该方法可用于解答生态免疫学领域的一些关键问题，例如昆虫的细胞免疫反应如何随食物质量、发育阶段或暴露于不同病原体而变化。开始该实验前，需将倒数第二龄幼虫置于冰上冷藏20分钟，以进行麻醉，随后再进行血细胞提取。随后，将一根洁净的16号毛细针的钝端插入连接至20毫升玻璃注射器的管路中。将装有收集溶液的试管敞口放置在实验台上。缓慢吸取约10至15微升缓冲液至毛细管中。然后将针放在解剖显微镜旁的一团黏土上。将幼虫放入培养皿中。应将昆虫侧置，以便清晰观察其球状结构。在体视显微镜下观察时，用一对镊子固定住幼虫，并将针头靠近其中一个球形区域，该处昆虫表皮通常较柔软。然后轻轻将毛细管针头压向昆虫体壁。一旦针头刺穿表皮，即将溶液的全部体积注入幼虫体内。注射后，幼虫的体体会膨胀，但不应破裂或渗出液体。将幼虫放回冰镇的培养皿中，使其背面向上放置，以防止缓冲液从伤口漏出。对用于采集血淋巴的每只毛虫重复注射操作。然后将所有昆虫置于冰上冷藏30分钟。现在，将毛虫置于解剖显微镜下的培养皿中。使用无菌解剖刀，在幼虫后部区域小心地做一个长约2至3毫米的浅切口，注意不要损伤肠道或其他内部器官。接着，用一对柔软的塑料镊子轻轻挤压幼虫，同时用10微升移液器吸头收集约10至20微升的血淋巴混合液。同样需注意避免损伤内部组织。随后，弃去毛虫的残体。将每只毛虫的血淋巴分别收集到预先标记的硅化0.5毫升微量离心管中。然后向来自每只单独毛虫的血淋巴样品中加入约10至20微升孵育液。此步骤中，血淋巴样品必须始终置于冰上。计数前立即混合血淋巴样品与孵育液。He cytes。该处理可实现血细胞的充分分离，并防止细胞聚集。使用洁净的移液器吸头，将10 µL与孵育液混合的血淋巴样品转移至血细胞计数板上。随后在复式显微镜下计数并记录血细胞计数板中央网格中至少15个大方格内的血细胞数量。将这些数值相加，得到15个方格内血细胞总数的总和。接下来，使用装有蒸馏去离子水的洗瓶彻底冲洗血细胞计数板及其

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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