一种改良的美国环保署方法1623，采用切向流中空纤维超滤与热解离步骤检测水源性Cryptosporidium和Giardia spp.

本实验的总体目标是检测并可视化水中的隐孢子虫和贾第虫种类。首先通过切向流中空纤维超滤法对水样进行浓缩，实现目标。第二步是通过离心步骤后，将生物体从滤膜中洗脱，并截留杂质。

免疫磁珠分离法可实现从浓缩的碎片中选择性分离寄生虫。通过加热解离使磁珠与寄生虫分离，并利用磁铁将其去除。随后将包囊和O型包囊置于载玻片上，对样品进行染色，以便通过免疫荧光显微镜观察。

与现有技术相比，hofi 过滤的主要优势在于超滤装置成本显著更低，并且除了隐孢子虫和贾第虫外，还能捕获病毒和细菌等多种微生物。通常，初次接触免疫分离的人员会因不同气候条件下样品所含杂质的数量和类型而面临挑战。首先在生物安全柜内组装超滤装置。

组装完成后，仪器的工作流程如下：水样通过黑色三通接头进入系统，流经泵头、压力表后进入中空纤维超滤器；过滤后的水从滤器侧端流出，进入废液容器。含有目标生物的截留液则被压入截留液收集瓶，并在系统中循环，直至水样体积减少至所需程度。开始操作时，取下通气盖，除夹住2号管夹的压紧夹外，打开所有管夹；2号压紧夹应保持关闭，以便截留液瓶进水。设置泵的运转方向，使水样流入滤器。

当渗出液瓶装至三分之二满时，将泵速调节至25%并启动泵。夹紧第二根管夹，并迅速用通气盖将瓶子 tightly 密封。检查所有管路和接头，确保无泄漏。

然后使用量筒和计时器或流量计，缓慢将泵速提高至约 1.5 升/分钟，并验证滤液流速（即从出流管路流出的水的流速）确实为 1.5 升/分钟。监测过滤过程，确保滞留瓶始终不被排空，尽管其体积可能略有增加或减少。如果体积降至三分之一以下，取下通气盖并关闭夹紧夹具二。

再次让瓶中的液体体积增加至三分之二。然后 tightly 重新装上通气盖，并再次打开夹具二。一旦样品容器排空，立即关闭夹具一，并将泵速降低至 20%。取下截留液瓶上的通气盖，并关闭连接滤柱流出管与废液罐的斜坡夹具。

拧紧或松开斜坡夹，将截留液瓶中的体积调节至约 200 毫升。然后拧紧斜坡夹，以洗脱液进行样品洗脱。首先，向样品容器中加入 500 毫升洗脱液溶液，在此过程中冲洗容器内壁。

然后将连接到样品吸取管路的10毫升移液管放入洗脱液容器中。打开夹管阀一，同时短暂关闭夹管阀二，以吸入洗脱液。待全部溶液加载完毕后，关闭夹管阀一，打开夹管阀二，使溶液以20%的泵速循环5分钟。通过拧紧或松开斜坡夹来调节再生液瓶中的样品体积至约100毫升。

然后完全拧紧坡道夹，并让样品循环一分钟。此时，将泵的运行方向反转，持续20秒。这将导致约225毫升的样品在采样瓶中积聚。

然后关闭泵。将管道从泵头和滤器出口处取下，将管道置于采样瓶上方，以排出管道中残留的样品。随后断开与采样瓶连接的所有管道，并将通气盖更换为非通气盖。

将浓缩后的样品转移至一个250毫升的圆锥形离心管中。用10毫升试剂水将渗滤液瓶冲洗两次，并将冲洗液转移至该离心管中。以至少1500 ×g 的离心力离心样品15分钟。

不得使用刹车停止离心。离心结束后，小心吸除上清液，保留约五毫升液体于沉淀上方。操作时需格外小心，保持在液面顶部，避免吸出O型包囊以及位于沉淀中的包囊。

涡旋振荡管子，充分重悬沉淀。然后将样品转移至含有1毫升10×SL缓冲液A和1毫升缓冲液B的平底Dyal L 10管中。用2.5毫升试剂水冲洗离心管两次，并将洗涤液加入Dyal L 10管中。加水至终体积为12毫升，再向管中各加入100 µL磁珠偶联的抗隐孢子虫抗体和抗贾第鞭毛虫抗体。

然后在室温下，将试管置于旋转混合器上以18 RPM旋转一小时。旋转结束后，将试管的扁平侧紧贴MP six磁铁，并轻轻摇动试管两分钟，期间不将试管从磁铁上取下。保持扁平侧朝上，小心倾倒弃去上清液。

注意不要扰动保留在管子扁平侧靠近磁铁的磁珠。将样品管从磁铁上取下，用500微升缓冲液A冲洗管子的扁平侧三次，避免接触管子圆弧侧的碎片。每次冲洗液转移至置于MPCS磁铁内的1.5毫升微量离心管中。

将磁铁置于垂直位置。关闭管盖，轻轻摇动1分钟。然后保持磁铁位置不变，用移液管从管底小心吸去上清液，再向管中轻轻加入1毫升PBS。

注意不要扰动磁珠沉淀。将磁铁条贴附在靠近磁珠沉淀的管壁上。取下磁铁条，并轻轻摇动离心管，直至磁珠完全重悬。

将磁条重新插入垂直位置。轻轻摇动离心管约1分钟，然后吸除上清液，尽可能去除杂质，同时避免扰动磁珠。此洗涤步骤完成后，移去磁铁，直接向磁珠沉淀中加入50微升试剂水。

将离心管在最大速度下涡旋振荡50秒，以重悬磁珠。然后将样品在80摄氏度下孵育10分钟，使贾第虫包囊和隐孢子虫o型包囊从磁珠上解离。孵育结束后，将样品涡旋振荡30秒。随后将磁力架以倾斜位置放入MPCS中，使磁珠与悬浮液中的包囊和o型包囊分离。

将含有包囊和O型包囊的上清液转移至载玻片的凹孔中。再次重复加水、涡旋和热解离步骤，并将上清液加入同一张载玻片的凹孔内。随后将载玻片置于37摄氏度的载玻片加热台上，使悬液干燥。

首先，在载玻片上加入 50 µL 甲醇以固定样本，并在室温下自然干燥。接着，加入 50 µL DPI 溶液，将载玻片在室温下孵育两分钟。为染色细胞核，使用 Kim 擦拭纸从反应孔中吸去染液，注意不要触碰孔壁。

然后加入 50 µL 的易染染料，对贾第虫包囊和隐孢子虫卵囊的细胞壁进行染色。将样本在 35°C 下孵育 30 分钟。用 Kim 擦拭纸按之前方法去除染液。

然后，将移液枪枪头小心地置于孔外侧，缓慢加入300 µL冷的Easy Stain固定缓冲液，使液体自然流入孔内。将载玻片在室温下孵育2分钟。随后用Kimwipe纸巾吸去缓冲液，加入10 µL封片介质，轻轻将盖玻片覆盖在样本上，排除任何气泡，并用透明指甲油封固盖玻片。使用荧光显微镜，在200 ×至1000 ×放大倍数下观察样本，采用FSE和DPI滤光片在200 ×放大倍数下观察，可见囊肿和O型囊肿呈现为明亮的苹果绿色荧光椭圆结构，边缘明显亮化。

隐孢子虫卵囊呈圆形，大小范围为4至6微米。贾第虫卵囊较大，宽度为5至15微米，长度为8至18微米，在1000倍放大下可呈圆形或椭圆形。使用DPI滤镜可更清晰地观察卵囊和CYS的内部结构。

通常，在隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊内可见多达四个子孢子，其细胞核经DPI染色后呈天蓝色。微分干涉差显微镜（DIC）也有助于寄生虫的准确鉴定，因为可观察到其他形态学特征。隐孢子虫的子孢子可通过DIC观察到；贾第虫包囊常显示一个或多个可辨别的内部结构，例如可见的细胞核、新月形的细胞器（称为中体）以及称为轴丝的内部鞭毛结构。

需要注意的是，全纤维超滤法能够捕获多种微生物。此外，还可对浓缩后的样品进行QPCR和基因分型等其他检测分析，这使得该方法具有更高的灵活性和更广泛的应用适应性。感谢观看，如有任何问题，请随时与我们联系。