Name: 流式细胞仪分离纯化 S.酵母合子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: 了解如何使用流式细胞仪分离纯化酿酒酵母合子。该方法通过双荧光标记和两步分选技术，可获得纯度约90%的合子群体，适用于酵母遗传学和细胞生物学研究。

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感谢 R. Michael Sramkoski 博士在流式细胞术方面的帮助，Purnima Jaiswal 博士和 Di Wu 博士的早期建议，以及 Ilya Aylyarov 在插图方面的协助。本研究由 NIH 资助项目 R01GM089872 和 凯斯综合癌症中心细胞分析与成像显微技术核心设施（P30 CA43703） 资助支持。

1. 单倍体细胞培养
<ol>
 <li>在标准条件下培养来自 S288C 背景（BY4741）的 S. cerevisiae 细胞10。</li>
 <li>转化单倍体细胞，使其表达两种明显荧光标记物中的任意一种10。所选标记物为在细胞质中表达的可溶性 GFP（pEG220，URA3/YIp，用 BglII 线性化11），以及与 mCherry 融合的单个核糖体蛋白 RPL25（pAJ1661，URA3/CEN，来自 A. Johnston）。我们预计，等效的双色纯化方案也可使用其他由单倍体亲本细胞合成的强荧光蛋白。或者，可用荧光凝集素标记细胞壁。</li>
 <li>在纯化合子的前一天，分别接种 5 ml 的两种细胞类型培养物，并在 23 °C 下振荡培养过夜，使其 A600 不超过 1.0。将 GFP 转化子（ATY4442）培养于含 2% 葡萄糖的完全合成培养基（CSM-葡萄糖）中，RPL25-mCherry 转化子（ATY4552）培养于缺乏尿嘧啶的合成选择性培养基中10。同时在室温下振荡培养每种细胞类型的平行培养物。</li>
</ol>
2. 进行杂交
<ol>
 <li>用新鲜培养基将各样品的光密度（A600）调整至1.0。[1个光密度单位 ~ 3 × 107 个细胞/ml]</li>
 <li>取等体积的两种培养物混合，短暂涡旋振荡3次，随后进行一次较长时间的涡旋振荡，持续10秒。</li>
 <li>制备CSM-葡萄糖平板。这些平板与常规培养所用的平板相同，在琼脂倾注并凝固后已干燥45分钟10。</li>
 <li>将最多二十滴40 µl的混合液滴加到CSM-葡萄糖平板表面边缘1 cm处。液滴接触平板表面时立即启动计时器，记录时间。待液体完全吸收后（约30分钟），盖上平板并在室温下静置，避免扰动。</li>
</ol>
3. 收获准备
<ol>
 <li>在23 °C条件下培养1.75–2.5小时后，用150 ml冷的CSM-葡萄糖培养基反复冲洗平板上的单个干燥液滴以收获样品，操作过程中保持平板置于冰上。使用相同培养基反复冲洗液滴区域10–20次，以最大程度回收细胞。将收集液置于冰上的15 ml Falcon离心管中。</li>
 <li>将样品置于冰上，使用Fisher FB120超声破碎仪（120瓦，120伏，频率20 kHz），在60%振幅下进行10次超声处理。</li>
 <li>在相差显微镜下确认几乎无或无明显聚集体残留。此时预计有15–50%的细胞已形成合子。</li>
 <li>将细胞管垂直静置于冰上10分钟，作为进一步预防措施（以使聚集体充分沉降）。</li>
 <li>吸取上层90%的液体体积，经尼龙滤网过滤（BD Falcon聚丙烯管配滤帽，货号352235）。在典型实验中，从一个平板回收的107个细胞在此步骤被稀释至4 ml CSM-葡萄糖培养基中。</li>
</ol>
4. 流式细胞术
<ol>
 <li>使用 Sony iCyt Reflection 型号流式细胞仪（高度自动化并行分选）HAPS1 配备 100 微米喷嘴进行细胞分选。GFP 激发采用 488 nm 波长、250 毫瓦的蓝色氩离子激光器；mCherry 激发采用 561 nm 波长、100 毫瓦的激光器。尽管我们未使用过其他仪器，但我们预计配备合适激光器的 Becton Dickinson FACSAria、Becton Dickinson Influx 或 Beckman Coulter MoFlo XDP 同样适用。</li>
 <li>根据前向散射与侧向散射图设定分选参数，以圈选活细胞。建立发射光检测通道：615 ± 30 nm 带通滤光片（mCherry）对 525 ± 25 nm 带通滤光片（GFP），将事件分为四个象限：“Red+ Green-”、“Red+ Green+”、“Red- Green-”和“Red- Green+”（图 S2）。以非荧光细胞作为对照，确定“Red- Green-”象限的位置。</li>
 <li>以 21.5 psi 的鞘液压力、43,400 滴/秒的液滴频率以及 20.5 psi 的样品压力进行细胞分选。</li>
 <li>初次分选（“回收模式”）：将样品收集至预冷的 Eppendorf 管中，管内含 250 µL 冷却的 CSM-葡萄糖培养基。在冷藏微量离心机（Tomy MRX-150，15,000 rpm）中以最高速度离心 10 秒，吸除流式细胞术鞘液（含 1 mM EDTA 的 PBS，BioSure 目录号 1027）。沉淀细胞后，用 500 µL 冷却的 CSM-葡萄糖培养基重悬。</li>
 <li>第二次分选（“纯度模式”）：采用“纯度模式”选项进行分选，操作方式与初次分选相同。离心收集纯化后的细胞，将沉淀重悬于 500 µL 至 1.0 mL 的 CSM-葡萄糖培养基中。在 23 °C 条件下于 24 孔板中振荡孵育 15 分钟，以促进细胞代谢恢复。</li>
</ol>
5. DeltaVision 显微镜
<ol>
 <li>制备琼脂糖垫，步骤如下：将1.5%琼脂糖（UltraPure Agarose，Invitrogen，货号 # 15510-07）的CSM-葡萄糖悬浮液加热至沸腾，短暂涡旋混匀，然后取0.3 ml该琼脂糖溶液滴加到水平放置的标准载玻片表面，并立即用另一张载玻片覆盖（无需施加压力）。</li>
 <li>冷却10分钟后，通过水平滑动小心移除上层载玻片，注意保持表面光滑，避免扰动琼脂糖层。（移除上层载玻片后，应在1–2分钟内将细胞样品加至琼脂糖垫上。若在室温下置于湿润环境中且不移除上层载玻片，琼脂糖垫可在使用前保存长达一天。）</li>
 <li>离心收集样品，并将1 ml沉淀物分装至琼脂糖垫上（避免接触表面）。立即用一块1号盖玻片覆盖样品。用单刃剃刀片切除多余的琼脂糖。使用注射器挤出的凡士林密封样品。</li>
 <li>使用Deltavision（Applied Precision）系统配合100倍油镜物镜（无像素合并）进行成像（Olympus UPlanApo 100x/1.40；∞/0.17/FN26.5）。</li>
 <li>使用 softWoRx 5.0.0 软件（<a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a>）对z轴层扫图像进行去卷积处理，并进行最小限度的后续处理。连续的z轴平面通常以0.2–0.4微米的间隔采集。</li>
</ol>
6. 代表性结果
转化单倍体细胞中的荧光强度水平： 单倍体细胞中的荧光水平如图S1所示。在杂交前，落射荧光显微镜检测表明，几乎所有GFP转化子均呈绿色，而所有mCherry转化子（尽管荧光信号通常较弱）均呈红色。为确保用于杂交的所有细胞均具有荧光，我们选用了荧光信号最强的亚群。
产量： 初始分选后，Red+ Green+ 样本（图S2）通常包含输入细胞总数的8-20%，且含有过量的单倍体细胞，这可能是由于细胞间黏附持续存在所致。由于单次分选无法实现高度富集，应对部分纯化的样本在60%振幅下进行两次探头超声处理，随后重新分选。（回收分选通常持续1-2小时，而第二次分选仅需15分钟。）在经历第二次分选的细胞中，Red+ Green+ 样本包含了输入细胞的23-52%。
相差显微镜检查：通过相差显微镜观察显示，在21次制备样本中，最终合子制备物的纯度平均约为90%（范围为86%至91%）。污染物为绿色或红色的单倍体，或相互接触成对存在的单倍体。图3列出了无芽细胞、具有中位芽（Med）、侧位芽（Lat）或末端芽（Term）的合子所占百分比，以及同色成对单倍体（“2Same”）或异色成对单倍体（“2Hap”）的数量，还有单独存在的单倍体（Hap）数量。细胞在培养1.75小时后收获时，超过50%的细胞无芽，其余亚类（具有中位、侧位或末端芽）的比例大致相等。培养2.5小时后，四类合子（无芽、中位芽、侧位芽或末端芽）的数量大致相同。
显微镜观察（图4）：
在纯化过程中，合子的结构似乎保持不变。根据杂交时间的长短，合子群体中未出芽和已出芽的合子比例有所不同，如上所述。由于绿色和红色单倍体的荧光信号强度均存在较大差异，因此一些合子主要呈红色，而另一些则主要呈绿色，这一点通过比较图4中的单色图像与合并图像可以观察到。还需注意，GFP（分子量26 kDa）能够进入细胞核，即使在细胞核尚未融合的情况下也能在核内观察到。液泡则表现为黑色的非荧光球体。
纯化最终产物包含处于不同发育阶段的多种细胞群体。标记为A的合子尚未发生融合。B型合子无芽。C型具有一个小芽。D型具有较大的芽，而E型合子即将进行胞质分裂。还需注意，许多早期合子仍表现出一条非荧光的中部分隔线（*），且液泡“遗传结构”（I）12 常可见从合子延伸至芽体中。在某些情况下，绿色信号向伴侣细胞的再分布程度远大于红色信号，这反映了多聚核糖体转移过程中特有的延迟现象（Tartakoff，正在准备中）。
从一对5 ml的单倍体细胞对数期培养物开始，我们可获得约1-2 × 106个合子，足以进行多次采用化学发光检测方法的免疫印迹实验。采用酚-氯仿抽提法，从这些数量的细胞中可提取约1.5 mg的RNA。
由于纯化的受精卵已经冷却，在进一步分析之前，我们建议在23 °C的生长培养基中进行孵育。
<img alt="酵母细胞生命周期示意图；交配、细胞融合、二倍体芽体形成；生物学过程。" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 合子形成的时序过程。 合子作为单倍体与二倍体之间的中间阶段。该示意图展示了单倍体的经典激活（形成“shmoo”形态）、细胞融合以及初始芽体的形成过程。芽体的位置可以是中位（M）、侧位（L）或端位（T）。
<img alt="单倍体合子形成过程示意图；孵育、交配型分选、合子纯化。" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图2. 合子纯化流程示意图。 在含葡萄糖的完全培养基琼脂平板表面孵育后，通过洗涤回收细胞混合物，随后在“恢复模式”下进行初次分选，接着在“纯度模式”下进行第二次分选。黄色表示在合子中可同时观察到mCherry和GFP信号。
<img alt="早期和晚期合子阶段；柱状图；单倍体和无芽细胞频率分析。" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 纯化组分中合子的多种形态。 在交配混合物培养 1.75 小时或 2.5 小时后进行收集，以分别富集相对早期与相对更成熟的合子。每个时间点均进行了八次独立实验，以不同颜色表示。图中显示了具有空间上不同出芽模式的合子的相对数量。由于孵育时间较短（室温下不足 2.5 小时），所观察到的所有芽均为合子的初次出芽事件。
<img alt="荧光显微镜图像；酵母细胞、标记蛋白、荧光定位、细胞研究。" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 富集组分的DeltaVision检测。 使用Deltavision显微镜检查了一个典型视野。图中显示了红色和绿色双色或单色图像。红色代表多聚核糖体标记（Rpl25p-mCherry），绿色代表胞质GFP。请注意合子的高度富集，以及指定的亚细胞结构：液泡(v)、出芽(b)、细胞核(n)、液泡“遗传结构”(i)，以及分隔较早期合子中亲本区域的分界线(*)。其变化的总体颜色反映了融合单倍体相对荧光强度的差异。当两个亲本区域保持明显不同的颜色时，表明标记物（胞质GFP、mCherry标记的多聚核糖体）尚未达到平衡。正在进行的时间序列研究表明，可溶性GFP的重新分布早于多聚核糖体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
补充图注
<img alt="流式细胞术直方图；GFP、mCherry 单倍体与阴性对照荧光的比较。" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure S1"> 
图 S1. 单倍体细胞的荧光。 最左侧：检测表达 mCherry 标记多聚核糖体的细胞中的绿色信号。矩形窗口的设定旨在排除阴性细胞。中间图：分析表达细胞质 GFP 的细胞，显示明显明亮的阳性细胞主群。最右侧：分析表达 mCherry 标记多聚核糖体的细胞。该矩形（与最左侧相同）包含最亮的细胞，并可完全排除所有阴性细胞。“R2”表示位于指定矩形范围内的细胞所占百分比。
<img alt="流式细胞术散点图；回收率与纯度模式分析；细胞分选方法；荧光数据。" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 S2"> 
图 S2. 首次与第二次分选中的细胞分布。 这些双色散点图显示了右上象限（R5）中 Green+ Red+ 细胞的比例。该比例在第二次分选后上升至 52%。横轴：绿色信号。纵轴：红色信号。

<ol><li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerskowitz%2C+I+%22Control+of+cell+type+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+Mating+type+and+mating-type+interconversion%22">Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion</a>. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).</li>
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<li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+on+the+move%3A+insights+from+yeast+vacuole+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

纯化合子的获得将有助于开展包括转录组学、蛋白质组学和脂质组学在内的生化研究，以及合子细胞周期重启、细胞壁重塑、出芽和遗传特性等机制的探究。此外，也可利用在单个或双亲中携带特征性突变的菌株来生成合子。同时，与单倍体或二倍体细胞类似，纯化的合子可在含15%甘油的培养基中冷冻保存，并在后续解冻以观察其重复出芽等特性。
使用其他适用于显微镜观察的荧光标记物进行的初步实验（例如 标记的组蛋白或线粒体蛋白）无法可靠地回收合子；然而，有可能通过将单倍体细胞的细胞壁偶联红色或绿色荧光染料来实现类似的纯化。我们已避免采用此类方法，因为它们可能施加额外的应激并影响合子形成的早期阶段。

<table><tbody><tr><td>pEG220，URA3/YIp，编码细胞质GFP &lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;)</td><td>E. Grote</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAJ1661，URA3/CEN，编码与mCherry融合的RPL25</td><td>A. Johnston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher FB120超声波破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带滤帽的聚丙烯管</td><td>BD Falcon</td><td>货号 352235</td><td></td></tr><tr><td>制冷型微量离心机</td><td>Tomy</td><td>MRX-150</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术鞘液</td><td>Biosure</td><td>1027</td><td></td></tr><tr><td>iCyt Reflection型流式细胞仪</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision去卷积显微镜</td><td>Applied Precision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正置落射荧光显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>15510-07</td><td></td></tr><tr><td>CSM葡萄糖培养基&lt;br/&gt; 注：对于琼脂平板，只需添加2%琼脂（Difco）</td><td>10</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于流式细胞术的酿酒酵母（s. cerevisiae）合子纯化

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

合子是许多生物生命周期中单倍体与二倍体状态之间的重要中间阶段，包括酵母（图1）1。S. cerevisiae 的合子由不同交配型（MATa、MATα）的单倍体细胞融合形成，并通过其显著不对称的有丝分裂，产生相应的稳定二倍体，继而可连续生成多达20个二倍体后代2。合子的形成由一系列复杂事件协调完成：在此过程中，可溶性交配因子与相应的受体结合，触发受体介导的信号级联反应，从而导致细胞周期中断，并最终实现细胞-细胞融合。合子可作为前体细胞或干细胞功能的模型。
尽管关于合子形成的研究已取得诸多进展，并且合子已被用于探讨具有普遍意义的细胞与分子生物学问题，但几乎所有的研究都使用了合子与大量单倍体细胞混合的交配体系3-8。因此，合子形成及其后续生命过程中的许多生化特性仍尚未得到深入研究。
已有文献报道基于酵母合子沉降特性的纯化方法9；然而，我们在实验中采用该基于沉降的方案未能获得接近90%的纯度。此外，该方法存在细胞暴露于高渗山梨醇环境的缺点。因此，我们开发了一种通用的纯化流程。具体而言，将表达红色或绿色荧光蛋白的单倍体细胞配对共孵育，以诱导合子形成，在不同时间点收集细胞，并利用基于流式细胞术的分选方案对所获得的合子进行纯化。该技术可直观地评估合子纯度及成熟程度，所得组分的平均纯度约为90%。根据收获时间的不同，可获得不同成熟阶段的合子。纯化后的样品可作为开展“组学”研究、获取初始子代细胞以及系统分析此类前体细胞的理想起始材料。

为了纯化酿酒酵母（S. cerevisiae）的合子，将具有相反交配型的单倍体细胞分别改造为表达红色或绿色荧光蛋白，共孵育以促进合子形成，随后采用基于流式细胞术的分选方案进行分离。所得高度富集的合子组分可用于后续的“组学”研究、初始子代的回收，以及合子形态发生的系统性分析。

基于流式细胞术的酿酒酵母（S. cerevisiae）合子纯化

合子是包括酵母在内的许多生物生命周期中单倍体与二倍体状态之间的重要中间阶段（图1）1。S. cerevisiae ...

以下实验的总体目标是获得纯化的酵母合子群体。首先在交配类型相反的单倍体细胞中表达细胞质GFP或M cherry标记的多聚区，将细胞培养至对数生长期，然后混合并共同孵育，以促进合子的形成。随后收获交配混合物，并以恢复模式通过流式细胞术分选，以分离出红色和绿色双阳性细胞。该亚群包含受精前和受精后的实体。为进一步纯化样品，将红色和绿色双阳性群体进行第二轮流式分选。采用纯度模式。通过荧光显微镜对细胞进行可视化观察和定量分析，该方法获得的受精卵平均纯度为90%。与现有方法（如基于沉降的纯化）相比，该技术具有以下优势。首先，该技术可对合子的纯度和成熟度进行便捷的可视化评估。其次，据我们实验结果显示，合子组分的平均纯度约为90%，远高于现有方法。我们的纯化方法有助于在分子水平上回答有关真核细胞中单倍体向二倍体转变的关键生物学问题，因为在低等与高等真核生物之间存在较高的保守性。因此，研究酵母合子有助于全面理解合子生物学。可以说，合子也可作为祖细胞或干细胞功能的模型。培养酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株 BY4741（MATa 和 MATα）。通过将冻存的酵母菌株划线接种于固体琼脂培养基上，于室温或30°C培养至前一日形成菌落，以备合子纯化。标记两个50毫升锥形管，用于培养转化后的酵母细胞，分别对应表达可溶性GFP和RPL25-MCherry的菌株。其中一个培养物接种表达细胞质可溶性GFP的转化酵母细胞，另一个接种表达单一核糖体蛋白RPL25-MCherry的转化酵母细胞。RPL 25 与 mCherry 融合。在 23 摄氏度下振荡培养过夜，使菌液 A 600 值达到不超过 1.0。接下来进行杂交实验时，首先用新鲜培养基将每个样品的光密度调整至 1.0，浓度约为每毫升 3 × 10⁷ 个细胞。接下来，将两种培养物等体积混合于新鲜培养基中，置于50毫升锥形管内。短暂涡旋振荡三次，然后持续涡旋振荡10秒。使用移液器吸头时，应将其置于距离室温环境液面1厘米上方的位置。温度CSM葡萄糖平板。启动一个计时器，从30分钟开始倒计时，并立即在平板边缘沿圆周均匀分配40微升的混合培养物液滴。将平板开盖放置在实验台面上，静置干燥约30分钟。液体吸收后，盖上培养皿，并在室温下静置 1.75 至 2.5 小时。极性生长过程会形成特征性的 schmo 样形态。在 schmo 期，两个 haid 细胞持续相互生长，直至实现细胞间接触。随后的细胞融合形成合子。新生的合子重新进入有丝分裂细胞周期，产生其第一个二倍体芽体。孵育后，将培养板置于冰上，用150微升冷的CSM葡萄糖溶液对各个干燥液滴区域冲洗10至20次，收集样品。将洗涤液收集到预冷的15毫升锥形管中，并置于冰上。接下来，保持样品在冰上，对每根管进行探头超声处理，60%的振幅下超声10次。超声后，在相差显微镜下确认仅存少量或无细胞聚集体，预计15%至50%的细胞已形成合子。此时，将细胞管垂直静置于冰上，避免扰动，静置10分钟，以确保任何残留的聚集体充分沉降。收集上层最多90%的体积，并通过带有滤网帽的尼龙网聚丙烯管进行过滤。在典型实验中，从一个培养板和四毫升CSM中可回收约10的7次方个细胞。葡萄糖细胞分选使用配备HAPS一型装置和100微米喷嘴的索尼Eyesight Reflection型流式细胞仪进行。首先在 win list 3D 软件中选择用于 GFP 激发的激发激光器。使用 488 纳米波长的蓝色 Argonne 离子 500 毫瓦激光器进行 M cherry 激发，使用 HAPS 控制软件中 561 纳米波长的 100 毫瓦激光器。确保选择恢复模式，分选时鞘液压力设定为 21.5 磅/平方英寸，液滴频率为每秒 43,400 个液滴，样品压力为 20.5 磅/平方英寸。根据前向散射与后向散射的散点图设置分选参数，以圈选活细胞。需注意，此处使用的 Sony ISELLE 仪器将侧向散射图显示为后向散射，但该后向散射在功能上等同于侧向散射。建立 M cherry 与 GFP 的发射荧光散点图，将事件分为四个象限。红色，绿色阳性，红色阴性绿色阳性，红色阳性绿色阴性，以及红色阴性绿色阳性。使用无荧光的细胞作为标准，以确定红色阴性绿色阴性象限。用于初次分选。选择恢复模式，将样品收集到预冷的微量离心管中，每管含有250毫升冷的CSM葡萄糖溶液。收集完成后，在预冷的微量离心机中以最高速度离心10秒，离心结束后吸除上清液，并将细胞重悬于500微升冷的CSM葡萄糖溶液中。由于单次分选无法实现高纯度富集，需对部分纯化的样品进行短暂探头超声处理，以60%的振幅处理两次。再次分选细胞，此次使用活细胞的纯度模式选项门控，并建立M樱桃红荧光蛋白（M cherry）与绿色荧光蛋白（GFP）沉淀的发射图谱。收集纯化后的细胞，将沉淀物重悬于0.5至1.0毫升的CSM葡萄糖培养基中。离心后，将0.5毫升菌液转移至24孔板的各个孔中，随后振荡培养15分钟。在24孔板中于23摄氏度下孵育，以允许代谢恢复。制备琼脂垫时，将含有1.5%琼脂糖的CSM葡萄糖溶液在15毫升锥形管中加热至沸腾。短暂涡旋混匀后，立即取0.3毫升该琼脂糖溶液滴加至至少两到三个标准载玻片表面，并用另一张载玻片迅速覆盖。不要施加压力。让载玻片冷却10分钟。如果暂时不立即使用aeros垫片，请将它们连同上层载玻片一起置于室温下的湿化 chamber 中保存。这些可保存长达一天。然后通过水平滑动轻轻移除上层载玻片，注意留下光滑的表面，并在一分到两分钟内迅速将沉淀细胞的一微升等分试样滴加到 aros 垫上，注意不要触碰表面，以免扰动 aros 层。立即用方形盖玻片覆盖样品，并使用单边剃须刀片修剪多余琼脂。使用注射器沿盖玻片边缘涂抹凡士林以封固。采用Delta Vision系统，配合100倍油镜物镜（无像素合并）进行成像。理想的视野应显示为单层细胞，细胞间有足够间距以便区分单个细胞，以0.2至0.4微米的间隔进行图像采集。成像完成后，使用 soft works 5.0 0.0 程序对 Zacks 进行去卷积处理，并采用 20 个循环的标准反卷积进行最小化处理。调整红色与绿色荧光的强度，以最小化 DeVol 图像中的任何背景信号，从而评估转化细胞中荧光蛋白的表达。在进行杂交前和杂交后，通过流式细胞术分析细胞。基本上，所有 M cherry 转化子均呈红色，所有 GFP 转化子均呈绿色。需要注意的是，尽管 mCherry 信号强度弱于 GFP 信号，但流式细胞术和荧光显微镜均能检测到该信号。细胞经过分选后，选择位于 R2 象限中最亮的细胞，并与 GFP 转化细胞共同培养 2.5 小时，如图所示。杂交后，红绿双阳性样本占总群体的 8.89%。经过第一次回收分选后，纯度提高至52.4%，随后在第二次纯度分选中进一步富集，当通过相差显微镜检查21个类似的红色阳性绿色阳性细胞样本时，平均纯度达到90%。污染物为绿色或红色的单倍体细胞，或相互接触的单倍体细胞对，用于分析合子初期芽体出现的动力学特征，以及合子芽体在侧向、中位和末端位置的发生频率与分布情况。单倍体细胞分别交配1.75小时或2.5小时后，通过流式细胞术分选，并经落射荧光显微镜观察。当细胞在培养1.75小时后收获时，超过50%的细胞为未出芽且芽位于中部。在培养2.5小时后，侧生芽和末端芽的数量大致相等。然而，在四个类别中，每类的合子数量大致相同，即未出芽且芽位于中部、侧部或末端的合子数量相近。在纯化过程中，合子的结构似乎保持不变。请注意，GFP会进入细胞核，即使在细胞核尚未融合的情况下，仍可在细胞核内观察到。ES表现为黑色的非荧光球体。纯化过程的最终产物包含处于不同发育阶段的多种群体。标记为 A 的受精卵尚未发生融合。B 型受精卵未受精。C型具有较小的芽体，D型具有较大的芽体，而E型合子即将进行胞质分裂；还需注意，许多较早期的合子仍表现出非荧光性的中部分裂线，且通常可见瓦拉遗传结构从合子延伸至芽体中。在进行该操作时，必须包括恢复性分选以及后续的纯度分选。我们发现，第二次分选对于提高最终产物中合子的纯度至关重要。观看本视频后，您应充分了解如何通过流式细胞术进行杂交以获得纯化的合子，如何利用显微镜方法评估其纯度，以及如何使用荧光去卷积显微镜对合子进行封片和拍照。

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生物学

流式细胞仪分离纯化<em&gt; S.酵母</em&gt;合子

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