Name: 原位膀胱肿瘤模型和评价治疗膀胱萨纳 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 了解原位膀胱肿瘤模型建立方法，使用免疫缺陷小鼠评估saRNA治疗效果，并通过超声和生物发光成像监测肿瘤生长。该技术为膀胱癌研究提供可靠工具。

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本研究由AACR Henry Shepard膀胱癌研究基金（09-60-30-LI）资助。

涉及动物受试者的实验程序已获得加利福尼亚大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 细胞制备
<ol>
 <li> 人膀胱癌细胞系 KU-7-luc2-GFP（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA）在添加了10%胎牛血清和50 μg/ml 庆大霉素的 RPMI-1640 培养基中培养。</li>
 <li> 细胞培养条件为 37 °C、5% CO2，每两到三天更换一次培养基。</li>
 <li> 通过胰蛋白酶消化收集细胞，并使用血细胞计数板进行计数。将 2 × 106 个细胞重悬于 50 μl 磷酸盐缓冲液中，制成单细胞悬液，并置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 原位膀胱肿瘤模型
<ol>
 <li> 使用8-10周龄的雌性裸鼠（nu/nu）（Simonsen Laboratory，Gilory，CA）。</li>
 <li> 在加热垫上覆盖无菌手术巾作为手术平台。准备无菌润滑胶、带针芯的24号导管、硝酸银溶液和无菌水。</li>
 <li> 通过吸入异氟烷（诱导浓度3%，维持浓度1-2%）对小鼠实施全身麻醉，并通过鼻罩持续维持麻醉。将无菌眼膏涂抹于动物眼部，并使用加热垫维持体温。</li>
 <li> 将小鼠置于仰卧位。</li>
 <li> 用镊子轻轻夹住动物的外阴部以固定。</li>
 <li> 使用已移除针芯的24号静脉导管插入小鼠尿道。应充分使用润滑剂。小鼠仰卧时，尿道位于阴唇皱襞后方、阴道前方。初始插入角度为45度，以便进入尿道并穿过耻骨下缘；随后改为较平缓的角度，继续推进进入膀胱。轻柔地施加骨盆压力以拉直尿道常有助于插管。操作时需注意避免在遇到阻力时过度推进，以防造成尿道或膀胱穿孔。当导管内观察到尿液时，可确认导管已位于膀胱腔内。</li>
 <li> 使用针芯从导管及膀胱腔内抽吸尿液。后续所有抽吸和注射操作均使用同一针芯，保留导管在原位。此方法可通过消除导管内部的死腔来确保注入体积的准确性，并避免重复插管。</li>
 <li> 为破坏膀胱尿路上皮的糖胺聚糖层，注入10 μL 0.5 M硝酸银溶液，并保留10秒。该溶液可能与残留尿液形成白色沉淀。</li>
 <li> 使用针芯抽吸并弃去沉淀物及膀胱内容物。</li>
 <li> 注入100 μL无菌水冲洗膀胱，随后抽吸并弃去冲洗液。重复此无菌水冲洗共3次，总计完成4次冲洗。</li>
 <li> 在尿道口周围结扎一道4-0丝线，以闭塞尿道，为拔除导管做准备。</li>
 <li> 使用针芯注入预先配制的50 μL含2 × 106 KU-7-luc2-GFP细胞的悬液。</li>
 <li> 同时拔出导管和针芯，使尿道保持被丝线闭塞状态。</li>
 <li> 小鼠将在全身麻醉下维持2小时，之后移除丝线并让动物苏醒。</li>
</ol>
3. 超声
<ol>
 <li> 使用异氟烷蒸汽诱导全身麻醉，并通过鼻罩维持麻醉状态。</li>
 <li> 采用 VisualSonics Vevo 770 In Vivo 高分辨率微成像系统（VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada），配备 RMV-704 40 MHz 探头。</li>
 <li> 将小鼠仰卧位固定于超声平台。</li>
 <li> 用胶带固定动物的后肢，以避免操作超声探头过程中产生过多移动。</li>
 <li> 在小鼠骨盆区域涂抹超声耦合凝胶。</li>
 <li> 将 RMV-704（40 MHz）超声探头置于小鼠骨盆部位，获取横断面或纵切面图像。</li>
 <li> 若发现肿瘤，可保存图像用于测量肿瘤尺寸。</li>
</ol>
4. 生物发光成像
<ol>
 <li> 腹腔注射 200 μL（150 mg/kg）荧光素底物。 </li>
 <li> 使用气化异氟烷诱导全身麻醉，并通过鼻罩维持麻醉状态。 </li>
 <li> 将小鼠仰卧放置于生物发光成像仪中。 </li>
 <li> 在注射荧光素后 5 分钟，以每秒光子数为单位测量动物的生物发光信号。 </li>
</ol>
5. saRNA 制备
<ol>
 <li> 以 50-100 μmol 的规模合成 RNA 寡核苷酸。 </li>
 <li> 将互补的单链寡核苷酸退火形成双链 saRNA。 </li>
 <li> 采用之前所述的自发囊泡形成制剂方法1，使用可电离脂质 1,2-二油酰基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环（DLinKC2-DMA）、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、胆固醇和 PEG–DMG 制备脂质纳米颗粒（LNP）-saRNA。 </li>
</ol>
6. 膀胱内灌注给药配方化的saRNA
<ol>
 <li> 建立原位膀胱肿瘤模型后，小鼠通过膀胱内灌注方式接受脂质纳米颗粒（LNP）配制的小激活RNA（saRNA）治疗（表1）。 </li>
 <li> 使用气化异氟烷建立并维持全身麻醉，并涂抹无菌眼用润滑剂。</li>
 <li> 将动物置于仰卧位。 </li>
 <li> 按先前所述方法进行尿道插管。 </li>
 <li> 在尿道和导管周围放置一根4-0丝线结扎线。 </li>
 <li> 使用空注射器和芯针抽吸导管及膀胱内的全部尿液。 </li>
 <li> 膀胱内注射LNP-saRNA，总体积为50 μL（3 mg/kg）。同时移除导管和芯针，保留丝线结扎以闭塞尿道。</li>
 <li> 小鼠将在尿道闭塞状态下持续麻醉2小时。 </li>
 <li> 膀胱内注射LNP-saRNA治疗于肿瘤植入后第4天开始，每隔3天连续给药，共进行14次治疗。</li>
</ol>
7. 代表性结果
源自 KU-7-luc2-GFP 细胞的膀胱肿瘤可通过荧光素酶生物发光成像（图 1A 和 C）和膀胱超声（图 1B 和 D）进行监测。肿瘤通常在细胞接种后 3–5 天内即可被检测到。我们发现，超过 90% 的小鼠成功建立了膀胱肿瘤模型。随着膀胱内给予双链 RNA（dsRNA）治疗的进行，可利用上述方法监测肿瘤的进展。动物处死后，还可通过 GFP 荧光确认肿瘤生长情况。总体而言，膀胱肿瘤的平均生物发光信号与平均超声测量尺寸呈良好相关性，如 图 1C 和 1D 所示。然而，在动物处死后通过 GFP 确认肿瘤存在的情况下，我们发现生物发光信号与存活肿瘤的存在相关性优于超声测量结果。这一差异在接受 saRNA 治疗的小鼠（相对于对照组）中尤为明显，因为治疗后小鼠体内的残余瘢痕组织常可在超声中被观察到，但无法与存活肿瘤区分开来。
<img src="/files/ftp_upload/4207/4207fig1.jpg" alt="Bioluminescence assay and ultrasound imaging of tumor growth; includes graphs of intensity over time." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 膀胱肿瘤的生长动力学。（A）生物发光成像通过检测膀胱肿瘤内荧光素酶活性，以确认肿瘤的位置和生长情况。（B） 在体 使用40 MHz探头进行膀胱超声成像可获得可准确测量尺寸的肿瘤图像。（C）显示肿瘤生物发光信号及超声测量尺寸逐步增加的图表。数据表示6只动物的平均值（±标准差）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4207/4207fig1large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.

<ol><li>Semple, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+cationic+lipids+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.</a> Nature. 28, 172-176 (2010).</li>
<li>Li, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+dsRNAs+induce+transcriptional+activation+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+effect+of+dsRNA-induced+p21%28WAF1%2FCIP1%29+gene+activation+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells.</a> Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).</li>
<li>Chancellor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+results+of+myoblast+injection+into+the+urethra+and+bladder+wall%3A+a+possible+method+for+the+treatment+of+stress+urinary+incontinence+and+impaired+detrusor+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+urodynamics%22%5BJournal%5D)">Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility.</a> Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).</li>
<li>Hadaschik, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+international%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU international. 100, 1377-1384 (2007).</li>
<li>Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bladder+Wall+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Bladder Wall Injection.</a> J. Vis. Exp. (53), e2523(2011).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Model+of+Murine+Bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Model of Murine Bladder.</a> Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535(2011).</li>
<li>Dinney, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+urology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).</li>
</ol>

L.C.L. 是与 saRNA 相关的待审批专利申请的命名发明人，这些专利申请由加利福尼亚大学旧金山分校提交，并已授权给 Alnylam Pharmaceuticals。

我们介绍一种建立小鼠原位异种移植膀胱肿瘤模型的方案，随后通过膀胱内给予靶向p21CIP1/WAF1（p21）启动子以实现转录激活的LNP配制saRNA对肿瘤进行治疗2, 3。所形成的肿瘤可通过生物发光成像和膀胱超声进行确认与监测。相较于腹腔内、皮下或静脉内模型，原位模型可提供更接近内源性膀胱癌的尿液环境与尿路上皮微环境，因而更具优势。已有多种小鼠原位膀胱肿瘤模型被建立，方法包括直接膀胱壁注射以及膀胱内灌注4-8。如本研究所示，采用膀胱内灌注接种肿瘤细胞的方法更贴近人类膀胱肿瘤的发生过程——肿瘤起始于黏膜上皮表层，并随进展逐渐向深层浸润。我们采用硝酸银处理膀胱以促进肿瘤接种的方法成本低廉且技术简便。
Hadaschik 等 描述了小鼠膀胱内灌注膀胱肿瘤的方法，并报道了可靠的生物发光肿瘤评估技术。5 我们同样发现，通过导管插入和细胞灌注，肿瘤移植成功率较高。我们的肿瘤不仅通过生物发光得以确认，还通过 体内 膀胱超声，为量化肿瘤进展提供了一种额外方法。
<...

<table><tbody><tr><td>KU-7-luc-GFP 细胞</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>128091</td><td></td></tr><tr><td>胸腺裸鼠（nu/nu）</td><td>Simonsen Laboratories</td><td>6-7 周龄</td><td>Sim:(NCr) nu/nu fisol</td></tr><tr><td>超声成像仪</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>Vevo 770</td><td>RMV-704 探头</td></tr><tr><td>生物发光成像仪</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>IVIS Spectrum</td><td> </td></tr><tr><td>Exel safelet 导管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G X &amp;#190;&quot;</td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8157</td><td> </td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>80301</td><td> </td></tr><tr><td>LNP-saRNA</td><td>Alnylam Pharmaceuticals</td><td></td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1. &lt;/strong&gt; 特异性试剂与仪器设备。</td></tr></tbody></table>

一种膀胱原位肿瘤模型及膀胱内注射sarna治疗的评价

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

我们介绍一种在原位异种移植小鼠膀胱肿瘤模型中通过膀胱内给药小激活RNA（saRNA）治疗膀胱癌的新方法。该小鼠模型通过在吸入全身麻醉下经尿道插管建立。随后使用膀胱内灌注硝酸银溶液对膀胱黏膜造成化学灼伤，以破坏膀胱糖胺聚糖层，促进细胞黏附。经无菌水多次冲洗后，将人膀胱癌KU-7-luc2-GFP细胞通过导管注入膀胱内，留置2小时。随后通过 体内 膀胱超声与生物发光成像。随后通过膀胱内灌注方式给予装载于脂质纳米颗粒（LNPs）中的saRNA进行治疗。肿瘤生长情况通过超声和生物发光进行监测。本视频中展示了该操作流程的全部步骤。

建立原位膀胱肿瘤模型，以评估经膀胱内递送的saRNA的抗肿瘤效果，并通过超声和生物发光成像监测肿瘤生长。

一种膀胱原位肿瘤模型及膀胱内注射saRNA治疗的评价

我们提出一种利用经膀胱内给药的小激活RNA（saRNA）治疗原位移植小鼠膀胱癌的新方法……

我们介绍一种在免疫缺陷小鼠中建立原位膀胱肿瘤模型的方法。通过血管内递送小片段双链RNA治疗这些肿瘤，并利用膀胱超声和生物发光成像对肿瘤进行监测。使用气化异氟烷进行全身麻醉，并涂抹无菌眼膏。然后将小鼠置于仰卧位，并通过鼻罩持续给予异氟烷以维持麻醉状态。接下来，需对小鼠进行插管。我们使用24号静脉留置针，移除针芯后备用。导管插入往往是实验方案中最困难且最不可预测的步骤。使用足量的KY润滑剂并采用正确的技术是成功插管的关键。图中显示的是小鼠外阴区域。尿道位于外阴皱襞的下方。润滑后，使用导尿钳轻轻夹住并固定外阴和尿道。最初以较陡的45度角插入尿道，但一旦进入尿道后，便调整为更平缓的角度，以顺利进入膀胱。我们将在此展示该过程。再次强调，轻柔地施加骨盆压力以伸直尿道通常会有所帮助，但必须注意避免在遇到阻力时用力过猛，因为这可能导致尿道或膀胱穿孔。此处导管中观察到的尿液证实导管已位于膀胱腔内。随后用导丝针抽出导管内的尿液，导管则保留在原位。导管应有约五毫米保留在尿道外，以确保导管尖端位于膀胱腔内，而非紧贴膀胱壁。若导管插入过深，其尖端可能嵌入膀胱壁，从而阻碍注射。对于所有后续注射，将装有液体的注射器通过套管插入导引针中。这样可以通过消除套管内部的死腔来精确注入指定体积的液体，同时避免了重复插管以造成膀胱壁烧伤损伤的需要。注入10微升0.5摩尔的硝酸银，并保留10秒。硝酸银可与膀胱内残留的尿液形成白色沉淀物。将该沉淀物及任何剩余溶液从导管中清除。随后，我们用 100 微升无菌水冲洗膀胱，每次冲洗后从导管腔内移除液体，共冲洗四次。第一次冲洗后，导管内仍可见白色沉淀，但随着冲洗次数增加，液体将逐渐变得澄清。使用 4-0 丝线结扎以闭塞尿道，此时即可准备注射癌细胞。将细胞装入连接在穿刺针上的注射器中，并将细胞注入膀胱。随后移除导管，结扎尿道的绳线在小鼠处于麻醉状态下保留两小时。在预设的时间间隔内，监测肿瘤的进展。通过活体生物发光成像，首先对小鼠进行腹腔注射 Lucifer 及其底物。在使用气化异氟烷建立全身麻醉后，将小鼠仰卧位放置于 ivus 仪器内。生物发光信号以每秒光子数（photons per second）为单位进行测量。小鼠膀胱内 KU-7 细胞的存在清晰可见，且其生物发光强度可随时间进行追踪。膀胱肿瘤的存在及进展亦可通过超声成像进行监测。在使用异氟烷气体诱导全身麻醉后，需涂抹无菌眼膏。将小鼠仰卧位放置在超声检查台上。通过鼻罩给予异氟烷以维持麻醉状态。可将小鼠的后肢固定在检查台上，以避免在操作超声探头时身体过度移动。完成上述操作后，在动物骨盆中线部位涂抹超声耦合剂。涂抹耦合剂后，将一个40兆赫的探头固定在支架装置上，并缓慢放低至动物体表。膀胱在超声下清晰可见，表现为中线处圆形的低回声结构。如果动物在麻醉前未出现明显刺激症状，膀胱通常已经处于扩张状态，我们发现无需对小鼠进行导尿即可实现膀胱扩张。此处可获取横断面和纵断面图像。肿瘤在膀胱腔内清晰可见。如果发现肿瘤，可保存图像以测量肿瘤尺寸。在膀胱肿瘤建立后，将小段双链RNA与脂质纳米颗粒配制后进行小鼠膀胱内治疗。实施全身麻醉，并再次涂抹眼用软膏。然后将小鼠置于仰卧位，并进行尿道插管。如我们先前所述，使用4-0丝线缝合线在导管周围结扎尿道以阻断尿液流出。通常，按图中所示方式打两个结。将空注射器连接至套管针，用于完全排空膀胱。向膀胱内灌注50微升小双链RNA，总剂量为每千克体重3毫克。随后移除针头和导管。小鼠将在尿道闭塞的情况下持续麻醉总共两个小时。观看本视频后，您应充分理解一种建立原位小鼠膀胱肿瘤模型的方法，该方法可通过生物发光成像和超声技术监测肿瘤，并通过膀胱内给药递送小RNA治疗肿瘤。该技术存在一些细微之处，需要一定练习才能掌握，尤其是导尿操作环节，但总体而言，这是一项易于重复的实验方案。我们在将膀胱肿瘤移植到小鼠体内方面已取得良好效果，使用小RNA的治疗效果也非常有前景。然而，本实验方案最令人兴奋之处在于，尽管我们使用小RNA对小鼠进行了治疗，但相同的技术也可用于测试任何膀胱癌的膀胱内治疗方案。I.

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关键词：正位肿瘤模型，膀胱肿瘤，小鼠模型，膀胱内灌注，癌细胞植入

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