Name: 一种新的手术方法气管内注射生物活性剂在胎鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 了解一种新型胎鼠气管内注射手术技术，通过子宫切开术暴露胎头并直接注入生物活性剂，有效避免羊膜腔注射导致的药物稀释问题，显著提高荧光分子和病毒载体向胎儿肺部的递送效率。

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M.C. 和 A.V.d.P. 是由佛兰德斯科学与技术发展创新促进研究所（IWT-Vlaanderen）资助的博士研究员。J.T. 持有鲁汶大学医院（UZ Leuven）的兼职临床研究奖学金（KOOR）。D.V. 是由鲁汶大学（KU Leuven）资助的博士研究员，项目编号 DBOF/10/062。M.M.d.C. 是由巴西国家研究与发展委员会（Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento，CNPq）和伊拉斯谟世界计划（Erasmus Mundus）资助的博士研究员。本研究由佛兰德斯科学与技术发展创新促进研究所（IWT-Vlaanderen）、欧盟 DIMI 项目资助（EC grant DIMI，LSHB-CT-2005-512146）以及鲁汶大学（KU Leuven）的活体分子影像研究组（In vivo Molecular Imaging Research group，IMIR）资助。我们谨向由 James M. Wilson 创立的宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室（UPenn Vector Core）致谢，感谢他们慷慨提供用于重组腺相关病毒载体（rAAV）生产的 AAV6.2 包装质粒。

<ol><li>Willson, D. F., Notter, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+exogenous+surfactant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Care%22%5BJournal%5D)">The future of exogenous surfactant therapy.</a> Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).</li>
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<li>Thebaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+gene+therapy+increases+survival%2C+promotes+lung+angiogenesis%2C+and+prevents+alveolar+damage+in+hyperoxia-induced+lung+injury%3A+evidence+that+angiogenesis+participates+in+alveolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization.</a> Circulation. 112, 2477-2486 (2005).</li>
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<li>Henriques-Coelho, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+transfer+to+fetal+rat+lung+interstitium+by+ultrasound-guided+intrapulmonary+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection.</a> Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).</li>
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<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+phenotypic+correction+of+hemophilia+B+in+immunocompetent+mice+by+prenatal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy.</a> Blood. 104, 2714-2721 (2004).</li>
<li>Senoo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+in+utero+gene+transfer+in+mice+and+guinea+pigs%3A+tissue+distribution+of+recombinant+adenovirus+determined+by+quantitative+TaqMan-polymerase+chain+reaction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Metab%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay.</a> Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).</li>
<li>Carlon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+mouse+lung+by+fetal+intratracheal+injection+of+rAAV2%2F6.2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2.</a> Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Schmiedl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+injury+is+more+pronounced+in+fetal+transgenic+ErbB4-deleted+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).</li>
<li>Buckley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+adenovirus-mediated+airway+transduction+in+fetal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice.</a> Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

关键步骤
 <ul>
 <li>我们选择使用的实验小鼠品系为NMRI小鼠，因为其产仔数较多（平均每窝14.4 ± 1.8只，本实验室数据），对干预操作耐受性良好，且具有优良的母性特征。</li>
 <li>将荷包缝线穿过子宫壁和胎膜是关键步骤，因为仅需暴露胎儿头部而不能暴露肩部，否则在不造成创伤的情况下几乎无法重新调整位置。</li>
 <li>胎儿头部充分后仰至理想位置至关重要，以便在气管正上方准确进行切口，从而避开与气管平行走行的大血管（颈静脉）。</li>
 <li>在手术显微镜下直观地观察针头插入胎儿气管的过程非常重要，以避免注射位置错误。</li>
 <li>将胎儿头部无创地复位回子宫囊内十分关键，因为必须避免损伤胎儿头部，否则会增加宫内或出生后的死亡率。</li>
 <li>母鼠仅在剖宫产时间点通过颈椎脱位处死，而非最初使用CO2窒息法，因为后者会对胎儿的存活能力产生不利影响。</li>
 <li>交叉哺育可显著提高经处理胎儿的存活率；据我们观察，手术操作后的胎儿若经自然阴道分娩，其存活率仅为18.6±16.9%，而未注射的对照组仔鼠存活率为62±14...

<table><tbody><tr><td>NMRI 小鼠</td><td>Janvier，法国勒热内圣伊勒</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Isoba，Intervet / Schering-Plough Animal Health，英国米尔顿凯恩斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Ethicon，比利时格罗特比哈尔登</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 5-0</td><td>Ethicon，比利时格罗特比哈尔登</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;l 汉密尔顿玻璃注射器，型号 1710.5 TLLX SYR</td><td>Hamilton，美国内华达州里诺</td><td>5495-20</td><td></td></tr><tr><td>30G 锐利针头</td><td>Hamilton，美国内华达州里诺</td><td>7762-03</td><td></td></tr><tr><td>2% 利多卡因</td><td>AstraZeneca，荷兰佐特梅尔</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种在胎鼠模型中进行气管内给予生物活性物质的新型外科手术方法

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

产前肺部递送细胞、基因或药理学制剂可能为多种遗传性和获得性疾病的治疗提供新策略。除需要外源基因长期表达的先天性或遗传性疾病外，一些非遗传性的围产期疾病仅需短期基因表达或药物干预即可达到治疗效果，因此也被视为此类方法潜在的未来适应证。适合短期产前治疗的候选疾病包括由表面活性蛋白B transient缺乏引起的新生儿呼吸窘迫综合征1,2，以及新生儿肺部的高氧损伤3。适合永久性治疗纠正的疾病则包括囊性纤维化（CF）4、表面活性物质缺乏的遗传变异型5以及α1-抗胰蛋白酶缺乏症6。
通常，产前基因治疗的一个重要优势是能够在个体发育的早期，甚至在临床症状出现之前就启动治疗干预，从而防止对个体造成不可逆的损伤。此外，与成体器官相比，胎儿器官的细胞增殖速率更高，这可能有助于更高效地将基因或干细胞导入胎儿体内。 Furthermore，in utero 基因递送是在个体的免疫系统尚未完全成熟时进行的。因此，移植异源细胞或用正常版本补充功能缺陷或缺失的蛋白质，应不会引起针对细胞、载体或转基因产物的免疫致敏，这一点最近已在细胞治疗和基因治疗中得到证实7。
在本研究中，我们探讨了在小鼠模型中直接靶向胎儿气管的可能性。该操作已在较大的动物模型（如兔和羊）8以及临床环境中9得到应用，但迄今为止尚未在小鼠模型中实施过。在研究囊性纤维化（CF）等遗传性疾病的胎儿基因治疗潜力时，小鼠模型作为概念验证的首选工具具有重要价值，原因在于其拥有多种可获得的转基因小鼠品系、胚胎发生与胎儿发育过程记录详尽、伦理限制较宽松、妊娠周期短且每胎产仔数量多。
已有多种不同的介入途径用于靶向胎儿啮齿类动物的肺部，包括羊膜内注射10-12、（超声引导下的）肺内注射13,14，以及向卵黄囊血管15,16或脐静脉17进行静脉给药。我们提出的新型外科手术方法可使研究人员将目标物质直接注射至胎鼠气管内，相较于现有技术，该方法可更高效地将物质递送至气道18。

我们开发了一种新型手术方法，用于将生物活性物质直接注入小鼠胎儿的气管。与常用的羊膜内注射相比，该递送途径在靶向胎儿小鼠肺组织方面效率更高。迄今为止，该操作程序尚未在小鼠模型中报道过。

产前肺部递送细胞、基因或药理学制剂可能为多种遗传性和...

以下实验的总体目标是能够将选定的试剂直接注入胎鼠气管，从而实现比现有技术更高效地将试剂递送至气道。该方法通过子宫切开术将胎鼠头部外置，进而接触胎鼠气管。随后，作垂直颈部切口以暴露气管，并在直视引导下插入针头。然后将荧光微球或病毒载体注入气管，以高效地将目标物质递送至胎儿气道。对经处理肺组织切片的显微分析显示，与最常用的羊膜内递送途径相比，气管内注射能更有效地将荧光分子或病毒载体递送至胎儿气道。与现有的胎儿羊膜腔注射等方法相比，该技术的主要优势在于避免了注射物质在羊水中的稀释。这可以最大化颗粒物在胎鼠肺部的作用效果。通常，初次接触该技术的研究人员会发现，完成一次完美的气管内注射极具挑战性。这是因为胎鼠的气管极为脆弱，很容易被刺穿。进行此操作时，您将执行气管注射，从而无法准确靶向胎儿肺部。但与往常一样，熟能生巧。为准备气管内（intra-tracheal）或 it 注射，需使用妊娠且经 MRI 检测的小鼠，确保其在手术前及手术时已妊娠 18 天。小鼠饲养在带有滤膜盖的笼子中，环境为正常室温与正常光照条件，并可自由获取水和饲料。使用异氟烷麻醉小鼠后，将其置于37°C的加热垫上以维持体温，并通过脚趾夹捏试验检测麻醉深度。用聚维酮碘对腹部进行消毒，行正中腹切口以暴露妊娠子宫，将两侧子宫角游离出来，并计数妊娠囊的数量。根据胎儿头部外置的最佳位置，对每个角中的一个胎儿进行手术。为固定子宫内的胎儿，在肩部位置通过子宫壁和胎膜，使用六针约一厘米直径的普罗琳缝线（proline）荷包缝合，缝合区域为胎儿头部将要暴露的部位。接着，使用尖端锋利的小剪刀，在荷包缝合内的子宫壁上做约0.8厘米的切口。接下来，通过子宫切口轻柔地挤出胎儿的头部和颈部。然后轻柔地拉紧荷包缝合线，使其在颈部周围收紧，并使用两把微型蚊式止血钳固定。用5-0聚乙醇酸缝线将其固定在位。使用两把持针器夹住9-0缝线，将其置入口腔并环绕上颌，以在体视显微镜下保持胎头处于过伸状态。通过锐性与钝性分离暴露气管，作垂直颈部切口，并进一步分离皮下组织以暴露气管。使用50 µL Hamilton玻璃注射器配30号锐利针头，总共注入30 µL的物质。拔出针头时，注入液体的最小反流表明注射操作正确。为将胎头复位至子宫内，需轻柔按压鼻部，先使颈部回纳至子宫，随后是头部。最后处理鼻子。将含有生理盐水的注射器针头插入荷包缝线内的切口。通过收紧荷包缝线关闭子宫切口，并向羊膜腔内注射总共约 500 µL 的生理盐水，以防止羊水过少。将子宫复位至腹腔后，使用5-0 Vicryl缝线以连续缝合法分两层缝合。关闭母鼠腹壁时，用0.2%利多卡因浸润切口以缓解术后疼痛。将小鼠置于加热垫上，直至其完全恢复，以进行胎儿宫内或宫内（IA）注射。麻醉怀孕小鼠后，使用聚维酮碘对腹部进行消毒，并行正中剖腹术。暴露怀孕子宫，外翻两侧子宫角，计数妊娠囊的数量。使用一支50微升的Hamilton玻璃注射器，配30号锐利针头，将针头插入妊娠囊靠近胎儿口腔的位置，但不与胎儿接触，向羊水中注入30微升溶液。所有胚胎注射完成后，将子宫复位至腹腔，并使用5-0 Vicryl缝线缝合腹壁和皮肤。在母体干预后36小时实施安乐死，通过剖宫产取出胚胎，并通过检查是否存在心跳、皮肤是否呈粉红色以及是否有自主运动来评估其存活情况。将仔鼠置于氧气供应附近，以刺激呼吸并促进氧气摄取。然后在仔鼠尾根部做标记。使用中国墨水，可通过处死一只经过手术的胎鼠并解剖其肺组织，肉眼观察肺内是否有可见染料分布，以此评估注射是否成功，与未注射的对照组肺组织进行比较。接着，将剩余符合存活标准的仔鼠覆盖好。将含有寄养母鼠及其出生一天幼崽粪便和尿液的垫料，与幼崽一同放入寄养母鼠的产仔群中。寄养母鼠所带幼崽总数不得超过10只。随后将鼠笼置于安静、不受干扰的环境中12小时，评估寄养存活率，以确定最佳寄养数量。注射10、20和30微升体积的100纳米红色荧光分子是根据经验选择的。图中显示的是经固定处理的肺组织切片的共聚焦图像，细胞核已染色。尽管在胎儿手术时仅在注射30微升后检测到反流，提示注入液体过量，但通过测量此处所示的相对荧光强度进行量化后发现，30微升注射量在肺实质中产生的荧光信号最强，该注射量导致荧光微球向胎儿肺部的递送量显著高于IA根途径。胃肠道在IT和IA注射的动物中也呈阳性。在经处理的胎鼠的其他组织或阴性对照动物中均未观察到红色荧光。为评估注射后病毒转导的效率，在出生一周时通过IT和IA途径注射了携带萤火虫荧光素酶基因的RAAV载体（ENC包膜），该基因由鸡β-肌动蛋白启动子驱动。IT组的总光子通量显著高于IA组幼鼠和阴性对照组。为了区分正确的与错误的IT注射，采用磁共振成像（MRI）和生物发光成像（BLI）相结合的方法，获得叠加图像，将BLI信号与MRI提供的深层解剖结构可视化信息进行整合，如图所示。在出生后一周时，BL成像显示信号来源于颈部和胸腔区域。通过将MRI与BLI共定位，可检测到正确注射后荧光素酶基因在肺部区域的表达，而错误注射后则在颈部和腹部区域检测到信号。X-gal染色的组织学分析证实了体内的共定位结果。一旦掌握整个操作流程，从母体动物切开到缝合的整个注射过程可在半小时内完成。较短的手术时间将有助于提高胎儿存活率，并增加出生后可进行研究的动物数量。

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一种新的手术方法气管内注射生物活性剂在胎鼠模型

本视频介绍了一种支气管内给药方法，可将实验性药物选择性地递送至右侧和左侧远端肺组织。在本视频展示的实验方案中，我们将通过支气管内途径向小鼠给予博来霉素，以获得更理想的肺纤维化模型。...

支气管内给药：一种将实验药物选择性递送至小鼠肺部的技术

来源： Venuprasad, K., 等气管内给药 流感嗜血杆菌 在小鼠模型中研究气道炎症。 视频实验杂志...

在小鼠模型中进行气管内细菌递送

本视频展示了在怀孕小鼠体内对小鼠胎儿进行的经子宫气管阻塞手术。该模型可用于研究气管阻塞对肺部发育的影响。...

在小鼠模型中模拟经子宫胎儿气管阻塞：小鼠妊娠期间胎儿气管结扎手术操作

关键词：胎儿气管阻塞，小鼠模型，经子宫手术，胎儿干预，气管结扎，发育生物学，产前治疗

我们建立了一种简单、可靠且相对经济的小鼠经气管插管方法，该方法通过使用带有2.0...

小鼠气管插管术 通过 使用耳镜进行直接喉镜检查

使用模拟人类肺部疾病状况的模型对于研究特定疾病的病理生理学和/或病因学以及开发治疗干预措施至关重要。本文介绍了一种可将外源性物质直接递送至小鼠肺部的无创经气管插管方法。...

无创气管插管法研究小鼠肺部病理与生理

本文介绍了一种通过插管将博来霉素直接注入小鼠气管的快速简便方法。该方法的主要优点在于具有高度可重复性、易于掌握，且无需特殊设备或漫长的恢复时间。...

一种改进的小鼠气管快速插管方法

在小鼠中进行实验物质的气管内（IT）给药时，常导致药物在远端肺部的分布不对称。  本报告中，我们描述了一种直接支气管内（IB）给药方法，可在不进行手术的情况下对活体小鼠的每侧肺进行插管。...

直接支气管内给药以提高小鼠肺部靶向药物的沉积选择性

将药物直接注入新生啮齿类动物气管的技术，对于研究局部给药的药物或生物制剂对新生儿肺部疾病的影响具有重要意义。此外，该方法还可用于在动物模型中诱导肺损伤。...

一种用于治疗新生啮齿类动物肺部疾病的微创气管内给药方法

关于先天性膈疝和胎儿气管阻塞的各种动物模型，在伦理问题、成本、手术难度、体型、存活率以及遗传工具的可获得性方面各有优缺点。该模型为研究气管阻塞及管腔内压力升高对肺发育的影响提供了一种新工具。...

小鼠经子宫胎儿气管阻塞模型

此处，我们提出一种经气管递送脂多糖（LPS）的实验方案 通过 无创经口咽气管插管。该方法可最大限度地减少手术操作对动物造成的创伤，并能准确地将LPS输送至气管，进而进入肺部。...

小鼠非侵入性气管内脂多糖滴注

本方案介绍了如何通过优化小鼠体位并经口插入基于摄像头的耳镜，实现对声门的清晰观察，以最小的组织损伤快速进行气管插管，并稳定地将液体输送至肺部。...

改进的小鼠肺部液体递送方法：使用民用耳镜进行插管

了解一种新型胎鼠气管内注射手术技术，通过子宫切开术暴露胎头并直接注入生物活性剂，有效避免羊膜腔注射导致的药物稀释问题，显著提高荧光分子和病毒载体向胎儿肺部的递送效率。

一种在胎鼠模型中进行气管内给予生物活性物质的新型外科手术方法

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