使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

本实验的总体目标是从脂肪组织中分离出多能基质细胞，并利用小鼠体内颅骨缺损模型进行成骨分化研究。首先，从脂肪组织的基质血管层中分离祖细胞，这些细胞可在吸脂手术后获得。接下来，制备一种三维支架，将细胞接种于该支架上。

最后一步是在小型猪模型中创建一个临界尺寸的颅骨缺损，并将支架材料和细胞植入其中。最终结果表明，从脂肪组织中分离获得的多能基质细胞具有在体内进行骨骼再生的潜力。由于可用于骨骼再生的组织来源有限，该技术具有广泛的潜在临床应用前景。

自体骨移植虽为金标准，但受限于供体部位不足及供区并发症，其应用受到限制。同种异体移植和异源材料虽可使用，但仍存在成本高、整合效果差以及潜在感染风险等局限性。

利用脂肪组织分离祖细胞用于骨骼组织工程具有广阔前景。本次实验操作将由我本人以及来自朗锚实验室的Michael Chung共同演示。首先，从择期脂肪抽吸手术中获取人体皮下脂肪组织。

注意脂肪抽吸物中的两层结构。上清液含有绝大部分的细胞成分，而底层主要是注入的生理盐水。

脂肪来源的基质细胞可以从任一层中获取，但上清层的产量要高得多。为了分离基质血管组分（SVF）或SVF洗涤液，需用等体积的含2.5%聚维酮碘的1×磷酸盐缓冲液（PBS）对脂肪抽吸物进行充分冲洗，随后用等体积不含聚维酮碘的1×PBS再次冲洗。静置使洗涤液沉淀。

整个操作过程中务必保持无菌技术，以避免人源组织样本受到污染。随后，每次洗涤后吸弃下层液体，将15毫升脂肪组织转移至50毫升Falcon锥形管中。然后将脂肪组织加入15毫升过滤的0.075%胶原酶溶液进行消化。

将II型胶原酶加入Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，于37摄氏度水浴中孵育60分钟，并持续振荡，每15分钟通风一次。随后用含有10%胎牛血清（FBS）的15毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中和酶活性，并进行离心。为获得高密度的基质血管组分（SVF）沉淀，该沉淀物将包含脂肪来源的干细胞与红细胞的混合物。

首先弃去上清脂肪层，然后在不扰动沉淀的情况下弃去上清液体层。将沉淀重悬于10毫升传统生长培养基中。随后通过100微米滤膜将三根试管中的细胞合并至一根洁净的50毫升锥形管中，并进行离心。

弃去上清液，注意不要扰动沉淀，然后重新悬浮沉淀。每1个10厘米培养皿使用2个50毫升锥形管，或每1个15厘米培养皿使用5个5毫升锥形管，各加入5毫升传统生长培养基。在37摄氏度、21%氧气和5%二氧化碳条件下培养过夜，建立原代培养物。

孵育过夜后，用 PBS 洗涤培养板，以去除残留的非黏附性红细胞。所得细胞群体为脂肪来源的基质细胞。应将细胞维持在亚融合水平，以防止自发性分化。

在37摄氏度、21%氧气和5%二氧化碳条件下，在生长培养基中，细胞通常每三到四天需要传代一次。当细胞以50%融合度接种时，按照随附文稿中的说明制备支架。

当细胞达到亚融合状态时，用 PBS 洗涤细胞两次，并加入胰蛋白酶消化。计数细胞以确定其数量；用于接种时，将细胞接种至预先切割的直径为 4 毫米的支架上，每个支架接种 1.5 × 10⁵ 个细胞。

将单个支架放入96孔板的一个孔中，然后用常规培养基重悬细胞，细胞浓度约为每20微升培养基含1.5 × 10⁵个细胞。通过移液器将20微升细胞悬液直接接种到支架上，随后将孔板置于细胞培养箱中孵育30分钟。

30分钟后，加入200微升培养基，使细胞在支架上过夜孵育。在手术前，无需确保细胞已黏附于支架上，因为接种时已有足够数量的细胞，可保证大部分细胞能够附着于支架上。

麻醉一只60日龄的成年CD-1裸鼠后，用聚维酮碘和酒精对术区消毒三次，并在小鼠眼睛上涂抹润滑剂。然后在小鼠头皮做正中矢状切口，暴露右侧顶骨。用钝性刮除法去除右侧顶骨上的骨膜。

接下来，在右侧非缝合相关的顶骨上制造一个单侧的4毫米全层缺损。使用带有金刚石涂层的钻头时，需格外小心，避免损伤下方的硬脑膜，因为在植入前小鼠颅骨的厚度不足0.3毫米。用无菌PBS冲洗支架，以防止培养基来源的生长因子被转移。

将支架植入缺损处。最后，缝合皮肤，并按照既定的术后方案对动物进行监测。对小鼠进行微型CT扫描，并使用MicroView软件获取三维重建图像。

使用 Adobe Photoshop 将图像调整为标准高度。通常，我们每两周测量一次颅骨再生情况。在进行长期随访扫描时，小鼠需接受麻醉处理，最终被实施安乐死。

进行组织学分析时，使用魔棒工具测量颅骨缺损区域的像素。通过后续的CT扫描确定缺损的愈合百分比。测量颅骨缺损面积，确定其像素数量，并除以原始缺损的像素数量。沿缺损跨度染色多个组织切片，使用组织学染色剂如阿利新蓝（analine blue）和番红O（pen aro）染色以显示骨形成情况。

使用 Adobe Photoshop 裁剪出颅骨缺损区域以外的所有部分，并使用魔术棒工具确定缺损区域内新生骨形成的像素数量，然后将其与对照组或其他变量进行比较。此处展示的是脂肪抽吸物的获取与应用概览，涵盖了从脂肪来源的基质细胞（ASCs）的分离、体外扩增与分化，到其在体外和体内应用的全过程。下方底排图像为微型 CT 扫描结果，显示通过羟基磷灰石支架递送 ASCs 后，临界尺寸颅骨缺损在体内的愈合情况。

对照组位于第一行，包括无支架组和缺损组。第二行显示植入支架但未接种细胞的缺损组。此处所示的LS为基于显微CT的骨愈合量化结果，表明A SC组的愈合程度显著增加。

这是一张组织学图像，显示通过安达尔（andal）处理的ASC组骨形成增加。采用蓝色和笔法AROM染色显示AL。在蓝色背景下，类骨质经笔法AROM染色呈深蓝色。

此处显示的黄色类骨质染色为人源ASCs，这些细胞标记了GFP，接种于支架上，并在两周后处死取材。使用GFP标记的抗体进行染色，以显示人源细胞在缺损区域参与再生的情况。此处展示的是人源核抗原免疫组化结果，显示在术后两周时缺损区域存在大量人源细胞。

一旦掌握，脂肪组织的处理可在四小时内完成，而每只小鼠的手术过程大约需要10分钟。需要注意的是，顶骨呈圆形，而钻头是平的，因此必须小心操作，确保完全穿透4毫米缺损的整个周缘。操作时应缓慢进行，避免损伤脑部的硬脑膜。

观看本视频后，您应充分了解如何从脂肪组织中分离祖细胞层，将这些细胞接种到支架上，并将其植入小鼠体内。