Name: 修复的临界大小的颅骨缺损模型脂肪间充质干细胞的收获Lipoaspirate (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T10:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学习从脂肪抽吸物中分离脂肪间充质干细胞并构建小鼠临界尺寸颅骨缺损模型的方法。该技术用于评估细胞在体内的成骨分化潜能，为骨组织再生提供临床前研究基础。

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我们感谢 George Commons 博士和 Dean Vistnes 博士对本研究的支持与合作。本研究由美国国家牙科与颅面研究所资助，资助项目编号为 1 R21 DE019274-01、R01EB009689 和 RC2 DE020771-02，同时获得Oak Foundation 和 Hagey 儿科再生医学实验室对 M.T.L. 的支持。Hyun 博士的研究由圣约瑟夫梅西医院住院医师培训项目资助。

1. 细胞分离与扩增
<ol>
 <li>所有患者知情同意书和实验方案均经斯坦福大学机构审查委员会（Stanford University Institutional Review Board）审核并批准（方案编号 #2188 和 #9999）。</li>
 <li>在局部或全身麻醉下，通过择期负压吸脂术获取人皮下脂肪组织。</li>
 <li>吸脂产物中将出现两层（图1A）。上层为液相，含有绝大部分经处理的细胞成分；下层主要为注入的生理盐水。脂肪来源的基质细胞可从任一层中获取，但上层的细胞得率显著更高。</li>
 <li>为分离基质血管组分（SVF），先用等体积含2.5%聚维酮碘（betadine）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤吸脂物（洗涤两次），随后用等体积不含聚维酮碘的1×PBS再洗涤一次（洗涤一次），静置使沉淀析出。</li>
 <li>整个操作过程中需严格保持无菌技术，因处理的人体组织易受污染。</li>
 <li>每次洗涤后，小心吸除并弃去下层液体。</li>
 <li>将15 ml脂肪组织分装至50 ml BD Falcon圆锥形离心管中。</li>
 <li>加入等体积（15 ml）过滤后的0.075% II型胶原酶（Type II collagenase）于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，在37 °C水浴中消化60分钟，持续震荡（约180次/分钟），每15分钟通气一次。</li>
 <li>加入含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）的15 ml PBS终止酶活性，随后在4 °C下以1,000 rpm离心5分钟，获得高密度的SVF沉淀。该沉淀为脂肪来源的基质细胞与红细胞的混合物。</li>
 <li>弃去上清液，注意勿扰动沉淀。</li>
 <li>将沉淀重悬于10 ml传统生长培养基（Dulbecco's改良Eagle培养基[DMEM]/10% FBS/1%青霉素-链霉素溶液）中。</li>
 <li>通过100 μm尼龙细胞滤器过滤悬液，以去除细胞碎片。</li>
 <li>将3支离心管的样品合并至一个洁净的50 ml离心管中，在4 °C下以1,000 rpm离心5分钟。</li>
 <li>弃去上清液，注意勿扰动沉淀。</li>
 <li>将沉淀重悬于5 ml传统生长培养基中。</li>
 <li>每1个10 cm培养皿使用2个50 ml离心管的样品，或每1个15 cm培养皿使用5个50 ml离心管的样品进行合并。</li>
 <li>在37 °C、21% O2、5% CO2条件下培养过夜，建立原代细胞培养。</li>
 <li>过夜孵育后，用PBS充分洗涤培养皿，以去除残留的非贴壁红细胞。所得细胞群体即为脂肪来源的基质细胞。</li>
 <li>在生长培养基中，于37 °C、21% O2、5% CO2条件下维持细胞在亚融合状态，以防止自发分化。当细胞以50%融合度接种时，通常每三至四天需在常规生长培养基中传代一次。</li>
</ol>
2. 支架制备
<ol>
 <li>支架由加州大学洛杉矶分校牙科学院的 Min Lee 博士制备。</li>
 <li>PLGA 支架采用 85/15 聚（乳酸-共-乙醇酸）（固有黏度 = 0.61 dl/g，Birmingham Polymers）通过溶剂浇铸法和颗粒沥滤法制备。</li>
 <li>将 PLGA/氯仿溶液与直径为 200–300 μm 的蔗糖混合，以获得 92% 的孔隙率（体积分数），并在聚四氟乙烯模具中压制成薄片。</li>
 <li>经冷冻干燥过夜后，将支架浸入三次更换的双蒸馏水（ddH2O）中以溶解蔗糖，并用细头刮刀轻轻从聚四氟乙烯板上取下。</li>
 <li>颗粒沥滤后，所有支架依次浸入 50%、60% 和 70% 乙醇中各 30 分钟进行消毒，随后用 ddH2O 洗涤三次。</li>
 <li>所有支架均在层流罩下干燥。</li>
 <li>支架制备完成后，对其进行羟基磷灰石涂层处理。
 <ol class="ualpha">
 <li>配制模拟体液（SBF）溶液，其离子浓度为人体血浆的 5 倍。所有溶液均通过 0.22 μm 聚醚砜膜（Nalgene）无菌过滤。在涂层处理前立即对干燥的 PLGA 支架进行辉光放电和氩等离子体刻蚀（Harrick Scientific），以提高润湿性和涂层均匀性。</li>
 <li>刻蚀后的 PLGA 支架随后在 37 °C 水套培养箱中于 SBF 中孵育 12 小时，接着在 37 °C 下轻轻搅拌条件下，于不含 Mg2+ 和 HCO3- 的 SBF2 中继续孵育 12 小时。</li>
 <li>涂层后的 PLGA 支架用无菌双蒸水（ddH2O）轻轻冲洗，以去除多余的氯化钠溶液，随后在层流罩中干燥并用 70% 乙醇消毒。</li>
 <li>采用扫描电子显微镜（SEM）分析羟基磷灰石涂层的完整性。将涂层支架固定在 SEM 样品台（Ted Pella）上，并镀碳以提高导电性。在 SEM（FEI/Phillips XL-30）观察过程中采用二次电子模式，并获取能量色散 X 射线光谱以确认羟基磷灰石结构的元素组成。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. 细胞接种
<ol>
 <li>当细胞达到亚汇合状态时，用 PBS 洗涤细胞（2 次），然后进行胰蛋白酶消化。</li>
 <li>计数细胞以确定接种数量</li>
 <li>接种于预先切割的直径为4.0 mm的支架上，细胞密度为1.5 × 105 细胞
 <ol class="ualpha">
 <li>将单个支架放入96孔板的孔中</li>
 <li>在常规生长培养基中重悬细胞，浓度约为 1.5 x 105 细胞每 20 μl 培养基</li>
 <li>移液 20 μl 直接接种到支架上，放入细胞培养箱中孵育30分钟。</li>
 <li>30分钟后，加入 200 μl 培养基孵育，并在手术前使细胞在支架上孵育过夜</li>
 <li>无需确保细胞完全黏附于支架上，因为接种足够数量的细胞可保证大部分细胞自行黏附至支架。该方法已在本实验室得到验证 体内 通过生物发光和组织学分析。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. 颅骨缺损的制备与 体内 植入
<ol>
 <li>用麻醉剂混合物（氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪）以50%浓度（用0.9% NaCl 1:1稀释）或根据各机构推荐的麻醉方案对60日龄成年CD-1裸鼠进行麻醉。这些小鼠为无胸腺型，因此hASCs不会引起免疫反应。
 <ol class="lalpha">
 <li>剂量：盐酸氯胺酮（80 mg/kg）、赛拉嗪（2.5 mg/kg）、乙酰丙嗪（2.5 mg/kg）</li>
 <li>作用持续时间：约 30 min</li>
 </ol>
 </li>
 <li>手术时将动物进行无菌铺巾，使用碘伏和酒精对手术部位消毒三次，并在切开头皮前用眼膏覆盖小鼠眼睛以保护角膜。沿头皮正中矢状线做一 incision，暴露右侧顶骨。用钝性刮除法去除右侧顶骨表面的骨膜。图1B).</li>
 <li>使用无菌金刚石涂层环钻在右侧非缝合相关的顶骨上制备一个4毫米全层骨缺损。 必须极度小心，以免扰动下方的硬脑膜（图1B）因为小鼠颅顶骨的厚度是 &lt;0.3 mm</li>
 <li>植入前，用无菌 PBS 冲洗支架，以防止培养基来源的生长因子转移。</li>
 <li>将支架植入缺损处。</li>
 <li>最后，缝合皮肤，并按照既定的术后护理方案对动物进行监测。</li>
 <li>根据动物护理方案的要求，在术后按需使用已确立的镇痛方法。 例如. 布托啡诺 0.1 mg/kg。</li>
</ol>
5. 类骨质形成量的定量分析
<ol>
 <li>在对小鼠进行 MicroCT 扫描后，使用 MicroView 软件按照先前所述方法重建三维图像1.</li>
 <li>使用 Adobe Photoshop 将图像调整为标准高度。</li>
 <li>使用魔棒功能，测量了颅骨缺损区域的像素。</li>
 <li>通过后续CT扫描测量颅骨缺损区域，计算像素数量，并将其除以原始缺损区域的像素数量，以确定缺损的愈合百分比</li>
 <li>因此，如果无法使用MicroCT，可采用Adobe Photoshop，并在预定时间点取材颅骨进行组织学分析作为替代方法。</li>
 <li>使用可标记类骨质形成的组织学染色剂（如苯胺蓝和五色染色法），应对缺损区域沿跨度的多个切面进行染色</li>
 <li>使用 Adobe Photoshop 裁剪掉颅骨缺损区域以外的所有部分</li>
 <li>使用魔棒工具并确定像素数量 从头合成 在缺损区域观察骨形成情况，并与对照组或其他变量进行比较。</li>
</ol>
6. 代表性结果
脂肪组织在临床应用中具有作为前体细胞来源的重要潜力。其独特优势在于，脂肪组织来源丰富，可通过一种相对简单的手术 procedure 获取，且伴随的发病率和死亡率极低。在组织被采集并收集后，我们的实验方案如下所述： 图2脂肪来源的基质细胞通过一系列洗涤步骤、胶原酶消化和离心分离获得。细胞接种培养后可进行扩增，并进入各种诱导分化方案。 体外，或直接放置 体内.
4 mm临界尺寸颅骨缺损模型的建立提供了一种易于操作且可重复的 在体 用于检测我们所获得的脂肪源性基质细胞成骨分化能力的模型。通过使用MicroCT，我们能够追踪骨骼组织的形成过程 体内 并追踪我们干预措施的进展（图 3）。颅骨临界尺寸缺损在动物的整个生命周期内不会自行愈合，我们观察到大约8周时约有90%的缺损区域仍保持未愈合状态。支架材料本身（见讨论部分）具有成骨诱导特性，已显示出能够诱导一定程度的骨再生。典型的无细胞支架植入结果表明，缺损区域约有三分之一将出现骨组织再生 从头合成 8周时的骨形成情况。通过添加脂肪来源的基质细胞，大约8周时，缺损区域中完全有三分之二或更多的部分将显示出骨组织再生，尽管在不同动物及手术之间存在一定变异。骨骼组织的形成可通过组织学进行定量分析，典型结果表明，经阿尼林蓝和五色染色后，含有ASCs的样本中类骨质形成增加。图3C。此外，我们还表明，植入的人类细胞有助于底层组织的形成 从头合成 通过显示染色的GFP标记hASCs实现骨组织形成 体内 2周时，在该区域附近 从头合成 颅骨缺损中的骨形成（图 3D）此外，我们使用针对人类特异性抗体的免疫组织化学方法，以显示人源细胞在缺损区域的存活及其贡献图3E）。
<img alt="离心分离脂肪抽吸物；颅骨缺损实验中的骨组织愈合。" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. A — 脂肪抽吸物分为两层。上层含有脂肪细胞及大部分细胞间质成分，下层为脂肪抽吸过程中使用的生理盐水。B — 通过颅骨骨膜上方正中切口暴露右侧顶骨，随后制作一个4 mm的临界尺寸颅骨缺损，且不损伤下方的硬脑膜。
<img alt="人干细胞分化过程示意图，体外和体内实验，细胞培养。" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 从脂肪来源基质细胞的分离到其扩增、分化及在体外和体内应用的脂肪抽吸物获取与利用概览。
<img alt="MicroCT bone healing process; A) scan images, B) healing graph, C-E) histology at 8 weeks." src="/files/ftp_upload/4221/4221fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
 图3. A -MicroCT 显示 体内 通过羟基磷灰石支架递送脂肪来源干细胞（ASCs）促进颅骨临界尺寸缺损的修复（底行）。对照组包括无支架且无缺损（顶行）以及仅植入支架但未接种细胞的缺损模型（中行）。B - MicroCT定量分析显示，ASC组骨愈合显著增加。C - 苦味酸-品红及苯胺蓝染色组织学结果，显示ASC组（底行）类骨质形成增多；苯胺蓝染色中类骨质呈深蓝色，五色染色（Pentachrome）中类骨质呈黄色。D - 将表达GFP的hASCs接种于支架后植入颅骨缺损区，术后2周处死动物；采用GFP标记的抗体进行染色，以显示人源细胞在缺损区域参与组织再生。E - 人源核抗原免疫组织化学染色显示，术后2周缺损区域存在大量人源细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4221/4221fig3large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.

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</ol>

无利益冲突声明。

自从从脂肪抽吸物中分离出脂肪来源的基质细胞2以来，这些细胞已被诱导分化为多种细胞谱系。脂肪组织起源于中胚层，因此，多能性脂肪来源的基质细胞在应用于中胚层谱系时可能最为有效。鉴于自体移植供区的短缺以及合成材料固有的局限性（包括感染、排斥反应及随时间推移而降解等问题）3，生成骨骼组织的能力尤为重要。脂肪来源的基质细胞提供了一种潜在的自体多能细胞系，每次手术获取均可获得相对较高的细胞产量4。
在处理基质血管组分和脂肪细胞组织时，必须保持良好的无菌操作技术。由于脂肪抽吸物本身具有较大的体积，并且在细胞培养超净台外需经历多次洗涤、消化和离心等操作，因此原代培养过程中存在较高的污染风险。当细胞沉淀接种至培养皿后，所见的大部分可见细胞为红细胞。待脂肪来源的基质细胞贴壁后，可通过无菌 PBS 洗去红细胞，或使用红细胞裂解缓冲液进行处理。在初始接种步骤中，细胞应保持相对较高的汇合度，以确保其正常生长和分化能力。
关于如何准确定义脂肪来源的基质细胞，目前尚无统一共识。尽管已有研究尝...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;脂肪抽吸物采集&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C6885-500MG</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤筛 100 &amp;mu;m </td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Steri-top 500 ml .22 &amp;mu;m 滤器 </td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;颅骨缺损模型&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Z500 无刷微型电机 UM50C </td><td>NSK</td><td>NSKZ500</td><td></td></tr><tr><td>圆形刀 4.0 mm </td><td>Xemax 外科</td><td>CK40</td><td></td></tr></tbody></table>

使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

颅面骨骼修复与再生具有巨大的潜力 从头合成 通过基于细胞的方法利用干细胞实现组织形成。脂肪来源的基质细胞（ASCs）已被证实是多能干细胞的丰富来源，能够进行成骨、软骨、脂肪和肌源性分化。许多研究已探讨了这些细胞的成骨潜能 体内 通过使用多种用于细胞递送的支架生物材料，已有研究表明，采用负载脂肪来源干细胞（ASCs）的具有骨传导性的羟基磷灰石涂层聚乳酸-羟基乙酸共聚物（HA-PLGA）支架，可有效促进临界尺寸颅骨缺损的骨组织再生。临界尺寸颅骨缺损是指在动物生命周期内无法自发愈合的骨缺损。该方法可实现显著的骨再生效果。 体内 该模型展示了旨在再生骨组织的转化研究方法的基础——细胞组分与生物基质。该方法为祖细胞在修复特定组织缺损中的最终临床应用提供了模型。

本方案描述了从脂肪抽吸物中分离脂肪源性基质细胞以及制备4 mm临界尺寸颅骨缺损以评估骨骼再生的方法。

颅面骨骼的修复与再生有望通过利用干细胞的细胞治疗策略实现新组织的从头生成。

本实验的总体目标是从脂肪组织中分离出多能基质细胞，并利用小鼠体内颅骨缺损模型进行成骨分化研究。首先，从脂肪组织的基质血管层中分离祖细胞，这些细胞可在吸脂手术后获得。接下来，制备一种三维支架，将细胞接种于该支架上。最后一步是在小型猪模型中创建一个临界尺寸的颅骨缺损，并将支架材料和细胞植入其中。最终结果表明，从脂肪组织中分离获得的多能基质细胞具有在体内进行骨骼再生的潜力。由于可用于骨骼再生的组织来源有限，该技术具有广泛的潜在临床应用前景。自体骨移植虽为金标准，但受限于供体部位不足及供区并发症，其应用受到限制。同种异体移植和异源材料虽可使用，但仍存在成本高、整合效果差以及潜在感染风险等局限性。利用脂肪组织分离祖细胞用于骨骼组织工程具有广阔前景。本次实验操作将由我本人以及来自朗锚实验室的Michael Chung共同演示。首先，从择期脂肪抽吸手术中获取人体皮下脂肪组织。注意脂肪抽吸物中的两层结构。上清液含有绝大部分的细胞成分，而底层主要是注入的生理盐水。脂肪来源的基质细胞可以从任一层中获取，但上清层的产量要高得多。为了分离基质血管组分（SVF）或SVF洗涤液，需用等体积的含2.5%聚维酮碘的1×磷酸盐缓冲液（PBS）对脂肪抽吸物进行充分冲洗，随后用等体积不含聚维酮碘的1×PBS再次冲洗。静置使洗涤液沉淀。整个操作过程中务必保持无菌技术，以避免人源组织样本受到污染。随后，每次洗涤后吸弃下层液体，将15毫升脂肪组织转移至50毫升Falcon锥形管中。然后将脂肪组织加入15毫升过滤的0.075%胶原酶溶液进行消化。将II型胶原酶加入Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，于37摄氏度水浴中孵育60分钟，并持续振荡，每15分钟通风一次。随后用含有10%胎牛血清（FBS）的15毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中和酶活性，并进行离心。为获得高密度的基质血管组分（SVF）沉淀，该沉淀物将包含脂肪来源的干细胞与红细胞的混合物。首先弃去上清脂肪层，然后在不扰动沉淀的情况下弃去上清液体层。将沉淀重悬于10毫升传统生长培养基中。随后通过100微米滤膜将三根试管中的细胞合并至一根洁净的50毫升锥形管中，并进行离心。弃去上清液，注意不要扰动沉淀，然后重新悬浮沉淀。每1个10厘米培养皿使用2个50毫升锥形管，或每1个15厘米培养皿使用5个5毫升锥形管，各加入5毫升传统生长培养基。在37摄氏度、21%氧气和5%二氧化碳条件下培养过夜，建立原代培养物。孵育过夜后，用 PBS 洗涤培养板，以去除残留的非黏附性红细胞。所得细胞群体为脂肪来源的基质细胞。应将细胞维持在亚融合水平，以防止自发性分化。在37摄氏度、21%氧气和5%二氧化碳条件下，在生长培养基中，细胞通常每三到四天需要传代一次。当细胞以50%融合度接种时，按照随附文稿中的说明制备支架。当细胞达到亚融合状态时，用 PBS 洗涤细胞两次，并加入胰蛋白酶消

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修复的临界大小的颅骨缺损模型脂肪间充质干细胞的收获Lipoaspirate

人类血管周围干细胞（PSCs）是一类新型干细胞，可用于骨骼组织再生，其功能类似于间充质干细胞（MSCs）。PSCs可通过FACS（荧光激活细胞分选）从标准吸脂手术中获取的脂肪组织中分离，随后与成骨诱导性支架材料结合，以实现骨形成。 体内.

使用人血管周围干细胞进行骨再生

2001年，加州大学洛杉矶分校的研究人员描述了一种从脂肪组织中分离成体干细胞群体的方法，这类细胞被称为脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem...

从人脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞

利用细胞表面标志物和成骨基因，可在单细胞水平上定义人脂肪来源基质细胞内的转录异质性。我们描述了一种利用流式细胞术分离具有增强成骨潜能的细胞亚群的方案，该方案可用于增强颅面骨骼的重建。...

人脂肪来源基质细胞的分离与富集以增强成骨作用

脂肪来源的基质细胞可能适用于利用患者自体细胞构建新组织。本文介绍一种分离具有增强成骨潜能的人脂肪来源基质细胞（ASCs）亚群的实验方案，随后将这些细胞应用于 体内...

快速分离BMPR-IB+脂肪源性基质细胞用于颅骨缺损修复模型

此处，我们介绍一种用于可视化血管形成的实验方案 体内 通过多光子显微镜在三维支架中实时观察。在转基因支架中的血管生成研究采用小鼠颅骨临界骨缺损模型。治疗组中检测到的新血管数量多于对照组。...

通过多光子显微镜观察血管生成 在体 内 用于颅骨临界骨缺损修复的基因修饰3D-PLGA/nHAp支架

本研究旨在报道一种利用微骨折技术结合纯化脂肪来源干细胞进行距骨软骨损伤关节镜治疗的操作方案。...

自体微骨折并纯化脂肪组织用于踝关节镜下距骨骨软骨损伤的治疗

用于修复大段骨缺损的新型生物材料数量正在持续增加，旨在促进骨愈合并克服与骨移植相关的并发症。本文介绍了一种用于骨修复生物材料临床前生物相容性测试的多学科策略。...

骨再生用生物材料的生物学相容性评价

本文介绍了一种制备脂肪组织来源的基质血管组分的方案，并将其应用于骨关节炎患者，通过再生类似软骨的组织以改善膝关节功能。...

用于软骨再生的脂肪组织来源基质血管组分制备的临床方案

本文介绍一种通过系列机械处理（包括乳化和多次离心）从脂肪组织中获取基质血管组分的实验方案。...

脂肪抽吸物的机械微粒化用于再生治疗

我们描述了大鼠颅骨骨缝-骨复合缺损的详细外科手术步骤，并研究了该模型的短期和长期预后。我们的目标是建立一个标准化的模型，用于开发骨缝再生疗法。...

大鼠颅骨骨缝-骨复合缺损模型的建立：骨缝再生治疗研究的标准化模型

学习从脂肪抽吸物中分离脂肪间充质干细胞并构建小鼠临界尺寸颅骨缺损模型的方法。该技术用于评估细胞在体内的成骨分化潜能，为骨组织再生提供临床前研究基础。

使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

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