的神经植体培养非洲爪蟾

培养神经外植体解剖

该程序的目的是培养非洲爪蟾 Lavis 生长锥，用于随后的高分辨率图像分析。这是通过首先给雌性青蛙注射激素以刺激产卵来实现的。第二步是收集卵子并使卵子受精，然后用 mRNA 或其他感兴趣的构建体注射它们。

第二天，解剖胚胎，分离神经管，切开并接种在盖玻片上。最后一步是对生长的轴突和生长锥进行成像。最终，高分辨率荧光显微镜可用于显示生长锥中蛋白质定位随时间的变化。

这种方法的视觉演示至关重要，因为如果不亲身观察该技术，则很难通过阅读方法部分来学习神经管解剖。提前 12 至 14 小时从先前注射 400 单位绒毛膜促性腺激素的雌性青蛙中获取卵。将鸡蛋收集到一个 X 标记改良的林格溶液中。

然后如前所述，用碎睾丸在体外给收集的 X 施肥，并在至少 20 分钟后加入 0.1 XMMR。去除培养基，将胚胎在 pH 值为 7.8 的 2% XMMR 中放入 2% 半胱氨酸中孵育 3 至 5 分钟，以去除胚胎果冻涂层。然后将胚胎倒入烧杯中。

接下来，在最后一次洗涤后，用 0.1 XMMR 或 0.1 x 改良盐水洗涤胚胎 3 到 5 次。将胚胎在室温下保存在 0.1 XMMR 中，直至注射或如果需要。注射前将胚胎置于 14 至 18 摄氏度以减缓发育。

用双蒸水将先前制备的加帽 RNA 稀释至终浓度为 50 至 200 pg 香蕉升，然后储存在冰上直至微量注射。接下来，通过使用注射器拉拔器或类似工具拉动硼硅酸盐毛细管来准备注射针。然后在显微镜下，用镊子以一定角度折断针尖，产生羽毛笔状的形状，并用 0.5 到 1 微升稀释的 RNA 溶液回填针头。

将针头安装在微型机械手上这里使用了 medical system 的 PLI 100 PICO 注射器。现在，将一到四个细胞阶段的受精胚胎放入含有 0.1 XMMR 中 5%fol 的塑料皿中。使用自由式或载物台千分尺校准每个新微量移液器的进样体积。

然后设置 pico 注射器，为每次注射输送所需量的 RNA。这里使用 1 纳升的注射量。用镊子夹住胚胎，或者如果愿意，放在固定平台上，然后将所需的体积注射到动物冲击波中。

将注射剂分布在整个胚胎的多个位置，以获得 RNA 的均匀分布。对于四细胞期胚胎，每个冲击波进行 1 到 2 次注射，而对于双细胞期胚胎，每个注射器进行 2 到 4 次注射。注射后，将注射的胚胎转移到含有 0.1 XMMR 的塑料培养皿中，并让它们发育到第 20 至 23 阶段。

根据所需的发育速度，将胚胎在 14 至 22 摄氏度的温度下孵育，用每毫升 10 微克层粘连蛋白的 PBS 溶液涂覆 PLL 处理的培养皿，并将板在 37 摄氏度下放置 1 小时。孵育时间过后，用 PBS 洗涤板 3 次，小心不要让层粘连蛋白包被的表面在最后一次洗涤后暴露在空气中。用培养基替换 PBS。

最后，通过在培养皿的底部涂上 0.1 XMMR 中的 1%aros 并使其硬化，准备三个 agris 涂层培养皿。硬化后，用 Steinberg 培养基填充一个培养皿，注射的 mRNA 表达的变异性可能会导致胚胎在进行解剖之前表现出荧光马赛克。筛选胚胎是否存在荧光，并识别在神经管中表达荧光融合蛋白的胚胎。

然后将第 20 至 23 阶段的荧光胚胎转移到含有 Steinberg 培养基的 agris 涂层塑料皿中。将培养皿置于解剖显微镜下，用细镊子去除卵黄膜。然后，当一个镊子将胚胎固定到位时，用第二个镊子在胚胎的侧面做一个切口，露出空心的内部。

接下来，使用两组镊子沿着胚胎背半部和腹侧两半之间的组织捏住，将胚胎切成两半并分离出包含神经管的背侧部分。将背侧 X ex解释放入含有每毫升 2 毫克、Steinberg 培养基中的胶原酶的微量离心管中，并放在旋转器上 15 至 20 分钟。然后将背侧解释转移到装满新鲜 Steinberg 培养基的农业涂层培养皿中。

在显微镜下工作时，通过将镊子的尖端滑到表皮和下面的组织之间，然后慢慢拉回表皮，从背表皮和腹侧 Noor 解剖神经管。然后用一个镊子固定组织，用另一个镊子去除神经管周围的组织。接下来，将解剖的神经管转移到装满新鲜培养基的 agros 涂层培养皿中。

收集到几根神经管后，您将钨针或镊子磨尖，将每根神经管切成大约 20 块。然后将蛋块铺在涂有层粘连蛋白的培养皿上，将茄子均匀地铺成一排。接种神经管后，不应移动培养皿，因为这会干扰细胞的附着。

在 20 至 22 摄氏度下孵育电镀的神经管 explan。在室温下铺板图像神经元和生长锥后 12 至 24 小时，XUS lavis 神经元的培养不需要细胞培养箱。请记住，RNA 的可变表达可能会导致生长锥之间出现一系列荧光水平。

这张 DIC 图像显示了从视野左上角的 X 外表长出的轴突和神经突。此图像和下图中的比例尺表示 10 微米。这部放大倍率较高的影片显示了生长轴突尖端的生长锥。

最后，该荧光显微镜电影显示了 EB one GFP 在生长锥中的表达。在这里，我们提供了成像示例，即 plus tip 融合蛋白 EB one GFP。这种神经外植体方法可以应用于任意数量的蛋白质，以阐明它们在神经突生长过程中在生长锥内的行为。